Функционирование системы энергообеспечения сперматозоидов

Абсолютный показатель живучести сперматозоидов зависит от функционирования системы энергообеспечения - дыхания и фосфорилирования. T. Mann и E. Leone [59] установили, что при холодовом шоке наблюдается понижение скорости расщепления фруктозы, уменьшение поглощения кислорода и падение концентрации АТФ, синтез которого при этом резко снижается.

Снижение потребления кислорода сперматозоидами лабораторных животных (хомяк, крыса, морская свинка, кролик) после холодового шока наблюдали и другие авторы [60]. И.Иванов [61] также указывает на понижение потребления кислорода заморожено - оттаянной спермой. Хранение замороженного семени при -196 С в течение 12 месяцев не вызывало дальнейшего снижения дыхания. М.И.Лопатко [62] отмечает, что уменьшение количества поглощаемого кислорода сперматозоидами при холодовом шоке связано с понижением числа активных клеток. Сперматозоиды, не утратившие активности после холодового шока, поглощают такое же количество кислорода, как и до воздействия холодовых температур.

Исследования Е.М.Платова [7] показали, что снижение уровня АТФ в сперматозоидах быков и баранов при их охлаждении до +5-0 С не связано с нарушением механизмов синтеза АТФ, так как после нагревания охлажденной спермы до +18 и +37 С содержание АТФ-АДФ восстанавливается соответственно количеству подвижных клеток. Замораживание сперматозоидов быков и баранов в среде с желтком и глицерином не влияет на дыхание подвижных сперматозоидов быка первые десять минут и барана - 20 минут. В последующем наблюдается снижение дыхания и содержания АТФ, причиной чего являются криогенные повреждения митохондриальных мембран и разобщение фосфорилирования и дыхания.

Важным фактором, усиливающим проявление повреждающего действия охлаждения и замораживания-оттаивания на мембранные структуры сперматозоидов является развитие в них процессов перекисного окисления липидов. В частности А.И. Журавлев [63], Ю.А. Владимиров, А.И. Арчаков [64] и В.Д. Тарусов [65] отмечают, что в норме свободнорадикальное окисление протекает во всех тканях живых организмов и при низкой интенсивности является одним из типов нормальных обменных процессов. В то же время при действии на клетки ряда повреждающих факторов, в том числе и низких температур, процессы перекисного окисления резко усиливаются, что приводит к нарушению функционирования мембранных структур сперматозоидов.

Первые сообщение об образовании токсических продуктов в сперме в результате развития процессов перекисного окисления липидов описано для спермы баранов охлажденной до +5С L.A. Jonеs и Т. Mann [66] которое затем было подтверждено в других работах А.М. Гуськова [67] и В.А. Наук [45] при охлаждении и замораживании-оттаивании спермы быков, хряков и баранов.

Таким образом, при охлаждении и замораживании сперматозоидов возникает ряд ответных реакций физического, физико-химического и биохимического характера, которые приводят к повреждению мембранных структур сперматозоидов и нарушению их основных биологических функций - подвижности и оплодотворяющей способности гамет.
1.1.4 Поиски основных компонентов защитных сред для спермы животных

Сохранность структур и выживаемость сперматозоидов при охлаждении и замораживании-оттаивании существенно зависит от эффективности защитных свойств среды.

Установлены, что основными компонентами среды являются электролиты и неэлектролиты, которые обеспечивают адекватный сперме ионный состав, осмотическое давление и буферную емкость. Это удовлетворяет при разбавлении спермы и хранении ее при комнатной температуре (16...22 С), когда транспорт ионов и неэлектролитных компонентов в системе клетка-среда находится на одном стационарном уровне. Охлаждение, температурный шок, замораживание клеток блокирует активный транспорт ионов и меняет характер и скорость пассивного транспорта в зависимости от соотношения ионов и молекул других компонентов среды. В частности наблюдается выход из сперматозоидов ионов К⁺ , Мg²⁺ , а ионы Na⁺ , Ca²⁺ , Zn²⁺ , наоборот накапливаются в избыточном количестве ([34]; [35]; [36]). Такое перераспределение ионов отрицательно сказывается на выживаемости и переживаемости сперматозоидов после замораживания-оттаивания, так как требует большого количества энергии на восстановление необходимого уровня распределения ионов в системе клетка-среда для хранения.

По данным И.Ш. Шапиева [68] введение в состав среды ионов калия (К⁺) препятствует диффузионному выходу ионов калия из клеток при субнулевых температурах и повышает переживаемость сперматозоидов хряка после замораживания-оттаивания. В.А. Наук [45] отмечает положительное влияние на устойчивость связей белково-липидных комплексов оказывает при охлаждении и замораживании спермы оказывает и введение ионов Mg²⁺ и Сa²⁺ или использование в составе среды хелатных комплексонатов Са²⁺ и Mg²⁺ ([69]; [13]), которые способствуют регуляции содержания двухвалентных катионов в системе клетка-среда для хранения.

Важное значение при охлаждении и хранении спермы, при субнулевых температурах имеет наличие в составе среды компонентов, обеспечивающих защиту сперматозоидов от температурного шока. H.A.Lardy и P.H.Phillips [70] обнаружили, что чувствительность сперматозоидов к температурному шоку, значительно снижается, при добавлении в среду яичного желтка. С этих пор желток куриного яйца стал обязательным компонентом в составе сред для криоконсервации спермы млекопитающих. Механизм защитного действия желтка окончательно не выявлен. Наиболее распространенной версией защитного действия считается встраивание ненасыщенных липидных фракций желтка в мембранные структуры сперматозоидов. В результате чего точка затвердевания (фазового перехода) мембран сдвигается в зону более отрицательных температур.

По данным В.П. Кононова [13] устойчивость мембран к повреждающему действию низких температур зависит от надмолекулярной структуры мембранных липидов: она повышается со снижением параметра упорядоченности липидов. Защитное действие желтка объясняется тем, что его компоненты, при обработке сперматозоидов, параллельно снижению температуры фазового перехода снижают параметр упорядоченности липидов.

Видовые различия сперматозоидов хряков и быков в устойчивости при замораживании, по представлению автора, связаны с тем, что степень разупорядочивания липидов мембран сперматозоидов быка выше, чем у сперматозоидов хряка. Косвенным подтверждением данной концепции является повышение криоустойчивости сперматозоидов при введении в среду холестерина [43]. Л.Д. Бергельсон [71] установил, что холестерин оказывает уплотняющее действие на бислойную мембрану, если она находится в жидком состоянии, т.е. углеводородные цепи в ней малоупорядочены. Если же состояние цепей гелеобразное, эффект холестерина противоположен: он снижает температуру фазового перехода бислоя. Предполагают, что благодаря такому двоякому эффекту холестерин может выполнять функцию биологического регулятора, обеспечивающего надлежащее состояние липидной части мембраны, необходимое для ее нормального функционирования клетки.
1.1.5 Теоретические основы механизма защиты сперматозоидов куриного желтка

Защитные свойства желтка первоначально приписывались содержащемуся в нем фосфатидилхолину (лецитину) [72]. Так, при введении в среду фосфатидилхолина, фосфатидилэтаноламина и фосфатидилинозитола, наибольший защитный эффект оказывал фосфатидилхолин. На устойчивость плазматических мембран при действии низких температур влияет устойчивость липидных фаз фосфатидилхолина - охлаждение фосфатидилхолина ниже температуры фазового перехода приводит к образованию стабильного геля, в то время как фосфатидилэтаноламин превращается в кристаллический коагель. Еще более выраженные защитные свойства от холодового воздействия, чем у фосфатидилхолина, оказались у другого фосфолипида - фосфотадилсерина, особенно в сочетании с холестерином [73].

Последующие исследования показали, что защитные свойства желтка, при температурном шоке, обусловлены не столько фосфолипидной, сколько липопротеидной фракцией желтка. Причем наиболее эффективными криозащитными свойствами обладают липопротеиды высокой плотности -липопротеиды, отличающиеся высоким содержанием белка и низким - холестерина [73]. Эти данные согласовываются с результатами исследований Н. Masuda, J. Nishikawa [74] и J.A. Foulkes [75]). При этом на семени козлов более эффективными оказались не  -липопротеиды, а  -липопротеиды.

Иммунохимическое исследование взаимодействия липопротеинов яичного желтка со сперматозоидами быка показало, что липопротеиды III-фракции прочно прикрепляются к сперматозоидам, образуя необратимое соединение с оболочкой сперматозоидов, которое не нарушается механическим путем или длительным промыванием спермиев.

Ф.И.Осташко [36] и Г.Kichev [76] защитные свойства желтка объясняют тем, что содержащиеся в желтке фосфолипиды и липопротеины имеют химическое сродство с липопротеидными мембранами, благодаря чему они наслаиваются на их поверхности и образуют гидрофобную фазу, в которой не растворяются осмотические активные вещества. И поэтому осмотический и диффузионный обмен между клеткой и окружающей средой сильно замедляются. Кроме того, при наслоении фосфолипидов значительно увеличивается толщина наружной оболочки, что увеличивает время проникновения осмотических активных веществ через оболочку сперматозоидов.

В подтверждение своей гипотезы авторы ссылаются на результаты опытов, где показано, что после контакта с компонентами желтка сперматозоиды и эритроциты теряли способность вступать в реакции связывания с комплементами. В качестве аргумента в пользу данной гипотезы защитного действия желтка свидетельствуют и результаты опытов L.Robertson и P.F. Watson [77]. При медленном охлаждении спермы баранов (0,25 град/мин) до +5 С в среде с экзогенным Са²⁺, наблюдалось шестикратное увеличение ионов Са²⁺ к концу периода охлаждения. В результате чего резко снижалось число подвижных сперматозоидов с 84,2% до 3,3%. При добавлении в среду желтка накопление Са²⁺ внутри сперматозоидов уменьшалось пропорционально уровню добавки куриного желтка.

В пользу предположения Ф.И.Осташко [36] о механизме защитного действия желтка говорят также данные об использовании в составе сред для замораживания спермы хряков детергента S-амино-Na-лаурилсульфата (ОЕР). Использование ОЕР в сочетании с желтком в среде для замораживания спермы хряков значительно повышало эффективность криозащитных свойств желтка, в то время как применение одного ОЕР, наоборот, приводило к снижению выживаемости сперматозоидов. По-видимому, ОЕР при отсутствии желтка приводит к образованию дефектов во внешней мембране сперматозоидов хряка, которые при охлаждении и замораживании-оттаивании спермы усиливаются и разрастаются. В то время как ОЕР в сочетании с желтком образует на поверхности оболочки сперматозоидов тонкую пленку, которая прочно связывается со сперматозоидами образуя как бы дополнительную “реконструированную мембрану" гамет.

Аналитического взгляда в трактовке защитного действия сочетания желтка с ОЕР придерживается и В.П. Кононов [13] с сотрудниками.

Установлены, что кроме фракций фосфолипидов и липопротеидов в желтке куриных яиц содержатся также нейтральные жиры. При исследовании влияния нейтральных жиров на выживаемость сперматозоидов козла после температурного шока по сравнению с очищенным фосфатидилхолином (летицином) желтка и липопротеидами коэффициент криозащиты составил: 83,3% - для нейтральных жиров, 38,4% - для фосфатидилхолина и 62,5% -для - и 78,1 для - липидов. Коэффициент защиты нейтральными жирами для сперматозоидов быка составил - 90,7%. Подтверждением эффективности действия нейтральных жиров при защите сперматозоидов хряка от повреждающего действия холода служат исследования А.М. Гуськова [67], в которых показано, что водная эмульсия подсолнечного масла в соотношении 1:1 не уступает по криозащитным свойствам желтку и липидам желтка.

Наиболее эффективно защитные свойства желтка проявляются при температурах до начала кристаллизации. При замораживании защитные свойства не проявляются или проявляются очень слабо.

В настоящее время известно, что способностью защищать клетки при замораживании обладают растворы сахаров. B.J. Luyet и E.L. Hodapp [3] показали, что применение 40-50%-ного раствора сахарозы обеспечивает сохранению около 20% сперматозоидов лягушки после замораживания при температуре жидкого воздуха, а при добавлении фруктозы выживало до 30% сперматозоидов петуха, подвергшихся замораживанию при температуре -79 С.

Сравнительное исследование Х.Х. Хабибулина [78], Н.Nagase и Т. Niwa [79] криозащитных свойств различных сахаров выявило, что дисахара - сахароза и лактоза обладают большими криозащитными свойствами, чем моносахариды. В исследованиях S.Salamon et al. [80] не было выявлено преимущества сахарозы, арабинозы, ксилозы, маннозы и раффинозы перед глюкозой и было обнаружено явное преимущество фруктозы по сравнению с глюкозой и лактозой. Но однозначно, что более эффективно криозащитные свойства сахаров по В.П.Кононов и др. [81] проявляются при использовании их в сочетании. По мнению Е.М. Платова [7] защитное действие сахаров связано с их способностью структурировать молекулы внутри и внеклеточной воды, а также изменять температуру кристаллизации.

Крупным поворотом в развитии криобиологии явилось “вторичное открытие” английскими ученым C. К. Polge [82] защитного действия глицерина при замораживании биологических объектов.

Хотя защитное действие глицерина было открыто сравнительно давно русскими учеными Ю. Максимовым [83] и А.М. Белоус и др. [84], заслуга английских ученых, которым часто приписывается приоритет данного открытия, заключается в том, что оно было изучено на многих тканях и органах млекопитающих при самых разнообразных температурах. Эти работы положили начало широкому использованию глицерина в качестве защитного вещества при криоконсервации клеток..

После первых удачных результатов полученных при криоконсервации спермы петухов под руководством А.Д.Курбатова [85] в среде содержащей глицерин были заморожены и сперматозоиды млекопитающих, в том числе и сельскохозяйственных животных: быков, баранов, хряков, жеребцов и др. К настоящему времени уже известно более 100 химических соединений обладающих криопротекторными свойствами, но при замораживании спермы сельскохозяйственных животных, ни одно из проверенных веществ не оказалось лучше глицерина. В частности были испытаны: полиэтиленоксиды с различной молекулярной массой, диметилсульфоксид (ДМСО), NN-диметилацетамид (ДМА), этиленгликоль, эритротол, поливинилпирролидон, диметилформамид и ряд других веществ.

Несмотря на высокие криозащитные свойства, глицерин при концентрации в среде 5 и более % оказывает отрицательное действие на оплодотворяющую способность сперматозоидов хряка [82] еще до замораживания.

Установлено, что степень негативного влияния глицерина на сперму хряка зависит от его концентрации, времени и температуры экспозиции и связана, главным образом, с изменением осмотического давления при охлаждении. В исследованиях I. Wilmut и С. Polge [86] при инкубации спермы в среде с 10% глицерина при температуре 20 С в течение 0,5 и 6 часов оплодотворяющая способность ее составляла 73 и 36%, а при инкубации спермы в течение 6 часов в этой же среде при температуре +5С оплодотворяющая способность составила 71%. Аналогичные результаты были получены и Г.Гайворонским [87]. Он считает, что при медленном насыщении разбавленной спермы глицерином чувствительность сперматозоидов к нему значительно снижается. Эти данные указывают на необходимость дальнейших исследований в направлении совершенствования технологических приемов замораживания спермы и поиска новых криозащитных веществ или их сочетаний качественно превосходящих глицерин. Перспективным направлением в создании новых криопротекторов является оксиэтилирование соединений спиртового ряда.

Одним из возможных путей подхода к практическому решению проблемы криоконсервации клеток, в частности сперматозоидов хряков, является изыскание способов увеличения устойчивости сперматозоидов к повреждающему действию низких температур.

Исследования ряда авторов школы И.Соколовской [88] показана возможность неспецифического повышения устойчивости клеток воздействием раздражителей самой разной природы в подпороговых дозах. Одним из проявления такого неспецифического повышения устойчивости клеток является увеличение времени их переживания (УВП). М.Б.Киро [89] показала, что увеличение времени переживания изолированных мышечных тканей можно получить воздействием подпороговых концентраций самых разных химических агентов (соли, наркотики, сахара, ферментативные яды). При этом комбинация двух повреждающих агентов, из которых один взят в слабой (подпороговой) дозе, приводит не к суммированию их вредного действия, а к ослаблению. В этом плане особый интерес представляют данные Л.Г.Мороз [90] по влиянию химических агентов на сперматозоиды хряка.

Л.Г.Мороз [90] изучала влияние различных химических агентов (наркотиков, мочевины, ингибиторов обмена и др.) на переживаемость сперматозоидов хряка и отметила увеличение времени переживания при +5 С под влиянием большинства из испытанных агентов. Наибольшее увеличение переживаемости получено под воздействием 0,04% хлоралгидрата и мочевины в концентрации 0,3-0,75% и 0,04% хлоралгидрата.

Хорошо защищает мочевина и от последствий искусственного охлаждения организма животных до 20...10С. Введение крысам 100 мг мочевины на 100 г массы перед охлаждением животных снижало их смертность после понижения температуры тела до 10 С на 20%.

Мочевина в низких концентрациях обладает способностью увеличивать устойчивость клеток во всех состояниях, для которых характерно увеличение перекисного окисления, изменение свойств и функций биомембран и усилении протеолиза при гипотермии, ожоговом шоке и др.

Однако, в исследованиях Я.П. Векслера и Н.Г. Атабеговой [91] действие мочевины в высоких и низких концентрациях на перекисное окисление липидов носит противоположный характер. Добавление мочевины к гомогенатам мозга и печени в концентрации от 510^-3 М до 0,5 М вызывает нарастающее снижение накопления молонового диальдегида в гомогенатах. Дальнейшее увеличение мочевины, до денатурирующих концентраций, вызывает нарастание продуктов перекисного окисления липидов.

Наряду с веществами вызывающими, в субтоксических концентрациях, повышение неспецифической устойчивости клеток, были выявлены вещества, обладающие способностью вызывать неспецифическое повышение резистентности клеток в концентрациях на несколько порядков ниже их субтоксических концентраций. К числу таких веществ относятся некоторые производные бензимидазола [92], препараты женшеня и элеутерококка колючего [93], которые Н.В.Лазаревым [92] названы адаптогенами.

Н.В.Лазаревым установлено, что под влиянием бензимидазола и его производных возрастает устойчивость клеток животных к повреждению, в частности возрастает устойчивость портняжной мышцы лягушки к повреждающему действию температуры . При этом бензимидазол не влияет на включение меченого лейцина в портняжную мышцу при комнатной температуре - усиливает включение данной аминокислоты в период, когда мышца подвергалась температурному повреждению. Дибазол препятствует снижению холестерина в надпочечниках кроликов при шоке вызванном и гипо - и гипероксией - если при шоке содержание холестерина снижается в два и более раза чем в контроле, то после предварительного введения дибазола - на 20%.

В частности производное бензимидазола 2-бензил-бензимидазол (дибазол) в концентрации 10^-11 г/мл повышал абсолютный показатель живучести сперматозоидов быка, при хранении их при температуре 0С. В то же время при физиологической температуре +38 С и данной концентрации дибазола 10^-11 г/мл переживаемость сперматозоидов в опыте не отличалась от переживаемости в контроле. Хотя в подпороговой концентрации 10^-3 г/мл дибазол увеличивал время переживания сперматозоидов. Достоверное увеличение времени переживания сперматозоидов хряка наблюдалось и при их хранении в среде с 0,05% дибазола при температуре +5С [93]. Следовательно, дибазол обладает способностью повышать устойчивость клеток к воздействию повреждающих факторов, в данном случае низких температур. Показано, что дибазол может участвовать в повышении терморезистентности функции мышечных клеток путем повышения структурной устойчивости миофибриллярных белков. При этом установлено, что дибазол уменьшает окисление свободных сульфгидрильных групп. SH-группы входят в активные центры многих ферментов и коферментов и играют важную роль в метаболических процессах клеток. Образование дисульфидных связей (-S-S-) в результате окисления SH-групп или реакции дитиол-дисульфидного обмена -2SH = -S-S - является одной из причин гибели сперматозоидов при их хранении in vitro [34]) или при замораживании, когда происходит необратимая потеря функциональной активности клеток в результате денутарационных изменений белков.

Липидные перекисные соединения - это продукты свободнорадикального окисления (СРО), образующиеся в клеточных структурах при окислении ненасыщенных жирных кислот. Как известно, свободнорадикальное окисление протекает во всех тканях живых организмов [63]. Поскольку "свободнорадикальное окисление непрерывно протекает в норме во всех тканях живых организмов, и свободнорадикальные процессы при их низкой интенсивности являются одним из типов нормальных метаболических процессов" низкие концентрации гидроперикисей необходимы для метаболизма, а ускорение СРО приводит к патологии .

Внимание к вопросу свободнорадикального окисления и биологической значимости перекисного окисления липидов мембран не случайно. Установлено, что накопление продуктов перекисного окисления липидов в мембранах меняет структуру мембран, их проницаемость, устойчивость липид-белковых комплексов и в результате происходит нарушение функциональной деятельности мембранных структур клетки [35].

Имеется ряд причин вызывающих активизацию СРО, накопление в клетках и тканях живых организмов продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) и снижение антирадикальной активности липидов. Одной из этих причин по мнению А.И. Джафарова и О.Р. Кольска [94] является холодовое воздействие на клетки и их замораживание-оттаивание Так, в работах С.В. Ерохина и др. [54]). При охлаждении и замораживании спермы баранов, быков и хряков наблюдается накопление токсических продуктов в результате ПОЛ [34] и изменение активности антиоксидантных ферментов.
1.1.8 Теоретические основы использование антиоксидантов для криозащиты сперматозоидов

А.Г.Нарижный [95] проводя экзогенное воздействие на сперматозоиды продуктами перекисного окисления липидов путем их внесения в инкубационную среду, наблюдал повреждения сперматозоидов аналогичные изменениям после температурного шока. В результате таких изменений происходит нарушение белково-липидных комплексов мембран и гомеостаза клеток. Известно, что кроме тиоловых соединений содержащих свободные SH-группы антиоксидантными свойствами обладают производные фенола. Так, введение в состав среды для криоконсервации сперматозоидов: креозола, бутилокситолуола, бутилоксианизола позволило уменьшить интенсивность ПОЛ и соответственно, повысить устойчивость сперматозоидов к температурному шоку и замораживанию-оттаиванию. Как показали результаты исследований И.Н. Шайдуллина [96], введение в состав среды антиоксидантов, приводит к достоверному снижению количества акросомных повреждений сперматозоидов после замораживания-оттаивания и повышает их выживаемость и переживаемость. При этом введении в инкубационную среду сочетания антиоксидантов оказывается более эффективным для сперматозоидов, чем введение одного антиоксиданта.

Окислительные процессы в липидах мембран и их интенсивность поддерживается различными системами клетки на определенном уровне. Действие системы природных антиоксидантов тесно связано с другими системами, регулирующими скорость перекисного окисления липидов.

Установлено, что при направленном повышении количества природных антиоксидантов в липидах мембран изменяется их фосфолипидный состав, при этом наблюдается увеличение скорости перикисного окисления липидов. С.А. Аристархова и др., [97] установили, что повышение антиокислительной активности липидов за счет накопления в них синтетических антиоксидантов также приводит к увеличению окисляемости липидов. Следовательно, увеличение окисляемости липидов в ответ на повышение антиокислительной активности липидов является неспецифической реакцией. Антиоксиданты, попадая в липиды, тормозят их окисление и поэтому в липидах накапливаются те фракции, которые окисляются в первую очередь.

Среди синтетических антиоксидантов типа фенолов и аминов наиболее близки к природным антиоксидантам производные гидрохинонов, вторичных аминов и диаминов, 3-оксипиридинов. Введение таких биологически активных веществ приводит к устойчивому повышению антиокислительной активности липидов, которое вызвано не только поступлением в липиды синтетических антиоксидантов, но и накоплением в них природных антиоксидантов. Такие синтетические антиоксиданты перспективны для эффективной защиты сперматозоидов при их охлаждении и замораживании от развития в них процессов перекисного окисления и, соответственно, повреждения их мембранных структур.

Ю.Лелекова и Ф.Романовский и др., [98] отмечают, что в последние годы повысился интерес к исследованиям по изучению влияния малых и сверхмалых количеств биологически активных веществ на неспецифическую резистентность клеток, тканей и организмов.

В литературных источниках отсутствуют работы посвященные поиску способов неспецифического повышения (в сочетании со специфическими) устойчивости сперматозоидов к повреждающему действию низких температур при их криоконсервации. Целенаправленные исследования в этом направлении могут стать одним из возможных путей в разработке и совершенствовании криоконсервации спермы животных.

Во второй половине ХХ века проведены ряд успешных экспериментов по криоконсервации спермы хряков. Среди них наиболее полными являеются исследовании В.К.Милованов и др. [72], В.П.Кононов [13], И.Ш. Шапиев и др., [99], Н.В.Корбан и др., [100], Т.П.Ильинская [10], С. Polge et. al., [82] и многие другие сообщают о проведении успешных экспериментов по криоконсервации спермы сельскохозяйственных животных, в том числе и хряков.

К настоящему времени имеется целый ряд работ об успешных результатах по криоконсервации спермы хряков, Разработано и предложено для практического использования несколько методов криоконсервации спермы хряков, которые позволяют получать в среднем около 60% опоросов от свиноматок осемененных замороженно-оттаянной спермой. Эти методы различаются между собой составами сред для замораживания и оттаивания, способом замораживания, технологией обработки спермы

В.П.Кононов с соавторами [101], Л. Г. Мороз и И.Ш.Шапиевым [102]) предложены новый метод обработки спермы хряков пред замораживанием. Этот метод основаны на диализе цельной спермы, вместо разбавления спермы криопротекторами. На этой основе предложены два варианта криоконсервации спермы, отличающиеся высокой результативностью.

Технология криоконсервация спермы это процесс, состоящий из последовательных этапов, из которых можно выделить три, общие для всех методов:

1. Получение спермы и ее разбавление.

2. Охлаждение спермы и ее подготовка к замораживанию.

3. Замораживание спермы при низких температурах.

Соответственно и успех результатов криоконсервации зависит от того, насколько удачно и правильно подобраны состав среды и точно выполняются эти этапы.