Мусабеков айдос туменбаевич

ГОСТ 13496.0-80 Комбикорма для свиней;

ГОСТ 28001-88 Зерно фуражное;

ГОСТ 10125-96 Корма растительные

ГОСТ 20909.4. Определение подвижности спермиев;

ГОСТ 20909.4. Определение выживаемости спермиев при температуре 37°С;

ГОСТ 17637-72. Среда глюкозо-хелато-цитратно-сульфатная для

хранения спермы хряков;

ГОСТ 27775-88 Искусственное осеменение сельскохозяйственных

животных.

Сперматозоидами называются половые клетки образующееся в процессе сперматогеназа в стенках извитых канальцев семенника.

Спермой называется жидкость состоящих из сперматозоидов и плазмы. Плазма спермы это секреты придатка семенника, пузырьковидной, предстательной, куперовой, уретральных желез и частично ампул спермопроводов.

Тиоловыми группами называются группы белковой молекулы, принадлежащих боковым цепям аминокислотных остатков цистеина (SН-) или цистина (-S-S-).

Тиоловыми кофакторами называют кофакторы имеющие в своем составе сульфгидрильные (SН-) группы. К ним относят глутатион, липоевая кислота, коэнзим А и тиродоксин.

Тиоловыми соединениями называют низкомолоекулярные соединения имеющие в своем составе сульфгидрильные (SН-) или дисульфидные группы.

Тиоловыми ферментами называют активность которых тормозится при блокировании содержащихся в них SН-групп.

Мясной откорм свиней - вид откорма для получения сочного мяса свинины, которое используют для реализации населению в свежем виде, а также для приготовления вареной и сырокопченой продукции и всех видов колбас.

АДФ - аденозиндифосфат

ЛДГ –лактатдегидрогеназа (ЛДГ₁, ЛДГ₂, ЛДГ₃, ЛДГ₄, ЛДГ₅ )

ДТИ – дитиотреитол

SН – сульфгирильные группы

ВНИИГРЖ – Всероссийский научный исследовательский институт генетики и разведения животных

ВАСХНИЛ – Всероссийская Академия сельскохозяйственных наук имени Ленина

ОЕР - детергент S-амино-Na-лаурилсульфата

СРО - свободнорадикальное окисление

ПОЛ - перекисное окисление липидов

АСТ - аспаргиновые трансаминазы

АЛТ - аланиновые трансаминазы

ОЕР - S-амино- Na-лаурилсульфат детергент

ВП- время переживания

ОС - оплодотворяющая способность

ЦХО - цитохромоксидаза

АПЖ – абсолютный показатель живучести

ГЦДУ - глюкозо-цитрато-дитиотреитол-унитиол

ГХЦ- глюкозо-хелато-цитрат

ГХЦС-8- глюкозо-хелато-цитратовая среда-8

ГХЦЖК - глюкозо-хелато-цитрат-желточно-калий

ГХЦЖКМ - глюкозо-хелато-цитрат-желточно-калий-мочквина

ГХЦЖКУМ - глюкозо-хелато-цитрат-желточно-калий-унитиол-мочевина

ГЦДУМЖ - глюкозо-цитрато-дитиотреитол-унитиол-мочевино-желточная

ГД - гемпшир – дюрок

ГОТ – глутаматоксалаттрансаминаза

Успешная разработка методов низкотемпературной консер­вации биологических объектов невозможна без глубокого по­знания причин и механизмов повреждения и устойчивости кле­ток и организмов при охлаждении и замерзании.

Лишь после работ русских ученых И.И.Иванов [1], что при замораживании мы имеем дело не с прекращением жизни, а с предельным ее за­медлением в результате подавления метаболических реакций. Это состояние было названо анабиозом при замерзании. Ана­биоз - переход в состояние покоя - является приспособитель­ной реакцией клеток и организма к неблагоприятным усло­виям, которая возникла как первичное свойство организмов в период зарождения жизни на Земле и развилась в процессе их эволюции. Способность спермиев теплокровных животных сохранять жизнеспособность в замороженном состоянии пред­ставляет один из замечательных примеров полного анабиоза клеток.

Работы И.И.Иванов положили начало тео­рии замерзания биологических объектов. Им впервые было дано теоретическое объяснение закономерностей криоанабиоза при обезвоживании организма в результате переохлаждения и замерзания воды в клетках. Показано, что переохлаждение или понижение температуры жидкости ниже точки ее замерзания до критической температуры играет существенную роль в со­хранении жизнеспособности клеток. Дальнейшие исследования показали, что процесс замораживания - оттаивания в целом определя­ется физико-химическими свойствами воды, ее особым поведе­нием при понижении температуры, тогда как на процесс кристаллизации и таяния льда влияют характер объекта, состав биологической жидкости и скорость охлаждения.

Сведения о структуре воды являются ключом для понима­ния процессов, которые происходят при охлаждении и замора­живании. Способность воды переохлаждаться в капиллярах до -30..- 80°С объясняется ее связыванием капиллярными си­лами и увеличением упорядоченности структуры. При темпера­туре около 0°С вода принимает нестабильную «льдообразную» структуру, обладающую центрами, вокруг которых образуются кристаллы. Механический удар, загрязнение способствуют вне­запной кристаллизации. Напротив, кипячение разрушает цен­тры кристаллизации, разупорядочивает структуру. Установ­лено, что растворы солей, сахара, глицерина как бы скрепляют решетку и дольше сохраняются в переохлажденном состоянии.

Фазовый переход воды из жидкого состояния в твердое про­исходит в широкой температурной зоне - от 0 до -80°С. В этой зоне вода принимает жидкокристаллическое состояние. Замерзая, она образует кристаллы гексагональной формы, при этом выделяется скрытая теплота кристаллизации. Форма кристаллов зависит от температуры, скорости ох­лаждения и состава раствора. Если скорость замораживания настолько высока, что молекулы воды не успевают переместиться и образовать кристаллическую решетку, вода переходит не в кристалличе­ское, а аморфное состояние или превращается в стеклообраз­ный лед. Это явление получившее название витрификации, или аморфизации.

Открытие витрификации сыграло чрезвычайно большую роль в разработке методов низкотемпературной консервации спермы, так как некристаллическое замерзание мало повреж­дает клетки и сохраняет их жизнеспособность. Однако оно про­исходит лишь при очень высоких скоростях охлаждения, по­рядка 5000°С/с, что практически не достижимо. Кроме того, было показано, что стекловидное состояние неустойчиво: начи­ная с температуры -100°С происходят образование и укруп­нение кристаллов. Это явление называют рекристаллизацией при оттаивании, или миграционной кристаллизацией. Рекри­сталлизация губительна для половых клеток самцов. Стекловидное состояние можно сохранить при температуре ниже -130 °С. Это обстоя­тельство побудило ученых обратиться к поиску защитных ве­ществ, которые бы способствовали некристаллическому замер­занию.

Теоретические исследования в криобиологии спермы животных открыли большие перспективные возможности не только в ускоренном развитии и широком внедрении методов искусственного осеменения сельскохозяйственных животных, но и в сохранении генетически наиболее ценных и исчезающих пород и видов животных.

Успешная разработка методов низкотемпературной консервации спермы животных невозможна без глубокого познании причин и механизмов повреждения и устойчивости спермы при охлаждении и замерзании. Известно, что в процессах клеточного дыхания, реакциях окислительного фосфорилирования важную роль играют низкомолекулярные тиоловые соединения, содержащие сульфгидрильные группы (SН-). Они входят в активные центры многих ферментов и коферментов, а также участвуют в поддержании третичной структуры белков клеток.

В свиноводстве страны методоы искусственного осеменения применяют только лишь в нескольких хозяйствах, а разработкой технологии криоконсервировации эякулятов вообще не занимаются. Это связано с биологическими особенностями низкой криоустойчивости спермы хряков, необходимостью замораживания значительно больших объемов спермы, технологическими и методическими трудностями нестабильностью результатов осеменения. Поэтому проблема совершенствования метода криоконсервации спермы хряков и поиск подходов и способов повышения криоустойчивости сперматозоидов остается весьма актуальной.

Исследования по совершенствованию биотехнологии хранения половых клеток в нашей стране не ведутся, а в странах с развитым свиноводством вопросами криоконсервации спермы хряков занимаются. Для обсуждения полученных результатов и установление научных связей материалы диссертации излагались в конференциях России, Польши, Болгарии, Белоруссии, Чехии и на Мальдивах.

На современном этапе развитии искусственного осеменения в свиноводстве актуальны изучения изменении количества сульфгидрильных групп в плазме спермы и сперматозоидов хряков при охлаждении и замораживании-оттаивании, выявление между содержанием SН-групп в свежеполученной сперме и функциональной полноценностью заморожено-оттаянной спермы, а также поиски путей повышения криоустойчивости эякулятов хряков. В связи с этим разработка сред с использованием тиоловых соединений для кратковременного и долговременного хранения спермы имеет научную ценность, а полученные результаты являются инновационными.

Решение биотехнологической проблемы по дальнейшему совершенствованию кратковременного и долговременного хранения спермы хряков приведет к использованию высокоценных, отценных по селекционно-генетическим параметрам хряков-производителей, избежать близкородственного спаривания, повышению воспроизводительных качеств свиноматок, увеличению темпа роста молодняка свиней, а также более широкого внедрения прогрессивного метода - искусственного осеменения маточного поголовья.

Научно-исследовательская работа по данной теме является составной частью исследований кафедры «Биотехнологии» Южно-Казахстанского государственного университета имени М.Ауезова по теме «Разработать биотехнологические методы по долговременному хранению генофонда животных».

- изучить количественные показатели сульфгидрильных групп в плазме и сперматозоидах, определить их роль в хранении функциональной полноценности половых клеток;

- изучить влияние тиоловых соединений на изменение окислительного фосфорилирования в сперматозоидах и качественные показатели при кратковременном и долговременном хранении эякулятов;

- изучить влияние тиоловых реагентов на ферментативную активность спермы - дегидрогеназную, цитохромоксидазную и изоферментный спектр лактатдегидрогеназы;

- разработать новые эффективные среды пригодных для кратковременного (+ 2 – 0 ⁰С) и долговремененного хранения спермы хряков (-196 ⁰С);

- провести осеменения свиноматок со спермой, храненной с новыми разбавителями и оценить качество полученного потомства;

- определить экономическую эффективность применения новых сред для спермы хряков.

Научная новизна. Полученные нами данные экспериментальных исследований позволили: развить имеющиеся знания по криобиотехнологии сперматозоидов; показать взаимосвязи между содержанием сульфгидрильных групп и качеством эякулята; степень важности тиоловых соединений в механизмах ферментативного регулирования энергетического обмена и криоустойчивости сперматозоидов.

Теоретически обоснованы и предложены способы защиты сульфгидрильных групп спермы хряков с помощью тиоловых соединений и серосодержащих реагентов, вскрыты механизмы защиты спермы при их криоконсервации и оттаивания.

Впервые в практике технологии искусственного осеменения свиней изучены влияние низкомолекулярных тиоловых соединений на качественные показатели спермы хряков-производителей. Выявлены ряд новых, принципиально важных закономерностей, позволяющих существенным образом расширить и углубить теоретические и практические основы воспроизводства животных.

Впервые показана возможность повышения криоустойчивости сперматозоидов введением в среду криоконсервации низких концентраций веществ со специфическим и неспецифическим действием (низкомолекулярные SH-соединения, мочевина).

Определены параметры взаимосвязи между содержанием сульфгидрильных групп (SН-) спермы и ее качественными показателями.

Разработаны новые среды кратковременного хранения (+2-0⁰С) глюкозо-цитрато-дитиотреитоло-унитиоловая (ГЦДУ) и долговремененного хранения глюкозо-цитратно-глицерино-дитиотреитоло-унитиоло-мочевино-желточная (ГЦДУМЖ) (-196⁰С). Применение разработанных сред позволить повысить эффективность использования высокоценных хряков-производителей.

- использования содержания сульфгидрильных групп для оценки качественных показателей и криоустойчивости спермы хряков;

- новая среда для кратковременного хранения, под условным названием глюкозо-цитрато-дитиотреитоло-унитиоловая (ГЦДУ);

- новая среда для криоконсервации спермы под условным названием глюкозо-цитратно-глицерино-дитиотреитоло-унитиоло-мочевино-желточная (ГЦДУМЖ);

Материалы диссертационной работы и результаты исследований могут быть использованы при разработке долговременного хранения генофонда исчезающих популяции, линий и пород животных Казахстана.

Основные положения, выносимые на защиту:

- количественные показатели сульфгидрильных групп в плазме эякулята и сперматозоидах и их влияния на качественные показатели спермы;

- влияние серосодержащих и тиоловых соединений на изменение окислительного фосфорилирования в сперматозоидах и качественные показатели свежеполученных и замороженных эякулятов;

- влияние серосодержащих и тиоловых реагентов на дегидрогеназную и цитохромоксидазную активность спермы;

- влияние охлаждения и замораживания-оттаивания на общую активность и изоферментный спектр фермента лактатдегидрогеназы;

- эффективность использования высокоценных хряков-производителей с новыми разработанными средами для хранения спермы в условиях кратковременного (+ 2 – 0 ⁰С) и долговремененного хранения (-196 ⁰С);

- параметры сохранности качественных показателей сперматозоидов после хранения с новыми разбавителями в производственных условиях;

- экономическая эффективность применение разработанных новых сред для спермы хряков-производителей.

Работа состоит из 3 глав, введения, заключения, списка использованной литературы. Основное содержание работы изложено на 153 страницах машинописного текста, иллюстрировано 15 рисунками и 64 таблицами. Список литературы включает 246 наименований.

В связи с этим нами выбрана направления исследования по нахождению способов защиты сульфгидрильных групп спермы хряков с помощью тиоловых соединений и серосодержащих реагентов, вскрыт механизмы защиты половых клеток при их криоконсервации и оттаивания. Проанализированы полученные ранее результаты ученых по данной проблеме.

Гаметы позвоночных животных и человека являются одним из первых биологических объектов, подвергнутых замораживанию при низких и сверхнизких температурах. Спалланцани еще в 1787 году [по 1] описал восстановление подвижности сперматозоидов высших животных, подвергшихся замораживанию при температуре -15 С. И.И.Иванов [1] еще наблюдал восстановление двигательной способности сперматозоидов жеребца после охлаждения до -15С и оттаивания. В.К. Миловановым [2] было установлено, что сперматозоиды высших животных способны переносить охлаждение до -23С и восстанавливать активность после оттаивания.

По результатам исследовании B.J. Luyet и E.L.Hadapp сперматозоиды кролика, охлажденные до -40С [3] сохраняли оплодотворяющую способность после трехминутного пребывания при данной температуре. А в 1948 году И.В.Смирновым [4] впервые в мире было получено многочисленное потомство от 61 крольчихи после осеменения спермой, подвергнутой глубокому охлаждению (-78... -196С). Впоследствии этим же автором было получено потомство после осеменения овцематок глубокозамороженной спермой баранов [5]. В своих опытах автор пользовался методом витрификации.

Результаты исследовании И.В.Смирнова и вторичного открытия защитного действия глицерина A.U.Smith и C. Polge, [6] исследования по замораживанию спермы животных получили более широкий размах. Обнаружились большие видовые различия в устойчивости сперматозоидов к действию низких и ультранизких температур. Исследованиями многих авторов установлены, что наиболее устойчивы к замораживанию сперматозоиды быков Е.М Платов, [7]; буйволов А.Roy et al., [8], затем козлов и баранов М.И.Лопатко [9]. Плохо переносят замораживание сперматозоиды жеребцов Т.П.Ильинская [10]. И, наконец, наименее устойчивыми оказались сперматозоиды хряка С.Polge [11]; С.И.Сердюк [12]; В.А.Наук [14]; В.П. Кононов [13].

Основные трудности замораживания сперматозоидов сопряжены с тем, что еще при охлаждении спермы до субнулевых температур даже небольшие отклонения в скорости охлаждения приводят к возникновению температурного шока и после замораживания-оттаивания они теряют оплодотворяющую способность маток.

Сообщения W. Baier [15] о получении потомства от осеменения свиноматок замороженной спермой этот опыт долгое время не удавалось повторить. Только в 1971 году появились сообщения E.F.Grahem и др. [16] и

B.G.Crabo и S. Einarson, [17] об успешных результатах замораживания спермы хряка при быстром охлаждении. В Советском Союзе первое потомство от замороженной спермы хряков было получено в ВИЖе Ф.А.Барановым [18] от трех основных свиноматок.

Микроскопические исследования сперматозоидов разных млекопитающих обнаружили большое сходство их во внешней морфологии и ультраструктурной организации внутренных строении.

Исследовании С.Reed, и В.Reed [19]; L.Brwtshneider [20]; J.L.Hancock [21] показали, что сперматозоид состоит из головки, шейки и хвоста. Все отделы сперматозоида ограничиваются протоплазматической мембраной.

Исследованиями L. Nicander, А. Bane [22] и А.Н. Варнавского [23] установлена, что головка сперматозоида представлена в виде овальной несколько вогнутой и суживающей пластинки длиной 7...9 микрон и толщиной 1-1,2 микрона. Ширина его у вершины около 4 микрон и у основания 1,7...2,5 микрона [20].

При быстром охлаждении (температурный шок), замораживании-оттаивании и при хранении спермы быков, баранов и хряков. При 0С как показали результаты световой и электронной микроскопии проведенные J. Hancock, [24]; P.F.Watson, J.M. Plummer [25]; Б.А. Скорнякова [26]; V.G. Pursel [27] прежде всего повреждается акросома сперматозоидов.

По характеру изменений акросомы и плазматической мембраны головки может быть самым различным. Оболочка (плазматическая) отслаивается и разрывается. У большинства клеток, при сохранении целостности, оболочка вздувается, становится складчатой, в случае повреждения оболочка становится сильно складчатой, местами разрывается или совершенно отсутствует. Акросома расслаивается, либо ее оболочки образуют складки с разрывами. Ядро иногда может потерять гомогенность, а ядерные оболочки отслаиваются. Подобного характера изменения наблюдали К.Abraham и Р. Bhargava [28] на сперматозоидах быка и буйвола при хранении при температуре 0С. Такого же типа изменения обнаружили A.W. Blackshfw и C.W. Salisbury [29] после замораживания-оттаивания сперматозоидов жеребца. Установлено, что в случае холодового шока эти изменения зависят от силы удара низких температур.

Замораживание-оттаивание сперматозоидов быков и баранов ( [23]; [30]; [26]) вызывает некоторые нарушения в области шейки в виде просветления составных частей и набухания оболочки, а также разрывов оболочки и дезинтеграции структурных элементов. Все эти изменения выражены относительно меньше, чем изменения в области головки. При этом у сперматозоидов баранов, которые менее устойчивы к замораживанию-оттаиванию, эти нарушения встречаются чаще, чем у быков [23]. В результате замораживания-оттаивания наблюдается также отделение головок сперматозоида от шейки, разломы частей тела [30].

При замораживании-оттаивании спермы, а также холодовом шоке, хвостовая часть сперматозоида также претерпевает некоторые повреждения, хотя эти повреждения значительно меньше и реже выражены, чем нарушения в головке гамет ([31]; [23]; [26]).

Б.Ф.Скорняков [26] обнаружил, что при быстром охлаждении сперматозоидов быка наблюдается набухание и разрыв оболочки, целостности митохондрий и в некоторых случаях фибрилл. G.L. Rapatz и др. [32] наблюдали образование полостей в матриксе вокруг фибрилл и разрушение митохондриальной оболочки сперматозоидов.

P.J. Quinn и др, [33] отмечает просветление в матриксе митохондриального чехла, в то же время плазматическая оболочка покрывающей промежуточный отдел хвоста у сперматозоидов баранов-производителей, остается почти без изменений.

К настоящему времени имеется довольно обширная литература о физико-химическом составе гамет и биохимических процессах протекающих в эякуляте сельскохозяйственных животных. Они представлены монографиями Т. Mann [34] и Н.П.Шергина [44], а также работами по отдельным вопросам ряда других авторов. Накоплен значительный материал и по влиянию охлаждения и замораживания-оттаивания на физиологические и биохимические процессы в сперматозоидах сельскохозяйственных животных и человека.

Обширные исследования влияния охлаждения на сперму быка и барана Ф.И. Осташко и др., [36] и А.Vоssen, R.Foote [37]) показали, что при этом происходит нарушение активного транспорта ионов. По наблюдениям других авторов нарушение транспортной функции и проницаемости мембраны сперматозоидов проявляется не только в отношении ионов, но и молекул.

Е.Д.Ким [38] указывает, что при быстром охлаждении сперматозоидов быка, наряду со снижением подвижности, происходит резкое снижение (до 60%) содержания фосфолипидов в клетках и увеличение их в плазме в среднем на 12%. В работах целого ряда авторов показано ([39]; [40]; [41]; [42]; [43]) снижение содержания липидов, фосфолипидов и их фракций при охлаждении, особенно после холодового шока и замораживания-оттаивания спермиев (до 11-60%).

В.К.Милованов и др. [44] отмечают, что при охлаждении сперматозоиды барана и быка теряют аминокислоты, входящие в состав протоплазматических белков. Причем менее устойчивые к действию замораживания сперматозоиды барана теряют их вдвое больше, чем сперматозоиды быка (20% против 11%). По данным В.А.Наука [14];[45] охлаждение спермы быка, разбавленной в лактозо-глицериновой среде (ЛГ-среда), не вызывает существенного изменения общего содержания аминокислот. После замораживания-оттаивания наблюдается снижение общего количества аминокислот на 11%. В то же время охлаждение и замораживание спермы баранов в той же лактозо-глюкозной среде вызывает уменьшение аминокислот на 15% и 20% соответственно. Снижение содержания аминокислот наблюдалось и при замораживании-оттаивании сперматозоидов хряков. Эти потери объясняются не только нарушением проницаемости мембраны клеток, но и нарушениями в липопротеидных комплексах. Биохимические исследования показали, что низкие температуры ускоряют распад липопротеидного покрова сперматозоидов, тем самым и их жизнеспособности.

Деструктивные изменения в мембранных структурах сперматозоидов, возникающие после температурного (холодового) шока и замораживания-оттаивания приводят к утечке (выходу) из клеток и высокомолекулярных соединений.

В исследованиях Н.В.Корбан, В.И. Боднар [46], L.A., Johnson, V.G. Pursel [47], Е. Стшежек и др. [48] и В.С. Антонюк [41]; показано, что после холодового шока и замораживания-оттаивания спермы происходит выход акросомальных ферментов гиалуронидазы и акрозина из сперматозоидов в окружающую среду. При этом снижение активности гиалуронидазы и акрозина находится в зависимости от концентрации глицерина в среде замораживания. С повышением концентрации глицерина снижается сохранность ферментов в сперматозоидах. Поэтапное введение глицерина в среду для замораживания способствует лучшей сохранности гиалуронидазы и акрозина, чем его одномоментное добавление в среду для хранения [48].

Данные реузультаты исследовании Ю.Г. Курило [49], Н.Т., Плишко и др. [50], R.A. Harrison, I.G. White [51], M.M. Pase, E.F. Graham [52], Е.Ф. Грэхем [53], Г.В. Борончука [54] и А.С., Ерохина [55]; показали, что замораживание-оттаивание спермы вызывает выход из сперматозоидов в окружающую среду и целого ряда других ферментов: щелочной фосфотазы, каталазы, гексокиназы, альдолазы, цитохромоксидазы, сукцинатдегидрогеназы, лактатдегидрогеназы, глутаматоксалат трансаминазы, супероксидисмутазы, глюкозо-фосфат изомеразы.

Обширные исследование зависимости функциональной полноценности сперматозоидов после замораживания-оттаивания от выхода ферментов из сперматозоидов, выявило наличие корреляционной связи между сохранностью (утечкой) фермента глутаматоксалаттрансаминазы и качеством сперматозоидов. В частности, со снижением оплодотворяющей способности гамет ([52]; [27]; [16], [56].

Снижение оплодотворяющей способности сперматозоидов после холодового шока и замораживания-оттаивания связано не только с повреждением мембран акросомы, но и значительным сокращением абсолютный показатель живучести сперматозоидов.

По данным Л.Д. Римарова [57], Е.М. Платова [7] и Н.Г. Мороз [58]) по сравнению со свежеполученными сперматозоидами, после замораживания-оттаивания абсолютный показатель живучести сперматозоидов быка и барана укорачиваются в 2 и более раза.