Мусабеков айдос туменбаевич

Действие цистеина на SН–групп спермы сходно с действием восстанавленного глутатиона. Цистеин широко используется для снятия торможения, вызванного различными тиоловыми ингибиторами.

Из таблицы 5 видно, что низкие концентрации (6,7·10^-6-1,7·10^-5 М) цистеина стаблизируют подвижность и увеличивают абсолютный показатель живучести половых клеток на 15-21 %, а высокие концентрации (6,7·10^-3-1,7·10^-2 М) снижают эти показатели параллельно с повышением концентрации реагента.

Низкие концентрации (6,7·10^-6-6,7·10^-5 М) цистеина в первые часы инкубации спермы, несколько повышает активность дегидрогеназ, а в дальнейшем значительно ингибируют ее (6 таблица).

Увеличение концентрации цистеина в сперме повышает активность дегидрогеназ на протяжени всего срока инкубации. Четыре наиболее высокие концентрации цистеина дают практически одинаковую активность дегидрогеназ спермы хряков. Это свидетельствует о том, что уже 3,3·10^-2 М концентрация цистеина достаточно для максимальной активации дегидрогеназ спермы хряков.

Таблица 6- Влияние цистеина на дегидрогеназную активность спермы хряков

Опыты, проведенные на отмытых сперматозоидах (таблицы 7 и 8) показали, что 6,7·10^-4 М концентрация цистеине, почти не влияющая на переживаемость сперматозоидов в цельной сперме, увеличивает пере-живаемость сперматозоидов, лишенных окружения плазмы на 8,1%; 6,7·10^-3 М концентрация, снижающая переживаемость сперматозоидов в цельной сперме на 76,40 уменьшает переживаемость отмытых.

Высокие концентрации цистеина увеличивают активность дегидрогеназ цельной спермы примерно в 11 раз (таблица 6), а отмытых сперматозоидов только – в 5 раз (таблица 7).

Поскольку активность дегидрогеназ резко повышается при добавлении цистеина, мы изучили влияние цистеина на активность дегидрогеназ в плазме спермы. При этом было обнаружено, что после добавления к плазме спермы цистеина в высокой концентрации реакционная смесь окрашивается через 15,7 минут, хотя применяемый нами метод в обычных условиях вообще не выявляет дегидрогеназной активности плазмы спермы хряков

Высокие концентрации цистеина увеличивают активность дегидрогеназ цельной спермы примерно в 11 раз (таблица 6), а отмытых сперматозоидов только – в 5 раз (таблица 8).
Таблица 7- Влияние цистеина на подвижность и переживаемость отмытых сперматозоидов хряков

В контрольном опыте было устоновлено, что инкубация тетразолия с цистеином в течение 3 часов не приводит к появлению окраски.

Следовательно, резкое увеличение активности дегидрогеназ в сперме под влиянием цистеина происходит, по – видимому, в основном за счет активации дегидрогеназ плазмы спермы.

В следующем серии опытов было изучено влияние цистеина на содержание

SН–групп в половых клетках хряков. Найдено, что цистеин вызывает некоторое увеличение числа титруемых SН – групп в сперматозоидах. В то время как в контроле через 3, 9, и 24 часа инкубации было найдено – 10,5, 10,7 и 11,2 мкМ сульфгидрильных групп на 10 млрд. А сперматозоидах со цистеином найдено 10,6, 18,8 и 17,6 мкМ SН – групп соответственно. Это дает предполагать, что цистеин обладает способностью проникать через оболочку половых клеток хряков.

β-меркаптоэтанол аналогично предыдущим реагентам в низких концентрациях увеличивают абсолютный показатель живучести половых клеток и их дегидрогеназную активность.

Лучшие результаты действия дитиотреитола на сперму хряков получены в концентрациях 6,7· 10^-5 -6,7· 10^-4. При добавлении к сперме эти концентрации абсолютный показатель живучести сперматозоидов повышаются на 86,7 – 92,8% ( в отдельных образцах спермы до 2 раза).

По-видимому дитиотреитол способствует сохранности сульфгидрильных групп сперматозоидов, предохраняют их липиды от свободнорадикального окисления, стабилизирует окислительные ферменты и механизмы синтеза АТФ половых клеток хряков.

Унитиол (2,3-димеркаптопропан-сульфонат натрия), (СН₂ (SН) СН(SН) СН₂SО₃Nа · Н₂О) - соединение широко употребляется в медицине в качестве антидота при отравлениях тяжелыми металлами человека. Лечение унитиолом основано на его способности вступать в реакцию с тяжелыми металлами с образованием малотоксичных стабильных комплексов. По данным А.И. Черкес свободные SН-группы унитиола прочно связываются с ионами тяжелых металлов, освобождая SН-группы белков, в результате чего функциональная активность последних восстанавливается.

Полученные результаты действие унитиола на подвижность, абсолютный показатель живучести и дегирогеназную активность цельную сперму хряков приведены в таблице 11.

Из данной таблицы 11 видно, что в широком диапазоне концентра­ций (от 6,7 · 10-⁶ до 6,7 · 10^-3 М) унитиол значительно увеличивает абсолютный показатель живучести сперматозоидов хряков.

Нами обнаружено, что максимальное увеличение абсолютного показателя живучести сперматозоидов хряков получено при добавлении унитиола в концентрации 6,7 · 10-⁴ М. В этом слу­чае переживаемость сперматозоидов увеличилась на 172,9% по сравнению с контролем. Такое увеличение может иметь практическое значение при разработке технологии кратковременного и долговременного хранении спермы производителей.

В соответствии с инструкцией по искусственному осемене­нию свиней для осеменения допускается сперма, содержащая не менее 60% поступательно-подвижных сперматозоидов. При добавлении к сперме оптимальной концентрации (6,7 · 10-⁴ М) унитиола 60% сперматозоидов сохраняют поступательное движение более 18,5 часов, тогда как в контро­ле - только до 5 часов хранении. Таким образом, время, в течение которого неразбавленная сперма хряков сохраняет пригод­ность для осеменения, увеличивается в 3,48 раза.
Таблица 11- Влияние унитиола на абсолютный показатель живучести (АПЖ) и дегидрогеназную активность сперматозоидов при температуре +2⁰С

Активность дегидрогеназ под действием унитиола повышается (таблица 11), за исключением концентрации 6,7 · 10-⁶ М. Специальный опыт показал, что унитиол в концентрации 1,3 · 10- ² М и выше вступает в реакцию с хлоридом тетразолия и вызывает появление окраски в отсутствии дегидрогеназ. Влияние тиоловых соединений на абсолютный показатель живучести сперматозоидов хряков представлены на рис. 1.

Следовательно, увеличение активности дегидрогеназ в присутствии высоких концентраций унитиола трудно оце­нить количественно и полученные результаты могут быть не достоверными.
3.1.3 Исследование изменение окислительного фосфорилирования в сперматозоидах под действием тиоловых соединений

Нами было изучено влияние восстановленного глутатиона, цистеина, β-меркаптоэтанола, дитиотреитола и унитиола на окислительное фосфорилирование в свежеполученном эякуляте хряков. Установлено, что такие тиоловые реагенты как восстановленный глутатион, цистеин и β-меркаптоэтанол на процесс протекания окислительного фосфорилирования в сперматозоидах положительно не влияют. Влияние унитиола и дитиотреитола на окислительное фосфорилирование в сперматозоидах хряков приведены в таблице 12 и рисунке 1.

После 12 часов инкубации спермы с унитиолом в концентрации 6,7·10^-4 М окислительное фосфорилирование увеличивается на 28,0% по сравнению с контролем, а через 12 часов отношение Р/О остается почти на уровне свежеполученной спермы.

Унитиол в высокой концентрации (1,7·10^-2 М) в впервые часы инкубации снижает фосфорилирование и дыхание сперматозоидов незначительно, а дальнейшем начинается процессы ингибирование окислительное фосфорилирование гамет животных.

Анологичные процессы происходит и дитиотреитолом. В этом случае изменение фосфора к кислороду при концентрации 6,7· 10^-5 М повышается на 11,6%, а при 6,7· 10^-5 этот показатель равна 2,55%.

Таким образом, тиоловые соединения в впервые часы инкубации снижает фосфорилирование и дыхание сперматозоидов незначительно, а дальнейшем начинается процессы ингибирование окислительное фосфорилирование гамет животных.
3.1.4 Исследование изменении цитохромоксидазной активности спермы под действием унитиола и дитиотреитола

Опыты по изучению активности цитохромоксидазы определяли в цельной сперме хряков, сохрянявшейся при комнатной температуре (+18..20 ⁰С. Действие этих реагентов на активность цитохромоксидазы представлено в таблице 13.

Таблица 13- Влияние унитиола на цитохромоксидазную активность спермы хряков

Анализ таблицы 13 показывает, что добавление унитиола в низких концентрациях (6·10^-6 – 6,7·10^-5 М) приводит к снижению активности фермента цитохромоксидазы после 6 часовой инкубации. При добавлении реагента в концентрации 6,7·10^-4 М происходит быстрое ингибирование активности фермента цитохромоксидазы.

Рисунок 1- Влияние тиоловых соединений на абсолютный показатель живучести сперматозоидов хряков

Добавление тиоловых соединений к свежеполученной сперме хряков в низких концентрациях (6,7·10^-6 - 6,7·10^-4 М) приводит к снижению активности цитохромоксидазы, практически с первых часов инкубации. Особенно заметное становится после 6 часовой инкубации спермы с реагентом. Процесс ингибирование активности фермента идет параллельно со сроком инкубации спермы с реагентом.

Следовательно, цитохромоксидазная активность спермы хряков подавляются с тиоловыми реагентами, но степень торможение зависит от концентрации и продолжительности срока инкубации спермы с реагентами.
3.1.5 Влияние востановленного глутатиона и унитиола на скорость движения сперматозоидов хряков

В разделе 3.1.2 диссертации отмечено, что востановленный глютатион в низких концентрациях (2·10^-7 М) стимулирует абсолютный показатель живучести сперматозоидов и несколько повышает активность общих дегидрогеназ спермы хряков. Высокие концентрации (2·10^-5 М) этого реагента резко сокращает переживаемость и ингибирует активность дегидрогеназ.

В свзи с этим изучено влияние этих концентрации востановленного глутатиона на скорость движения сперматозоидов.

Данные, приведенные в таблице 14, показывают, что в контроле скорость движения сперматозоидов несколько снижается в первые три часа инкубации, а затем поддерживается на постоянном уровне. При добавлении к сперме востановленного глутатиона в концентрации 2·10^-7 М скорость движения сперматозоидов в течение всего периода инкубации 60 м/сек, а в контроле 50 м/сек. Это свидетельствует о стимуляции движения сперматозоидов под влиянием низкой концентрации востановленного глутатиона. При зтой концентрации скорость движения сперматозоидов в течение 12 часов остается почти без изменений (58-60 м/сек).

Увеличение скорости движения сперматозоидов в начальный период наблюдается также после добавления востановленного глутатиона в концентрации 2·10^-5 М. Однако с увеличением срока инкубации спермы с реагентом скорость движения сперматозоидов начинает резко падать, а через 9 часов инкубации движение прекращается совсем.

Следующим реагентом для изучение скорости движения сперматозоидов из тиоловых соединений взято – унитиол.

Влияние унитиола на скорость движения сперматозоидов представлено в таблице 15.

При добавлении к сперме унитиола в концентрации 6,7·10^-4 М в начальном периоде наблюдается некоторое снижение скорости движения сперматозоидов. Однако, в дальнейщем скорость достоверно повышается и в течение 6 часов остается на постоянном уровне, к 9 часам инкубации приближается к контролю и поддерживается на этом уровне более двух суток.

Полная потеря подвижности в присудствии унитиола наблюдается только после 60-61 часов инкубации, а в контроле- после 29-30 часов. Унитиол в концентрации 1,7·10^-2 М стимулирует скорость движения в течение первых 6 часов инкубации, затем наступает снижение скорости, а через 12 часов инкубации все сперматозоиды становится неподвижным. Во всех случаях повышение или снижение скорости движения сперматозоидов унитиолом или окисленным глутатионом статистически достоверны (Р 0,05-0,001).

Тиоловые соединения – унитиол, восстановленный глутатион, цистеин, β-меркаптоэтанол, дитиотреитол в низких концентрациях повышает скорость движения сперматозоидов хряков от 12,1 до 35,4% и сохраняют такое активность на уровне свежеполученного состояния от 3 до 6 часов (рис. 2).

Таким оброзом, добавление к сперме сцефических толовых реагентов на сульфгидрильные группы позволяют удинить сроки активного движения половых клеток и тем самым и более быстрого достижения к яйцелетке самок.

Таблица 15- Влияние унитиола на скорость движения сперматозоидов (мкм/с)

Использование оптимальных концентрации некоторых изученных тиоловых реагентов совместно с другими известными криопротекторами, позволить разработать новую среду для долговременнго хранения спермы хряков.

Головка сперматозоидов животных содержит ядро, акросому и цитоплазму. Акросома покрывает в виде колпачка передние 2/3 ядра и содержит набор гидролитических ферментов, необходимых для оплодотворения яйцеклетки и начальных этапов развития эмбрионов: гиалуронидазу, трипсиноподобную протеиназу (акрозин), щелочную и кислую фосфотазу, β-глюкоронидазу, β-амилазу.

Гидролитические ферменты акросомы осуществляют гидролиз лучистого венца яйцеклетки и способствуют проникновению сперматоизоидов через зону pellucid в яйцеклетку.


Рисунок 2- Влияния тиоловых соединений на скорость движения сперматозоидов хряков

Акросома в сравнении с другими структурами сперматозоидов более насыщен водой, что является одной из причин ее высокой чувствительности к хранению, охлаждению и замораживанию.

Учитывая эти особенности акросомы нами изучены влияния различных тиоловых соедиений на сохранности акросомы свежеполученной и храненной в условиях температуры +18 ⁰С спермы хряков. Полученные данные приведены на рисунке 3.

Анализ рисунка 3 показывают, что в целом тиоловые соедиенеия в низких концентрациях способствует сохранности акросом сперматозоидов по сравнению с контрольными образцами эякулятов. Но более положительные влияния на акросомы спермиев повлияли два реагента: унитиол и дитиотреитол. Так при хранении спермы в условиях комнотной температуры до 9 часов, сохранность акросом в унитиоле составила -86,6-80,9%, а в дитиотреитоле - 85,3-76,8%. С этими двумя реагентами акросомы сперматозоидов в течение 6-7 часов практически остаются на уровне свежеполученного эякулята.

Таким образом, добавление к сперме унитиола и дитиотреитола способствуют сохранение целостности одного из главных структурных элементов акросом сперматозоидов, которая в своем составе содержит гидролитических ферментов играющих ключевых роли в оплотворения яйцеклеток.
3.1.7 Исследование влияние востановленного глутатиона и унитиола на оплодотворяющую способность спермы хряков

Учитывая возможности количественного ограничения животных из тиоловых соединенеий исследованны востановленный глутатион и унитиол. Для изучения влияния востановленного глутатиона и унитиола на оплодотворяющую способность неразбавленной спермы хряков, сохраняемой при комнатной температуре, использовано 46 эякулятов, взятых от 4 хряков. Этими эякулятами искусственно, однакратно осеменено 140 основных свиноматок, от которых получено 1330 просят. В среднем на основную свиноматку 9,5 поросят. Из общего количества поросят к 2месячному возрасту осталось 1284 голов. Сохранность поросят – 95,5%.

Результаты опытов представлены в таблицах 16 и 17. Контролем служили группы 1,2,3,4,5, в которых использовали неразбавленную сперму без добавки унитиола или востановленного глутатиона, а также группа №12, свиноматок которой осменяли по методике, принятой в совхозе, т.е. свежеполученной спермой, разбавленной молочным разбавителем. Доза спермы и в этом случае имела объем 150 мл и содержала 5 млрд. Поступательно-подвижных сперматозоидов.

Анализ этих таблиц показывает. что хранение неразбавленной спермы при комнатной температуре приводит к снижению оплодотворяющей способности сперматозоидов и плодовитости свиноматок. Так, после 5 часов только 30%, а после 15 часов всего – 10%. Полная потеря оплодотворяющей способности сперматозоидов наблюдается после 20 часов хранения спермы. Так после 5 часов хранения спермы получено в среднем 10,2 поросят на опорос, после 10 часов хранения – 8,7, а после 15 часов – 7,0 поросят.

Таблица 16- Влияние унитиола и востановленного глутатиона на оплодотворя-щую способность спермы

Оплодотворяемость свиноматок, осемененных спермой, хранившейся 10-15 часов в присутствии унитиола, состовляет 90%. Нормальная оплодворяемость и плодовитость обнаружены также у свиноматок, которых осменяли спермой, инкубированной с унитиолом в течение 20 часов, хотя это сперма имела только 53% поступательно-подвижных сперматозоидов. Согласно инструкции по искусственному осеменению свиней к осеменению допускается сперма содержащая не менее 60% поступательно – подвижнцых сперматозоиов.

Живая масса поросят в возросте одного и двух месяцев, а также отход поросят до двухмесячного возроста были практически одинаковыми как в опытах, так в контрольных группах.

Добавление к сперме хряков-производителей востановленного глутатиона в концентрации 2·10^-6 М и инкубация с ним в течение 1 часа не влияли на оплодотворяющую способность сперматозоидов и на плодовитость свиноматок, но продолжительное хранение (5-10 часов) отрицательно влияют на сохранности оплодотворяющую способность сперматозоидов.

Так при хранении спермы с востановленным глутатионом в течение 5 часов оплодотворяемость свиноматок составила 42%, а при 10 часов всего лишь 13% (табл. 16). Как указано в таблице 17, при этом замечено и снижение многоплодности свиноматок в среднем на 11% и более

Таким образом внесение в сперму хряков востановленного глутатиона и унитиола, последный оказался более эффективным. Установлено, что внесение унитиола в сперму хряков увеличивает не только переживаемость спермы и сроки пригодности неразбавленной спермы хряков для осеменения свиноматок в течение 9-10 часов, но и обеспечивает высокую оплодотворяемость сперматозоидов и получение качественного потомства.

3.1.8 Изучение действие низкомолекулярных тиоловых соединений на отмытые от плазмы сперматозоидов хряков

На отмытые от плазмы сперматозоиды хряков унитиол свое положительное влияния на дегидрогеназную активность проявил в концентрации 6,7·10-³ М (табл. 18) т.е. в более низкой концентрации , чем при добавлении реагента к цельной сперме.

Таблица 18- Влияние унитиола на дегидрогеннальую активность отмытых сперматозоидов хряков

В концентрации 6,7·10-³ М унитиол увеличивает дегидрогеннальую активность отмытых сперматозоидов хряков от 37-41%. В опытах на отмытых и ресуспендированных сперматозоидах установлено, что в этом случае макси­мальное положительное влияние унитиола проявляется в 6,7 · 10-⁵ М, т. Е. в более низкой концентрации, чем в цель­ной сперме хряков-производителей (табл. 19). Концентрации реагента от 6,7∙10^-6 до 6,7∙10^-4 М увеличивает абсолютный показатель живучести на 33,1- 74,7%. Как показано в таблице 19. Наивысшее увеличение жизнеспособности (74,7%) получено при добавлении ресуспендированным половым клеткам хряков получено унитиола в концентрации 6,7∙10^-5 М. Увеличение концентрации реагента свыше 1,7∙10^-3 приводит к снижению жизнедеятельности половых клеток хряков.

Эти данные еще раз показывают большую роль плазмы спермы хряков при воздействии на них тиоловых соединений. Можно думать, что SН-группы добавленного к сперме унитиола защищают от окисления SН-группы тиоловых ферментов. В частности общую дегидрогеназу спермы. Этот фермент участвуют в обеспечении обмена веществ сперматозоидов, а это в свою очередь способствуют сохранению жизнеспособности сперматозоидов и увеличение продолжительность жизни половых клеток.

3.1.9 Разработка среды для кратковременного хранения спермы хряков

Известно, что неразбавленная сперма хряков при температуре + 18…20 ⁰С сохраняет оплодотворяющую способность не более 6-8 часов. В исследованиях В.М. Прокопцева и др.[231] активность сперматозоидов неразбавленной спермы хряков с оценкой 6 баллов, сохраняется при комнатной температуре до 6 часов. При этом оплодотворяемость свиноматок, осемененных спермой хранившие в течение 10 ч снизилось 3 и более раза, а многоплодие свиноматок на 21%, по сравнению осеменения свиноматок свежеполученной спермой.

Современные методы для разбавления и хранения спермы животных содержат компоненты, являющиеся метаболическими субстратами (сахара), увеличивающие буферность спермы и замедляющие изменение рН в процессе ее хранения (цитраты и фосфаты), смягчающие проявление температурного шока (желтки куриных яиц) или предупреждающие разрушение сперматозоидов в процессе их замораживание (глицерин), действующие на микрофлоры спермы (антибиотики и сульфаниламидные препараты) и т.д.

Поскольку сперматозоиды неспособны восстанавливать свои структуры, разрущающиеся в процессе метаболизма, методы сохранения их жизнеспособности основаны на явлении анабиоза – обратимого неактивного состояния, при котором метаболизм клеток замедляется или временно прекращается. Наиболее часто состояние анабиоза достигается понижением температуры, закислением среды, созданием анаэробных условий и введением в состав сред метаболических ингибиторов.

Исследование роли сульфгидрильных групп в сперме хряков и установление положительного влияния унитиола на неразбавленную сперму дало нам основание для разработки новой среды, одними из компонентов которых являются дитиотреитол и унитиол.

Для составления среды, состоящий из семи компонентов, мы использовали статистические методы планирования экстремальных экспериментов В.В. Налимова и Н.А.Чернова [24]. Из многих возможных путей поиска оптимальных условий был применен метод крутого восхождения по градиенту. Суть этого метода – шаговый принцип поиска оптимума при неполном знании процесса. Движение к оптимуму осуществляется путем постановки небольших серий опытов со спермой хряков, в каждом из которых одновременно варьируют по определенным правилам всеми факторами. После математической обработки результатов предыдущей серии выбрали условия проведения следующей.

Применение данного метода позволило оптимизировать соотношение компонентов в новой разработанной нами среде с включением дитиотреитола унитиола.

Новая среда, под условным названием глюкозо-цитрато-дитиотреитоло-унитиоловая (