K1 – тангенс угла подъема кривой в восходящей части графика

На срезах, окрашенных по Нисслю, определяли степень стрессорного поражения нейронов [Чубинидзе А. И., 1972]. Производился подсчет нейронов коры, которые разделили на 4 группы:

- нейроны нормальные, неизмененные (НН);

- слабоизмененные нейроны (СН) с сохранением ядра, но со структурными или тинкториальными нарушениями компонентов цитоплазмы (острое набухание, гиперхроматоз, хроматолиз, центральная тинкториальная ацидофилия);

- грубо измененные нейроны (ГН) (сморщивание, «тяжелое изменение», гомогенизирующее изменение нейронов, клетки-тени);

- нейроны отсутствующие (ОН).

Степень поражения нейронов вычисляли по формуле: СП=(2ОН+2ГН+СН)x100/2(ГН+ОН+СН+НН) и выражали в процентах. Выделяли 4 степени поражения: легкая (менее 20%), средняя (20-50%), тяжелая (более 50%), распространенный некроз. Исследование проводили в 5 полях зрения на 4 срезах для каждой области ГМ (100-120 измерений на серию).

Иммуногистохимическое исследование производили с использованием следующих моноклональных мышиных антител коммерческими наборами фирмы Dako Cytomation (Дания):

- к макрофагальному антигену, окрашивающий микроглию (HAM-56);

- к кислому глиальному протеину (GFAP);

- к тирозингидроксилазе (TH)

- к глутаматному рецептору (GR-2)

- к нейрональной нитроксидсинтазе (NOS-1);

- к эндотелиальной нитроксидсинтазе (NOS-3).

Выбор двух последних антигенов был обусловлен тем, что по современными данным, именно дисбаланс нитроксидсинтаз становится ключевым стартовым механизмом повреждений в центральной нервной системе при стрессе [Han H.S.,et al., 2002; Kotake Y., et al. 2002].

Визуализацию проводили с помощью непрямого иммунопероксидазного метода с высокотемпературной и ферментной демаскировкой антигенов. Экспрессию оценивали по разделению нейронов на классы в зависимости от степени экспрессии иммунопозитивного материала по оптической плотности выделенных масок: негативные, слабопозитивные, позитивные и гиперэкспрессирующие с выражением доли каждого класса в процентах. Соотношение экспрессий определяли через их удельные яркости в сопоставимых областях ГМ на серийных срезах, обработанных на одном предметном стекле. Для достоверности полученных результатов применяли позитивные и негативные контроли антигенов, а также негативные контроли антител [Петров С.В., Райхлин Н.Т., 2004; Kelman Z., 1997; Rosa M.A., et al. 2000; Paunesku T. et al., 2001].

Для электронно-микроскопического исследования животных подвергли эвтаназии путем внутривенной инфузии 4%-ного раствора параформа на 0,1 М какодилатном буфере (суправитальной фиксации) под нембуталовым наркозом. Дофиксацию кусочков размером 1 мм³ производили в течение 12 часов в 4%-ном растворе параформа на 0,1М какодилатном буфере с последующей постфиксацией в течение 2 часов в 1% растворе тетраокиси осмия в 0,1М какодилатном буфере (pH=7,4) при температуре +4^оС [12]. После промывки в нескольких порциях раствора какодилатного буфера материал подвергали дегидратации в спиртах возрастающей концентрации и заливали в смесь эпона и аралдита. Ультратонкие срезы толщиной 50-90 нм получали на ультрамикротомах LKB- 8800 и монтировали на медные сетки. После контрастирования в 2,5% растворе уранилацетата на 50^о этаноле в течение 40 минут и 0,3 % растворе цитрата свинца в течение 20 минут срезы изучались в электронном микроскопе Tesla BS-540 при ускоряющем напряжении 60 кВ. Документирование производили с использованием фотопластинок «Для ядерных исследований». Электронные микрофотограммы изготавливали на фотографической черно-белой бумаге «Унибром 160 БП».

Сканированные ультрамикрофотографии анализировали в программе AM Lab Hesperus v3.0 beta. В качестве показателей для структурного анализа использовались такие показатели, как объемная доля митохондрий в перикарионе, отношение яркостей эухроматин/гетерохроматин, эухроматин/матрикс цитоплазмы, матрикс митохондрий/матрикс цитоплазмы и матрикс цитоплазмы/содержимое синаптосом в трехмерной системе координат RGB. Также анализировали фактор формы кариолеммы, наружной мембраны митохондрий, показатель выраженности крист митохондрий.

Вариационно-статистическую обработку результатов проводили в среде электронных таблиц MS Excel. Она была проведена общепринятыми для медико-биологических исследований методами (расчет средней арифметической величины, среднего квадратичного отклонения, ошибки репрезентативности для каждого параметра в исследуемых группах животных, сравнение средних значений по критерию Стьюдента с достоверностью различий. Затем, руководствуясь закономерностями, принятыми для медико-биологических исследований (объем выборок, характер распределения, непараметрические критерии), оценивали достоверность различий выборок. Корреляционный анализ проводился методом простых парных корреляций Спирмена [Зайцев В.М., с соавт., 2003; Петри А., Сабин К., 2003; Новиков Д.А., Новочадов В.В., 2005].

СОБСТВЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В преоптической области у животных с высокой стресс-реактивностью для POM характерно более редкое расположение относительно крупных нейронов с большим объемом окружения и количеством граничных астроглиоцитов; в PeV выявляются более мелкие, но плотнее расположенные нейроны с большим числом граничных нейронов и малым представительством микроглии, а строение POL не отличалось от такового у животных с низкой стресс-реактивностью. Полученные данные в целом свидетельствуют о неоднородности строения ядер преоптической группы переднего гипоталамуса в срезе конституциональной реактивности.

В собственно переднем гипоталамусе для крыс с высокой стресс-реактивностью были характерны относительно более крупные размеры нейронов, их ядер и нейронного окружения (более всего – для SCh). Но для SCh характерна более высокая ОД нейронов, а для SO и PV – относительно более низкая. Интересно, что в триггерном ядре стресса – паравентрикулярном - отличия между группами интактных крыс были минимально выражены. Животные с высокой стресс-реактивностью имеют в передней гипоталамической области меньшее представительство астро- и микроглии (SCh < PV < SO) и неодинаково выраженное, но относительно высокие экспрессии нитроксидсинтаз (максимальные – в SO), рис. 1.

Исследования, проведенные в медиальной и латеральной гипоталамической области у интактных животных с различной стресс-реактивностью, выявили существование целого ряда существенных отличий различий только в двух ядрах – дорсомедиальном и аркуатном, а также в латеральной гипоталамической области. Они касались как показателей размерности ядер и отдельных структур, так и сложности их организации.



Супраоптическое ядро



Супрахиазматическое ядро



Паравентрикулярное ядро
Рис. 1. Особенности строения ядер передней гипоталамической области крыс, связанные с высокой стресс-реактивностью. Обобщенные признаки, за единицу принято значение показателя в альтернативной группе животных.

Принципиальные различия в отношении дорсомедиального и вентромедиального ядра гипоталамуса (первое имеет яркие отличия, зависящие от стресс-реактивности, второе – практически отличий не имеет) может иметь ключевое значение в участии этой области гипоталамуса при развитии стресса. Также удалось показать, что нейроны аркуатного и дорсомедиального ядер гипоталамуса обладают общей особенностью у крыс с высокой стресс-реактивностью. Она заключается в более высоком представительстве катехоламинергических и глутаматцептивных нейронов, что определяет для этих ядер повышенную роль в модуляции силы и продолжительности стрессовой реакции (рис. 2).

Большая сложность организации латеральной гипоталамической области (но не серого бугра) является одним из доказательств большего значения внешних связей гипоталамуса с таламусом и фронтальными областями коры головного мозга в обеспечении высокой стресс-реактивности в сравнении с нервными связями между ядрами гипоталамуса (рис. 3).

Более сложное строение нейропиля было характерно для ретрохиазмальной и латеральной гипоталамической области животных с высокой стресс-реактивностью.


Аркуатное ядро



Латеральное гипоталамическое ядро
Рис. 3. Особенности строения ядер латеральной группы гипоталамуса крыс, связанные с высокой стресс-реактивностью. Обобщенные признаки, за единицу принято значение показателя в альтернативной группе животных.
На уровне маммилярного комплекса показана максимальная вариабельность строения SuM и PMv, для которых были характерны более плотная нейронная упаковка, относительно большие размеры нейронов и их ядер, большое количество микроглии.

Математический анализ методом определения асимметрии выборок, цензурированных по признаку реактивности, выявил многочисленные «сцепления» данных показателей строения нейронов и их окружения со стресс-реактивностью животных. Практически те же показатели выявлялись как связанные с реактивностью при корреляционном анализе.

Обобщая представления о строении ядер у интактных животных, мы предположили их реакцию при стрессе с учетом строения нейронов, их окружения, астроглиального и микроглиального представительства, картирования ряда изученных медиаторов, а для SO и SCh - ультрамикроскопического строения. Все исследованные ядра гипоталамуса были разделены на пять групп (рис. 4).

«слабые» ядра с низкой потенциальной резистентностью – POM	практические не зависящие от реактивности – POL, VM, PMd и ML		«слабые» ядра с высокой потенциальной резистентностью – PeV и SO
«сильные» ядра с низкой потенциальной резистентностью – PV и DM		«сильные» ядра с высокой потенциальной резистентностью – SCh, ARC, SuM, и PMv

Рис. 4. Распределение вариабельных ядер гипоталамуса у крыс с высокой стресс-реактивностью на основании математического анализа.

1. К «сильным» ядрам с потенциально высокой устойчивостью к стрессорному повреждению у животных с высокой стресс-реактивностью отнесены супрахиазматическое, аркуатное, супрамамиллярное и вентральная часть премамиллярного ядра.

2. «Сильными», но со сниженной потенциальной резистентностью к стрессорному повреждению для животных ВСР группы были признаны триггерные ядра стресса - паравентрикулярное и дорсомедиальное.

3. К «слабым» структурам, но с высокой резистентностью к повреждению были отнесены супраоптическое и перивентрикулярное ядро.

4. Медиальное преоптическое ядро было единственным, расцененным как «слабое» с низкой резистентностью.

5. Латеральное преоптическое ядро, вентромедиальное ядро, медиальная часть премамиллярного ядра и латеральное мамиллярное ядро – ядра, строение и резистентность которых к повреждению от стресс-реактивности практически не зависели.

Безусловно, проводя такое разделение, мы отдавали себе отчет в том, что при развитии стресса на реальные изменения в ядре будет оказывать влияние не только особенности его нейронного окружения или устройства самих нейронов, но также общая и специфическая функциональная нагруженность в реализации работы стрессорной системы.

Подобный анализ возможен только в сопоставлении изменений по отдельным ядрам применительно к их установленной функции, рецепторному аппарату, медиаторному представительству и вовлеченности в развитие стрессорных реакций.

В преоптической зоне гипоталамуса, помимо развитого нейропиля, определялись три основных ядра, из которых максимально вариабельным от стресс-реактивности оказалось POM. Эта структура связана с терморегуляцией и участвует в регуляции секреции половых гормонов, сексуального поведения, имеет выраженные различия у самцов и самок [Yoshida K. et al., 2002; Lowry C.A. et al., 2007]. Предполагается также участие этой зоны и в интеграции импульсов сердечно-сосудистой системы [Акмаев И.Г., 2003; Ахмадеев А.В., Калимуллина Л.В., 2006], реакциях гипоталамуса на хроническую эндогенную интоксикацию [Фролов В.И., 2004].

На основе нашего анализа POM интактных животных было отнесено к «слабым» ядрам с низкой резистентностью. Это определялось относительно меньшими размерами перикарионов и ядер нейронов, менее плотной их упаковкой в ядре с относительно малым количеством граничных клеток и относительно низким микроглиальным представительством. В POM животных ВСР группы определялся относительно высокий исходный уровень экспрессии нейрональной нитроксидсинтазы.

В то же время, при стрессе это ядро оказалось поврежденным в относительно малой степени (около 5,0%), причем в равной степени в группах с различной стресс-реактивностью. Аналогичные факты были выявлены и при последующем анализе строения ядра после стресса.

По-видимому, POM не относится к ядрам, в значительной степени включающимся в реализацию стресс-системы, в связи с чем его изменения в нашей модели стресса оказываются менее ожидаемых и в малой степени зависят от стресс-реактивности. Определенную роль в этом может играть и общая картина защитного торможения, описанная для стресса в отношении преоптических структур в целом [Crowder R.J., Freeman R.S., 1998; Stone E.A., et al., 2006], равно как и относительно умеренная реализации сосудистых нарушений за счет активации нитроксидсинтаз и ФНО-зависимого апоптоза нейронов [Куликов В.П. с соавт., 2005; Меньшанов П.Н. с соавт., 2007; Schuler M., Green D.R., 2001; Schultz D.R., Harrington W.J.Jr., 2003; Mattson M.P., Kroemer G., 2003 ].

Перивентрикулярное ядро гипоталамуса у животных с высокой стресс-реактивностью было нами отнесено к «слабым», но с высокой резистентностью к повреждению. Этот прогноз полностью подтвердился. Степень повреждения нейронов в PeV была чуть более 5% в ВСР группе, более 11% - в НСР группе. Изменения других показателей, в том числе незначительная активация нитроксидсинтаз, хорошо согласуются с известными из литературы сведениями об относительно малом участии PeV в стрессорной реакции, умеренной выраженности ФНО-зависимого апоптоза при стрессе [Меньшанов П.Н. с соавт., 2007; Figueiredo H.F. et al., 2003; Badowska-Szalewska E., et al., 2006]. Локальное повреждение PeV способно предотвратить стрессорное ограничение секреции тиротропного гормона и гормона роста [Лычкова А.Э., Смирнов В.М., 2002; Campbell R.E. et al., 2003].

Таким образом, мы подтвердили предположение о том, что у животных с высокой конституциональной стресс-реактивностью имеется исходно большая вероятность стрессорного повреждения POM, тогда как PeV повреждается в меньшей степени и обладает высокой резистентностью к повреждению.

В отношении этой структуры анализ выявил несколько противоречивых данных. С одной стороны, при стрессе данное ядро у крыс с высокой стресс-реактивностью повреждалось сильнее, ОД нейронов в SO у животных ВСР группы уменьшалась на 22,3%, тогда как в НСР группе – только на 14%. Изменение размеров нейронов, сложности их окружения и количества нейроглии в принципе свидетельствовали, что SO ядро является «сильным звеном» главным образом у крыс с низкой конституциональной стресс-реактивностью. В то же время существенные различия в экспрессии нитроксидсинтаз, отсутствие существенных корреляционных доказательств между степенью повреждения и другими морфометрическими показателями не позволили считать резистентность этого ядра сниженной. В итоге SO у животных с высокой стресс-реактивностью следовало отнести к группе «слабых» ядер с высокой резистентностью к повреждению.

При ультрамикроскопическом исследовании были выявлены еще несколько особенностей SO у крыс с высоким уровнем стресс-реактивности: относительно более высокий удельный объем митохондрий в перикарионах с их более функционально активной организацией.

Исходя из ключевых функций SO, результаты нашего анализа можно интерпретировать следующим образом.

1. Супраоптическое ядро способно к медленноволновой секреции кортиколиберина, является основным продуцентом вазопрессина. Продукцию окситоцина и половых стероидов следует отнести скорее к минорным функциям ядра [Patel K.P., et al., 2000; Nomura M. et al., 2003]. Наряду с прямым своим действием, вазопрессин и окситоцин через местные механизмы модулируют секрецию кортиколиберина и запуск секреции АКТГ [Sun Y. et al., 2001; Wotjak C.T. et al., 2002].

2. При стрессе в SO происходит резкое уменьшение секреции вазопрессина, и данный эффект нередко приводит к развитию сосудистого коллапса с переходом в шоковое состояние [Сивухина Е.В. с соавт., 2003; Giusti-Paiva A., et al., 2002]. Подъем синтеза и секреции кортиколиберина начинается не сразу после стресса, а через 6-12 часов, обеспечивая закрепление и определенную пролонгацию стрессовой реакции. Синтез окситоцина при стрессе в SO практически не меняется, а половых стероидов (что не столь существенно для гормонального пула в целом) – снижается [Berciano M.T. et al., 2002].

3. Следовательно, у животных с высокой стресс-реактивностью за счет существования особенностей строения SO в полной мере не обеспечивается адекватное развитие второй, более медленной волны выброса кортиколиберина и соответствующих колебаний секреции стресс-лимитирующих гормонов. Это и придает стрессу скоротечность и остроту, выдаваемую по внешним признакам за «высокую» реактивность.

Супрахиазматическое ядро было отнесено нами к сильным ядрам с потенциально высокой устойчивостью к повреждению.

Наличие в SCh интактных крыс ВСР группы относительно более высокого процента NOS-1-позитивных нейронов и малый коэффициент NOS-1/NOS-3 мы рассматриваем в качестве одной из ключевых характеристик, связанных с конституциональной стресс-реактивностью.

В нейронах SCh крыс ВСР группы также выявлено преобладание гетерохроматина, преимущественно рядом с ядерной оболочкой, отсутствие инвагинаций кариолеммы и высокая электронная плотность кариоплазмы. Для них характерно обилие органелл в цитоплазме перикариона, мономорфность митохондрий и относительно малая плотность их матрикса. В своей совокупности эти особенности также рассматривались как субстрат большей функциональной активности и лабильности SCh у животных с высокой стресс-реактивностью.

При стрессе в SCh развивались относительно малые изменения, и минимальные – у животных с высокой стресс-реактивностью. Наличие в SCh стрессированных крыс ВСР группы относительно небольшого прироста NOS-1-позитивных нейронов и умеренный коэффициент NOS-1/NOS-3 свидетельствовали о его резистентности к стрессорному повреждению. Электронно-микроскопическое исследование нейронов выявило сохранение структуры ядерного хроматина и кариолеммы, небольшое увеличение числа митохондрий без структурных особенностей в них. В перинуклеарной области части нейронов наблюдалась отчетливая вакуолизация, но мембранные органеллы были многочисленны и структурно не повреждены.

Гуморальная активность SCh многообразна - это секреция вазопрессина, окситоцина, опиатов, гонадолиберина, бомбезина [Владимиров С.В., Угрюмов М.В., 1995; Васильев Ю.Г., с соавт., 2003; Калинкин М.Н., с соавт., 2004; Chan R.K. et al., 1993; Carloni S. et al., 2004].

Сопоставление этих особенностей SCh у интактных животных и стресс-индуцированных изменений позволило с функциональным предназначением ядра позволило сделать следующее логическое построение.

1. SCh является центром циркадианных ритмов, которое воспроизводится даже на удаленных из организма плоскостных срезах-культурах гипоталамуса, содержащих данное ядро. Важным входом этого ядра является проекция глаза, после разрушения SCh у крыс теряется способ­ность настраивать эндогенный ритм на часто­ту чередования свет/темнота [Николс Дж. Г., 2003; Васильев Ю.Г., с соавт., 2003; Калинкин М.Н., с соавт., 2004; Chan R.K. et al., 1993; Carloni S. et al., 2004].

2. При стрессе и шоке с сохранением активности SCh связывают основные механизмы резистентности. Происходит учащение спонтанной импульсации нейронов SCH, не связанных с суточной активностью, секреция коритиколиберина и окситоцина при этом увеличивается, гонадолиберина и опиоидов - уменьшается [Демко П.С. с соавт., 2002; Кузнецов И.Э., 2003; Sharkey J. et al., 2000; Fonnum F., Lock E.A., 2004; Slikker W.Jr. et al., 2005].

3. Следовательно, наличие сильного относительно мало повреждаемого SCh у животных с высокой стресс-реактивностью способно модулировать триггерные эффекты стресса, тонически повышая активность многих структур ЦНС и более жестко блокируя основные гормональные оси, затормаживаемые при остром стрессе (половых гормонов, гормона роста и др.). Этим и достигается более очерченная яркая картина стрессовой реакции у животных с высокой стресс-реактивностью.

Наконец, паравентрикулярное ядро занимало в наших исследованиях особое место. Детально изученное, оно справедливо называется ключевым триггерным ядром стресса. В первую фазу стресса оно выбрасывает большие количества кортиколиберина, оказывающего дальнейшее влияние на деятельность симпатико-адреналовой системы и, соответственно, изменение коронарного кровотока, артериального давления, частоты сердечных сокращений, сосудистой проницаемости [Кузнецов И.Э., 2003; Хитров Н.К., Салтыков А.Б., 2003; Куликов В.П. с соавт., 2005; Писарев В.Б. с соавт., 2006; М.Ю.Капитонова с соавт., 2008]. Известно, что при стрессе кортиколиберин может непосредственно использоваться в ткани гипоталамуса в качестве нейротрансмиттера для модуляции высших поведенческих реакций [Shumake J. et al., 2001; Boutahricht M. et al. 2005].

У интактных животных мы не выявили существенных особенностей строения самих нейронов PV в связи со стресс-реактивностью. В то же время, на один нейрон в PV животных ВСР группы приходилось в среднем меньше граничных нейронов и астроглиоцитов, в сравнении с аналогичными показателями в НСР группе. Мы предположили, что стресс-реактивность определяется на уровне гипоталамуса не столько филогенетически закрепленным для данного вида строением PV, сколько особенностями относительно молодых в филогенетическом отношении ядер с модулирующим в отношении стрессовой реакции действием, а также сложностью организации внутригипоталамических связей (нейропиля).

В то же время, наличие в PV интактных крыс ВСР группы относительно более высокого процента NOS-1-позитивных нейронов и малый коэффициент NOS-1/NOS-3 свидетельствовали о его более высокой реактивности при развитии стресса. На основании математического анализа связей со стресс-реактивностью PV было отнесено к «сильным», но со сниженной потенциальной резистентностью к стрессу.

Действительно, при моделировании стресса у животных ВСР группы мы обнаружили большую степень поражения нейронов (25,6% против 13,8% в НСР группе). ОД нейронов в PV у животных с высокой стресс-реактивностью уменьшалась почти вдвое, а в НСР группе – только на 37%, аналогично более интенсивные изменения были определены и для размеров ядер нейронов, прироста коэффициента окружение/нейрон и микроглиальной реакции.

При сопоставлении полученных данных о строении интактного PV в связи со стресс-реактивностью и его стресс-индуцированных изменений, мы построили следующее логическое заключение.

1. Основной функцией PV является секреция окситоцина и вазопрессина крупноклеточной частью нейронов, мелкоклеточная часть ядра модулирует эти функции и секретирует кортиколиберин [Акмаев И.Г., 2001; Евсеев В.А., с соавт. 2001; Stern J.E., Zhang W., 2003]. Кроме этого, в PV происходит синтез эндорфинов, ангиотензина, соматостатина, соматолиберина и пролактолиберина [Campbell R.E. et al., 2003]. Ассоциативные нейроны PV имеют в основном пептидергическую природу и обеспечивают взаимодействие пулов основных клеток-гормонопродуцентов, и на местном уровне акцептируют результат [Сивухина Е.В. с соавт., 2003; Лискина Е.Б., 2003; Кузнецов И.Э., 2003; Kc P. et al. 2002; Figueiredo H.F. et al., 2003; Jingyi M.A. et al., 1994; Jorgensen H. et al., 2003; Nomura M. et al., 2003; Dallman M.F. et al., 2005].

2. PV непосредственно участвует в запуске стрессовых реакций. Выброс кортиколиберина и молекулярные изменения в нейронах PV показаны уже спустя несколько секунд от начала стрессорного повреждения – раньше всех других изменений секреции в ЦНС [Корнева Е.А., 2000; Суворов Н.Ф., Шуваев В.Т., 2002; Reyes T.M. et al., 2003; Campbell R.E. et al., 2003; Girotti M. et al., 2006; McCormick C.M. et al., 2007]. Нейроны PV, синтезирующие вазопрессин и соматостатин, также являются стресс-реактивными с ответом на стрессорное раздражение через 3-6 мин от его начала [Kc P. et al. 2002; Girotti M. et al., 2006; Dallman M.F. et al., 2005].

3. Соответственно, у животных с высокой стресс-реактивностью мы наблюдаем не столько повреждение, сколько истощение PV при стрессе, обеспечивающее максимально выраженный характер стрессорной активации с выбросом кортиколиберина и других модулирующих стрессорные реакции гормонов. Это, безусловно, «сильное» ядро у животных с высокой стресс-реактивностью. Его весьма высокая степень повреждения при развитии стресса преимущественно определяются функциональной нагрузкой PV и слабостью его микроглиального представительства.

Завершая описание переднего гипоталамуса в нашей работе, мы не можем не коснуться и не обсудить результатов нового метода исследования в нейроморфологии – радиальной морфометрии биологических объектов с использованием биологически актуальной системы координат.

Принцип радиальной морфометрии основан на классических концептах нейроморфологии, благодаря которым и были, собственно говоря, выделены, ядра гипоталамуса [Автандилов Г.Г., 1973; Боголепов Н.Н, 1980; Писарев В.Б., 1990; Thompson R.H., Swanson L.W., 2002]. Компьютерная морфометрия, основанная на построении осевых градиентов (трансверсального, дорсовентрального и краниокаудального) тинкториальных свойств нервной ткани является эффективным подходом к анализу конституциональных особенностей морфологии ЦНС. С помощью формализованных показателей функции распределения интенсивности при морфометрии препаратов, окрашенных классическим для нейроморфологии методом – тионином по Нисслю, нам удалось показать особенности, свойственные SO, SCh, PV у животных с различной стресс-реактивностью.

1. У животных с высокой стресс-реактивностью, структуры переднего гипоталамуса, расположенные краниально, имели меньшее соотношение нейрон/глия, а структуры, расположенные каудальнее – большее, в сравнении с НСР группой.

2. У интактных крыс с высокой стресс-реактивностью плотность расположения нейронов в SO оказывалась достоверно выше в вентральной части ядра и имела флуктуации плотности (идентифицируемые как нейронные ансамбли), тогда как у крыс НСР группы нейроны располагались более равномерно по всему объему SO. При стрессе наблюдалось выравнивание (гомогенизация) плотности, более показательное у животных с высокой стресс-реактивностью.

3. У животных ВСР группы вне стресса нейроны плотнее располагались к дорсомедиальной части SCh, в то время как у крыс с конституционально низкой реактивностью - к медиальной части, часто образуя при этом нейронные ансамбли. При стрессе у животных ВСР группы снижались медиолатеральный и дорсовентральный градиенты, тогда как у крыс с низкой стресс-реактивностью сохранялось относительно плотное и гомогенное расположение нейронных ансамблей со склонностью к концентрации в дорсомедиальном направлении от центра ядра.

4. В PV интактных животных ВСР группы нейроны располагались равномерно, тогда как у крыс с низкой стресс-реактивностью их плотность нарастала к центру ядра. При стрессе дорсовентральный градиент плотности нейронов выравнивался, появлялось четкое понижение плотности к латеральной периферии ядра, более выраженные в ВСР группе.

В настоящее время все чаще звучит мысль о том, что современная количественная морфология с введением в практику компьютерного анализа образов должна перейти от механической «оцифровки» численных показателей, описывающих структуры, к более сложным, интерпретирующим связям между элементами единой системы гистиона [Автандилов Г.Г., 2002; Писарев В.Б., с соавт., 2006; Hamano H. et al., 2002].

В переднем гипоталамусе удалось проанализировать и NO-зависимый механизм повреждения нейронов.

Окись азота участвует в механизмах повреждения нейронов при травме, острой ишемии мозга, стрессе и шоке. Любые процессы, ведущие к накоплению ионов Са²⁺ в клетке (энергетический дефицит, изменения активного ионного транспор­та, глутаматная «эксайтотоксичность», оксидантный стресс), сопровожда­ются повышением уровня NO [Марков Х.М., 2006; Yamamoto F. et al., 2007; Gingerich S., Krukoff T.L., 2006].

Возбуждение NMDA рецепторов приводит к активации NOS-1 и повы­шенному высвобождению NO. В настоящее время нет однозначного мне­ния о роли оксида азота в механизме токсического действия глутамата. Его токсическое действие связано с нарушением митохондриального окисли­тельного фосфорилирования и метаболизма рибонуклеотидредуктазы, об­разованием свободнорадикального соединения пероксинитрит-аниона, ко­торое блокирует ряд нейрональных рецепторов, инактивирует фермент супероксиддисмутазу и вызывает углубление свободнорадикального окисле­ния, приводящего к гибели клетки. Кроме того, пероксинитрит способен тормозить тирозинкиназу, входящую в активный центр нейротрофических факторов, увеличивая степень недостаточности трофического обеспечения мозга [Лискина Е.Б., 2003; Zanchi A. et al., 1995; Brenman J.E., Bredt D.S., 1996; Eliasson M.J. et al., 1999; Han H.S. et al., 2002; Meini A. et al., 2006].

В то же время, имеются сведения о том, что NO, активируя растворимую гуанилатциклазу, повышает синтез циклического гуанозинмонофосфата и может за­щищать нейроны при токсическом воздействии глутамата. Формирование нитрозониума-иона NO⁺, связывающего регуляторный центр NMDA рецепторов, уменьшает их возбудимость и снижает чувствительность к повреждению [Недоспасов А.А., 1998; Тотолян А.А., 2003; Малышев И.Ю., с соавт., 2004; Pringle A.K. et al. 1999; Golde S. et al., 2002; Yamamoto F. et al., 2007].

Таким образом, проявляется двойственная природа окиси азота, при­сущая многим природным модуляторам.

Результаты наших экспериментов свидетельствуют о неодинаковой экспрессии нитроксидсинтазы в переднем гипоталамусе.

У интактных крыс ВСР группы относительно высокий процент иммунопозитивных нейронов выявлялся в медиальном преоптическом, паравентиркулярном и супраоптическом ядрах, несколько меньше была экспрессия в POl, PeV и SCh. Экспрессия NOS-3 была относительно невелика, в сравнении с НСР группой. Наличие относительно высокого процента NOS-1-позитивных нейронов и малый коэффициент NOS-1/NOS-3, свидетельствующий о более высоком представительстве эндотелиальной нитроксидсинтазы, мы отнесли к предикторам более высокой стресс-реактивности. По-видимому, исходно низкое представительство эндотелиальной изоформы NOS имеет прямое отношение к последующей динамике стрессорного повреждения нейронов в этом участке ГМ и может быть использовано при разработке новых подходов к нейропротекции.

Действительно, при стрессе мы увидели различия в экспрессии нитроксидсинтаз по отдельным ядрам.

1. В SO и PV крыс ВСР группы при стрессе наблюдался относительно больший прирост NOS-1-позитивных нейронов и малый коэффициент NOS-1/NOS-3, что отражало более высоком участие эндотелиальной нитроксидсинтазы в развитии стрессорного повреждения нейронов.

2. В SCh стрессированных крыс ВСР группы наблюдался относительно меньший прироста NOS-1 и умеренный коэффициент NOS-1/NOS-3, что соответствовало меньшему повреждению нейронов.

В то же время, интенсивность повреждения нейронов при стрессе, зависящая от стресс-реактивности животных, в преоптической группе ядер, по-видимому, в малой степени была связана с местными механизмами взаимодействия двух изоформ нитроксидсинтаз.