Биологические особенности спермы хряков

В начальных этапах по криоконсервации разбавление спермы средой для замораживания проводили сразу после ее получения (в течение 10...20 мин). Основанием для этого служило то, что плазма спермы активизирует обменные процессы сперматозоидов, сокращая продолжительность их функционирования [34]. Однако как показали данные В.К.Милованова и др., [44]; С.И. Сердюка и А.А. Беликова [103], В.П.Кононова [13], С. Pursel et al., [27]) выдержка свежеполученной спермы в течение 1...2 часов перед разбавлением оказывает положительное влияние на сохранность акросом сперматозоидов и их устойчивость к охлаждению. Результаты осеменения свиноматок замороженно-оттаянной спермой хряков подтвердили необходимость такой выдержки. Высокая результативность осеменения наблюдалась именно в опытах, где сперма перед ее разбавлением выдерживалась в течение 1-2 часов.

По В.П.Кононову [13] положительное действие инкубации спермы перед разбавлением на последующую устойчивость сперматозоидов к охлаждению при замораживании обусловлено их взаимодействием с катионными белками плазмы спермы. Такие взаимодействия вызывают существенные изменения структуры мембранных липидов, что отражается на характере их фазового перехода при охлаждении. У свежеполученных сперматозоидов затвердевание липидов происходит кристаллически, в то время как у сперматозоидов подвергнутых инкубации затвердевание липидов протекает аморфно, что менее разрушительно для мембран гамет.

Подтверждением роли плазмы в повышении устойчивости спермы при ее инкубации служат результаты опытов, которые показывают, что с повышением степени разбавления спермы средой более чем 1:2, чувствительность сперматозоидов к холоду увеличивается.

В отличие от других видов сельскохозяйственных животных сперма хряков характеризуется большим объемом эякулята при более низкой концентрации сперматозоидов. Поэтому разбавление средой целого эякулята спермы приводит к значительному увеличению объема спермы, а замораживание больших объемов спермы делает метод криоконсервации технологически не выгодным для производственных условий. В связи с этим одновременно с разработкой методов криоконсервации целого эякулята спермы после ее разбавления усилия исследователей были направлены и на уменьшение объемов замороженной спермы путем ее концентрирования.

Еще в 1900 г. И.И.Иванов [1] показал возможность оплодотворения яйцеклеток при осеменении самок одними сперматозоидами, взвешенными в физиологическом растворе. Проведенные исследования L.Richter и А. Liedicke [104], W.M. Maxwell и S.Salamon [105] и др. определение влияния удаления плазмы спермы путем центрифугирования на качество сперматозоидов после замораживания-оттаивания показали, что удаление плазмы спермы и замена ее средой для криоконсервации способствует повышению выживаемости и абсолютный показатель живучести сперматозоидов.

Как установил И.И.Иванов [1], при эякуляции сначала выделяется секрет уретральных желез, вытекающий из мочеполового канала еще до начала полового акта, затем к нему присоединяется секрет куперовых желез, потом следует выделение сперматозоидов вместе с секретами придатка семенника и предстательной железы и, наконец, выделение секрета пузырьковидных желез [35]. Исходя из этого L. Richter и А. Liedicke [104], W.M. Maxwell и S. Salamon [105] получали, и использовали для криоконсервации пустую, богатую сперматозоидами фракцию эякулята.

Работы ряда авторов показали, что в отличие от целого эякулята, густую фракцию рекомендуется разбавлять средой в течение 10-20 мин. после получения. По данным С.И. Сердюка и др. [106]) длительная выдержка густой фракции спермы оказывает отрицательное влияние на устойчивость сперматозоидов к охлаждению при криоконсервации. Видимо это связано со снижением в густой фракции спермы веществ, обладающих антиокислительными свойствами в результате отсутствия секретов придаточных желез.

Известно, семенная жидкость (плазма) - секрет придаточных желез, содержит в своем составе в больших количествах фосфолипиды [107]), лимонную кислоту [108]) и эрготионина [109]). Эти вещества обладают способностью защищать мембраны сперматозоидов от развития в них процессов свободнорадикального окисления и накопления в клетках продуктов перекисного окисления, которые снижают устойчивость сперматозоидов к охлаждению.

Некоторые исследователи рекомендуют использовать концентрированную часть эякулята. В связи с использованием приема концентрирования спермы при ее замораживании возникает вопрос не оказывает ли негативное влияние центрифугирование спермы, а также удаление плазмы после центрифугирования или при получении густой фракции спермы на оплодотворяющую способность сперматозоидов.

По данным H.D.Moore et al., [110] отделение секрета пузырьковидных желез положительно сказывается на оплодотворяющую способность сперматозоидов после замораживания. S.Einarsson с соавторами [111] не обнаружили достоверной разницы в оплодотворении свиней при использовании для разбавления замороженной спермы плазмы спермы или обрата молока. В то же время С. Viring и А. Einarsson [112] установлено, что сперматозоиды в большем количестве достигают верхних участков яйцеводов от маточного рога если они водились вместе с плазмой спермы.

Сравнительное испытание замораживания целых эякулятов и густой фракции спермы Polge Levelock [113] показало, что сперматозоиды из густой фракции, после оттаивания, обладают большей выживаемостью, переживаемостью и оплодотворяющей способностью.

Касаясь влияния центрифугирования спермы на качественные показатели сперматозоидов, в особенности на их оплодотворяющую способность после замораживания-оттаивания предполагается, что центрифугирование спермы в пределах до 20 мин. при более 800 об/мин. повреждающего действия на сперматозоиды не оказывает ([99]; [80]; [10]). Правда имеется мнение и о возможном отрицательном действии центрифугирования на криоустойчивость сперматозоидов [13]. Прямых исследований по этому вопросу в литературе не имеется.

Исследование двух режимов охлаждения спермы от 30 до 0С: быстрый 3 град/мин и медленный 0,125 град/мин, показало, что и мембранные липиды сохраняются лучше при медленном охлаждении [67]. Увеличение времени выдержки спермы повышает устойчивость сперматозоидов и к быстрому охлаждению до 0С [27] и замораживанию-оттаиванию [114]. Такое повышение устойчивости сперматозоидов к охлаждению до 0С зависит от исходной температуры инкубации спермы. Устойчивость сперматозоидов наибольшая при начальной температуре инкубации 30...34 С и уменьшается со снижения температуры инкубации до 0 С. По данным Н.С.Пушкарь и др., [115] чем ниже температура инкубации, тем меньше способность клеток, в данном случае сперматозоидов, к адаптации.

Исследование В.П. Кононова [13] показали длительная выдержка разбавленной спермы хряков сначала 2 часа при +15 С, а затем 3 часа при +5 С повышает выживаемость сперматозоидов и сохранность их акросом.

Благоприятное влияние длительной выдержки разбавленной спермы при температуре +5 С на выживаемость и качество сперматозоидов после замораживания было замечено еще в 50-х годах С.Полджем и Л. Роусоном [82] при разработке метода криоконсервации спермы быков.

С целью уменьшения активизирующего действия плазмы на обменные процессы сперматозоидов и снижения уровня окислительных процессов, в результате которых образуются токсические для сперматозоидов продукты, некоторые авторы предложили проводить выдержку семени перед замораживанием в условиях анаэробиоза [44]. С этой целью сперму выдерживали в атмосфере водорода. Эти данные представляют интерес не только с практической стороны (повышается оплодотворяющая способность замороженно-оттаянной спермы), но и с теоретической, поэтому требуют продолжения дальнейшего исследования.

1.1.9.1 Исследование механизмов устойчивости сперматозоидов хряков к замораживанию

Механизмы устойчивости сперматозоидов к действию низких температур до начала кристаллизации и кристаллообразовании различны, хотя развитие этих повреждений является продолжением проявления структурных изменений мембран на начальных этапах охлаждения. После сообщения W. Baier [15] о получении поросят от свиней осемененных спермой замороженной при медленном охлаждении попытки других исследователей получить потомство от спермы замороженной при медленном охлаждении не увенчались успехом [116]. При медленном замораживании спермы, сперматозоиды после оттаивания утрачивали оплодотворяющую способность, хотя и сохраняли достаточно высокую подвижность.

Используя быстрое замораживание спермы путем гранулирования на сухом льду B.G. Crabo и S. Einarsson [17], S. Graham et al., [117]; V.G. Pursel и L.A. Johnson [27]; L.Richter и А. Liedike [104]. На программной установке Ф.А. Баранов [118] добился успешных результатов с получением опоросов после осеменения свиней замороженно-оттаянной спермой.

В.К. Миловановым с сотрудниками [44] на программной морозильной установке был испытан ряд режимов охлаждения спермы от 0 С до -180 С со средней скоростью от 4,5 до 60 С в мин. Наилучшие результаты по подвижности сперматозоидов после оттаивания (t 38...40 C) были получены при замораживании спермы с максимальной скоростью. При средней скорости падения температуры 60 град/мин подвижность восстанавливали 55...60% сперматозоидов против 25...35% при скорости охлаждения 4,5 град/мин. Аналогичные результаты получили в своих исследованиях болгарские ученые Д.И. Загорский и Н.Д.Бобадов [119]. Необходимо отметить, что приведенные средние скорости снижения температуры не являются прямолинейными функциями. Изучение замораживания показало, что форма кривой падения температуры приближается к параболической. Соответственно и скорость снижения температуры идет с нарастанием. В исследованиях В.К.Милованова и сотрудников [44] в лучшем варианте скорости падения температуры составляли за 1-ю мин. 26С/мин, за 2-ю мин - 75 С/мин и за 3-ю - 125 С/мин.

Исследования G.Waide [120] подтверждают данные о преимуществе быстрого замораживания перед медленным. В его опытах сперма замороженная в алюминиевых пакетах быстрым охлаждением в парах жидкого азота в течение 3-х мин. от +5 до -100 С имела после оттаивания большую подвижность 47,6% ,чем сперма после медленного замораживания от +5 С до -20 С со скоростью 1 с/мин и от -20 С до -70 С, со скоростью 3 С/мин 19,2%. В то же время имеется сообщение F. Monji [121], в котором отмечается, что сперма хряков лучше сохраняется при медленном способе замораживания. Однако в данном сообщении не приводятся сведения об оплодотворяющей способности сперматозоидов, которые подтвердили бы преимущество медленного режима замораживания.

При замораживании в гранулах режим охлаждения в определенной степени можно регулировать путем изменения их объема. S.Salamon [80] замораживал сперму на сухом льду в виде гранул объемом 0,08; 0,16; 0,32; 0,64 мл. После оттаивания лучшую активность сперматозоидов наблюдал у гранул с минимальным объемом. Однако D.Schmidt [122], после осеменения свиноматок спермой замороженной в виде гранул объемом 0,1 и 1,0 мл получил одинаковую оплодотворяемость.

В других опытах V.G.Pursel и L.A. Johnson [27] выживаемость сперматозоидов не зависела от объема гранул в пределах 0,1...0,5 мл, но возрастала переживаемость с увеличением объема, а при замораживании спермы в виде гранул объемом 0,1; 2 и 5 мл после оттаивания подвижность сперматозоидов составляла 38, 34 и 29% соответственно.

Имеются сообщения Р. Westendrf et al., [123] и J.G.Aalbers et al., [124] и др. о замораживании спермы в больших объемах по 5-6 мл в виде "больших соломин", Д.И.Загорский и Н.Д. Бобадовы [119], в алюминиевых тубах и других емкостях по 5...8 мл, а также Н.Б. Ильинской [10] и В.С. Антонюк [41] полиэтиленовых пакетах по 20...25 мл. Однако этот вопрос пока остается нерешенным, хотя имеет существенное значение в связи с необходимостью замораживать большие объемы эякулятов и более совершенной среды для замораживания и оттаивания.
1.1.9.2 Теоретические обоснование механизмов оттаивания криоконсервированной спермы хряков

Важную роль в сохранении функциональной полноценности сперматозоидов при их оттаивании играет режим оттаивания. По данным Л. Рэ [125] и Дж.Фаррант [126] при отогреве криоконсервированной спермы в температурной зоне от -150 до -51 С наблюдали рекристализационные процессы, по их мнению которые могут вызвать значительные морфологические и функциональные изменения клеток. В диапазоне температур от -80 до -150 С скорость нагрева мало влияет на сохранность сперматозоидов. По данным А.Д. Бугрова и Е.А. Олексеенко [127] наиболее интенсивно рекристализационные процессы в замороженной сперме протекают в интервале температур от -80 до -50 С. В связи с этим при оттаивании замороженной спермы наибольшая скорость оттаивания должна поддерживаться именно в этой зоне.

Начиная с температуры -51 С, в системе появляется жидкая фаза и вместе с ней создаются условия протекания осмотических процессов

По данным Ф.И. Осташко [36], по мере таяния концентрация жидкой части постоянно меняется до полного перехода твердой фазы в жидкую. Поэтому температурный интервал между -50 С и 0 С так же нужно проходить с возможно высокой скоростью.

При оттаивании спермы примерно до -20 С нагревание, независимо от скорости притока тепла, идет почти одинаково и очень быстро [128]. Затем наступает некоторая задержка подъема температуры, длительность которой обусловлена скоростью подвода тепла [129].

В отличие от спермы других сельскохозяйственных животных (быки, бараны, птицы) оттаивание спермы хряков осложняется необходимостью одномоментного разбавления больших объемов спермы.

Для оттаивания спермы ряд авторов применяли подогретые стеклянные колбы или так называемый "сухой" способ ([80] и [11]), а другие авторы использовали для оттаивания подогретые среды - или так называемый "мокрый" способ ([17]; [111]; [130]; [104]; [131] и [132]).

По некоторым данным М. Paquignon и др. [133] лучшие результаты получаются при оттаивании спермы в разбавителях при 50С. Однако в сравнительных опытах I.Kozumplik [134] показал преимущество "сухого" способа перед "мокрым". При осеменении свиноматок спермой оттаянной "сухим" способом в тефлоновых сосудах подогретых до 44, 50 и 65 С с последующим разбавлением оттаянной спермы средой получил 70,6% опоросов, против 58,8% при осеменении свиней спермой оттаянной в подогретой среде.

Исходя из данных, что скорость отогрева спермы от -196 С до -80 С не оказывает существенного влияния на оплодотворяющую способность спермы. V.Pursel и L.Johnson [135] испытали двухступенчатый режим оттаивания. Перед перенесением в подогретую до 50 С среду для оттаивания гранулы замороженной спермы выдерживали в течение 3 мин. в контейнере из пенопласта. Такая выдержка гранул способствует поднятию их температуры от -196 С до -70 С, что ускоряет оттаивание в подогретой среде с 35 до 15 сек. В результате повышалась доля сперматозоидов с нормальной акросомой с 48% до 65%, а подвижность с 28 до 50%.

Для одновременного оттаивания большого объема замороженной спермы В.Кононов с соавторами [136] разработали устройство, позволяющее при оттаивании спермы сразу отделять жидкую, оттаянную сперму от еще твердой, не оттаянной фазы. Устройство представляет своеобразный термостат с водяным обогревом, при заданной температуре, обычно 42-43 С.

А.П., Зверева и К.И. Пушкарь [137] предлагают аналогичного действия прибор, но другой конструкции. Прибор в виде навитой в одной плоскости спирали из хромированной медной трубки, по которой подается подогретая вода. Опытным путем установлена оптимальная температура циркулирующей в оттаявателе воды. Наиболее высокие показатели по активности получены при температуре воды в оттаявателе 40-50 С. Размораживание спермы в объеме 55 мл протекает в течение 26 сек.

B.G.Crabo [138], D.Schuler et al., [139]; М. Ibrahim и L.Kovaсs [140]; J.G. Aalbers и др., [124] предлагают сперму, замороженную в пайетах, оттаивают в водяной бане при температуре 52 С в течение 52 сек. или по данным Р. Westendorf et al., [141] при 50 С до полного таяния.

При условии соблюдения всех других факторов, для успешного осеменения необходимо, чтобы общий объем разбавленной спермы был не менее 50 мл с содержанием в нем порядка 3 млрд. физиологически полноценных сперматозоидов. Из-за удаления семенной плазмы при концентрировании спермы хряков перед ее замораживанием возникает проблема достижения необходимого объема после оттаивания замороженной спермы. Эту проблему, как отметили выше, решают путем разбавления оттаянной спермы плазмой спермы хряков, снятым молоком или синтетической средой. Наиболее приемлемым для практики в технологическом и экономическом отношении является синтетическая среда. Поэтому к настоящему времени уже разработано несколько разных составов специальных сред для разбавления оттаянной спермы [47]. Однако проблема создания среды наиболее адекватной для разбавления замороженно-оттаянной спермы еще остается.


1.1.10 Теоретические основы роли низкомолекулярных тиоловых соединений спермы животных
1.1.10.1 Исследование функциональной роли сульфгидрильных групп в белковых молекулах

К настоящему времени установлена, что белковая молекула содержит разных функциональных групп. Среди функциональных групп белковых молекул выделяются высокой реакционной способностью и разнообразием своих химических реакций серосодержащие, в особенности сульфгидрильные (SН-) группы, необходимые для проявления биологической активности многих белков и поддержания их макромолекулярной структуры. Содержащаяся в белках сера принадлежит сульфгидрильной, или тиоэфирной группе метионина [142; 143; 144; 145; 146; 147; 148; 149; 150].

Ряд ферментов содержат кофакторы. К числу тиоловых кофакторов относятся глутатион, липоевая кислота, коэнзим А, простатической группой которых является 4-фосфопантетеин и эрготионеин. Роль SН-групп в этих соединениях во многих отношениях аналогична роли SН-групп цистеиновых остатков, выполняющих каталитические функции в активных центрах некоторых ферментов [151; 152; 153; 154; 155; 156; 157; 158].

По данным М. Диксона и Э.Уэбба [159] в настоящее время насчитывается свыше 110 ферментов, активность которых тормозится при блокировании содержащихся в них SН-групп. Среди них представители всех классов ферментов, катализирующих самые разнообразные превращения. Ряд исследователи подтвердили эти предположения своими экспериментами [160; 161; 162; 163; 164].

Исследователями K Bailey, S.Perry [165] было обнаружено, что взаимодействие сократительных белков –актина и миозина зависит от присутствия SH-групп в их молекулах. Работами Энгельгардт В.А., Любимова М.Н. [166] и других [167; 168; 169] показано, что АТФ –азная активность миозина и способность его взаимодействовать с актином изменяется параллельно изменениям количества SH-групп в его молекуле.

Несколько позднее исследованиями Б.Ф. Поглазова и др., [170]; Ю. М. Н.Н.Яковлева, А.Ф. Краснова [171]; Торчинского [172]; D. Сalam, S.Waley [173] было установлено, что в процессе взаимодействия миозина с АТФ последняя связывается с SH-группами миозина.

Полученными результатами А.Ленинджера [174], доказано, что сульфгидрильные группы участвуют в реакциях сопряжения окислительного фосфорилирование и по мнениям Р.Д.Озрина М.Н.Кондрашова [175]; D.Neubert, A. Leninger [176]; A. Fluarty [177]; A. Fonua, S.Bessman [178]; H. Boyer [179] и D.Тrunde [180]) играют определенную роль в проницаемости мембран митохондрий.

Впервые C. Shearer [181] установил, что половые клетки очень богаты SH-группами, и с тех пор этот факт привлекает внимание многих исследователей.

Установлены, что разновидность веществ, содержащие SH-группы, играют в половых клетках не менее важную роль, чем в других живых системах. W.Green [182]; C. Zittle, R. Odell [183]; D. Mayer и др. [184], R.Berry D.Mayer [185]) и другие считают, что роль SH-групп тиолов и белков в сперме обусловлена их участием в сложных биохимических процессах. Они обеспечивают половые клетки необходимой энергией и создающих условия для процесса оплодотворения спермиев.

Большинство ферменты, с помощью которых осуществляются дыхание и гликолиз половых клеток, являются тиоловыми. По данным Ю.М.Торчинского [186] среди них такие ключевые ферменты, как глицеральдегидфосфат- дегидрогеназа, фосфофруктокиназа, сукцинатдегидрогеназа. Ю.Г., Курило [187], T.Mann [188], H. Nozaki и др. [189], М. Диксон Э.Уэбб [190]) в эту группу включают - гиалуронидазу, участвующая в процессе оплодотворения всех дегидрогеназ, требующие в качестве кофермента НАД, аконитазу и других ферментов. Исследованиями Р.Д. Озрина М.Н. Кондрашова [191] доказано, что около 70% всех SH-групп белков митохондрий приходится на долю ферментов цикла трикарбоновых кислот и переносчиков цепи транспорта электронов и энергии

В свежеполученных половых клетках на ресинтез АТФ расходуется около 50% энергии, выделяющейся в процессе дыхания. При хранении эякулята вне организма степень разобщения дыхания и фосфорилирование увеличивается, что, возможно, является одной из причин гибели сперматозоидов [192]. H. Lardy, P. Phillips [193] считают, что многие вещества, инактивирующие сульфгидрильные группы, подавляют дыхание, гликолиз и подвижность половых клеток относятся к тиоловым cоединениям.

На основании опытов с эякулятом морского ежа E. Barron и др. [194], установили, что в половых клетках имеется два типа сульфгидрильных групп. Первый тип – это сульфгидрильные группы ферментов, состояние которых определяют ферментативную активность, а следовательно и уровень дыхания. Второй тип – сульфгидрильные группы низкомолекулярных тиолов (типа глютатиона), растворенных в протоплазме клетки и в окружающей ее среде. В соответствии с их гипотезой, по мнению А.Хавинзона [195] и А.Черкеса [196] сульфгидрильные группы второго типа регулируют активность SH-групп первого типа.

Исследованиями D. Bishop [197] установлено, что подвижность половых клеток обеспечиваются фибриллярным аппаратом, сокращения его периферических фибрилл обусловлены локализации в них сократительного белка - спермозина. Работами В.А.Энгельгардта, С.А., Бурнашевой [198], Е.Н.Битюкова, В. М. Прокопцева [199]) отмечено, как и актомиозин, спермозин обладает АТФ-азной активностью, которая, как активность всех тиоловых ферментов, ингибируется реагентами на сульфгидрильные группы.

L. Jocobsson [200], L., Nelson [201], Keutel H., Gabsch H., [202] считают, что АТФ –аза сперматозоидов сосредоточена в периферических участках, где обнаружена наибольшая концентрация SH-групп. Krampitz G. Docpfmer R., [203] установили, что SH-группы отсутствует в центральных фибриллах жгутиков сперматозоидов.

В некоторых работах приводятся данные об участии низкомолекулярных SH-групп в регуляции метаболических процессов в половых клетках. Так, H.Lardy и др. [204] изучая различия в характере метаболизма эякулированных и эпидимиальных половых клетках быка, установили, что слабое поглощение кислорода последними обусловлено наличием в них связанного «регулятора», который превращается в активную форму после эякуляции спермы.

По их данным серосодержащий «регулятор», выделенный из щелочного гидролизата семенников хряка, увеличивал скорость дыхания и аэробного гликолиза половых клеток. Хранение эякулята при комнатной температуре сопровождается выделением «регулятора» в плазму эякулята, что дает основание предполагать его участие в старении сперматозоидов. Последующими исследованиями Zardy. H., [205], Salisbury.Y., [206], Novak A Hood R. и др. [207] были обнаружено, что усиление дыхания эпидимиальных половых клетках может быть вызвано такими тиоловыми соединениями, как цистиен, восстановленный глютатион, сульфат и сульфид. На этом основании высказано предположение, метаболическим регулятором могут быть содержащиеся в эякуляте низкомолекулярные тиоловые соединения.. в частности эрготионеин

Исследования F. Haag, Y.Mcleod [208] доказано, что содержание небелковых SH-групп в плазме эякулята человека отрицательно коррелирует с подвижностью половых клеток на протяжении 5 часов инкубации, числом подвижных половых клеток и объемов эякулятов. Эти же авторы отметили обратную связь между концентрацией небелковых SH-групп в плазме эякулята жеребцов и оплодотворенностью кобыл при естественном спаривании. Однако, определение небелковых SH-групп в их опытах проводились в эякуляте, вытекающей из половых путей после спаривания, состав которой мог быть изменен примесью различной влагалищной слизи.

В своих исследованиях А.А.Сайко [209], [210] изучив содержание SH-групп в эякуляте кролика, барана, хряка и быка, предполагает, что видовая устойчивость эякулята животных при хранении зависит в определенной степени от содержании SH-групп белков в половых клетках, а не в плазме спермы, поскольку у животных с менее устойчивой спермой в плазме содержится значительно больше SH-групп, чем в сперматозоидах.

Исследователи B. Larson, W. Salisbury [211] пришли к выводу, что в плазме эякулята быка вообще нет белковых SH-групп и что активные SH- соединения обнаружены только в сперматозоидах.

Проводя методом амперометрического титрования сулемой, В.А.Наук и В.П.Кононов [212] нашли в 100 мл эякулята хряка 1390 мкМ SH-групп. Как отмечают авторы, содержание SH-групп в эякуляте хряка не зависит от концентрации в ней половых клеток. Можно предположит, что использованный авторами метод позволяет определять SH-группы только в плазме эякулята, но не в половых клетках. Следует отметить, что определение SH-групп производилось в эякуляте, разбавленном разбавителем, содержащим желток куриного яйца. Поскольку авторы не учли, что желток содержит большое количество SH-групп, полученные ими данные следует считать весьма приблизительными. Кроме того, при титровании SH-групп сулемой возникает весьма существенное осложнение в интерпретации полученных результатов. Двухвалентная ртуть способна реагировать как с одной, так и с двумя SH-группами, в зависимости от их пространственного расположение в молекуле, с образованием соединений типа RS-S-HgCl или R-S-Hg-SR, что нарушает стехиометрию реакций среды.

Применив метод амперометрического титрования азотнокислым серебром, Т.Е.Яковлев [213] установил, что в 100 мл плазмы эякулята хряков содержится 68 мкМ сульфгидрильных групп.

Глубокое исследование по определению содержания SH-групп в сперме хряков проведено Е.Н.Битюковым и В.М. Прокопцевым [214]. Исследовав эякуляты от 36 хряков, они обнаружили, что в 100 мл свежеполученном эякуляте в среднем содержится 66 мкМ (6-200) SH-групп, а в 10 млрд. половых клеток -9,7 мкМ (5,1-18,2). Авторы отмечают, что концентрация SH-групп в плазме эякулята и в половых клетках зависит, прежде всего, от индивидуальных особенностей хряков, причем, концентрация SH-групп в плазме колеблется больше, чем в половых клетках. В частности, при интенсивном половым использовании хряков параллельно с ухудшением качества эякулята концентрация SH-групп в плазме эякулята резко снижается, а в половых клетках остается постоянной. Инкубация эякулята в анаэробных условиях при 37⁰ приводит в среднем через 11 часов к прекращению поступательной подвижности половых клеток. За этот период содержание SH-групп в плазме снижается - на 11%, а в сперматозоидах – на 30%.

Исследование взаимосвязи между содержанием SH-групп в плазме эякулята и активностью общих дегидрогеназ установлена отрицательная корреляция (η _х²=0,50), а между их концентрацией в половых клетках и активностью дегидрогеназ – положительная (η _х²=0,74). Активность АТФ-азы положительно коррелирует с содержанием SH-групп эякулята (η _х²=0,67). Установлено, что чем больше SH-групп в плазме эякулята, тем выше переживаемость половых клеток, а между содержанием SH-групп в половых клетках и их абсолютного показателя живучести, обнаружена криволинейная (η _х²=0,80) зависимость.

Наибольшим абсолютным показателем живучести отличаются половые клетки со средней концентрацией SH-групп. Уровень SH-групп в плазме эякулята и половых клетках влияет на оплодотворяемость и плодовитость свиноматок. В итоге проведенных исследовании авторы пришли к заключению, что концентрация SH-групп в эякуляте хряков является чувствительным индикатором ее качества и считают, что эякулят, содержащей в 10 млрд. половых клеток менее 7 мкМ SH-групп, непригодным для искусственного осеменения свиноматок [214].

Проводя обширные исследования E. Leone [215]; [216] пришел к выводу, что из низкомолекулярных тиоловых соединений, встречающихся в эякуляте, важную роль играет эрготионеин, выделенный из секрета пузырьковидных желез хряк- производителей. По его данным содержание эрготионеина в пузырьковидной железе хряков составляет в среднем 70 (19-256) мг%, а в эякуляте -15-20 мг%. Второе место по количеству эрготиониена среди производителей сельскохозяйственных животных принадлежит спермиям жеребца, который содержит 8,3-9,9 мг% в цельном эякуляте, а в секрете ампульных желез - 8,3-115 мг%. Эргетиониен в небольшом количестве содержится также в эякулятях барана и быков.

Путем скармливания эрготионеина S³⁵ животным установлено, что некоторое его количество экскретируется в эякуляты. По предположению H.Heath и др. [217] большая часть эрготионеина в организме животных экзогенного происхождения, однако, биосинтез незначительного количества в организме авторами не исключается. По-видимому, отдельные животные имеют различную способность усваивать и накапливать эрготионеин в организме. Это мнение основано на достоверных различиях в содержании SΗ- групп в плазме эякулята, которое наблюдается между эякулятами отдельных хряков, находящихся в одинаковых условиях кормления, содержания и использования [218].

Имеется мнение, что содержание сульфгидрильных групп в плазме эякулята имеет индивидуальное различия. Это обусловлено различным содержанием в ней эрготионеина. По данным Т.Mann [188] в 100 мл эякуляте хряка содержится 66,5 мкМ сульфгидрильных групп. Эта величина хорошо согласуется последующими исследованиями Е.Н. Битюкова и В.М. Прокопцева [214] которые нашли, что в 100 мл плазмы эякулята хряков-производителей содержится 66,2±2 мкМ сульфгидрильных групп.

Имеется данные о наличии в сперме и других тиоловых соединений. Наличие в сперме человека одного из наиболее распространенных тиолов – глютатиона в количестве 30 мг% впервые показал C. Infantellina [219]. Используя для определения глютатиона кадмиевый метод, В.А.Наук и В.П.Кононов [220] нашли, что в эякуляте хряка содержится 28,1мг% восстановленного и 1,5мг% окисленного глютатиона, а в эякуляте барана - 58 мг% восстановленного и 3 мг% окисленного глютатиона в 1 млрд. половых клетках. Применяя аналогичный метод, Хавинзон А.Г., [221], [222] обнаружил в эякуляте хряка 25,35мг% общего глютатиона (окисленного и восстановленного).

Более поздными исследованиями установлено R.Slaweta [223], что уровень эндогенного глютатиона в эякуляте быков находится на уровне 28 нмоль на 10⁹ клеток, а в плазме -26 мкМ/мкл. Высокий уровень восстановленного глютатиона в эякуляте быков, по мнению автора, связан со значительной активностью глютатионпероксидазы, находящейся в плазме эякулята. Установлена существенная положительная корреляция между уровнем глютатиона в половых клетках и количеством половых клеток с аномальной акросомой и утечкой из сперматозоидов аспаратаминотраноферазы. Обнаружена существенная отрицательная корреляция между уровнем восстановленного глютатиона в плазме эякулята и количеством половых клеток с аномальной акросомой из половых клеток аспаратаминотрансферазы. Эти же авторы показали, что сезон года сказывает значительное влияние на концентрацию глютатиона как в сперматозоидах, так и в плазме спермы.

1.1.10.3 Теоретические предположении о возможности использования тиоловых соединений для хранения и замораживания спермы животных

Ряд исследователи пытались использовать свойства сульфгидрильных групп для регуляции метаболизма сперматозоидов и улучшения качества эякулята с помощью различных разбавителей и тем самым улучшить технологию искусственного осеменения сельскохозяйственных животных путем продления способности оплодотворяющей способности сперматозоидов.

Впервые для этой цели был использован восстановленный глютатион. По данным H.Lardy, P.Phillips [224] восстановленный глютатион, не оказывает действия на синтез молочной кислоты сперматозоидов быка. В эксперименте были использованы половые клетки быка, отмытые от плазмы ресуспендированные в Рингер –фосфат-глюкозной среде. H.Lardy, P.Phillips [224] испытали действие на производство молочной кислоты добавок глютатиона в концентрации от 0,0002 до 0,003 моли.

Применив желточно -цитратный разбавитель с 0,05% цистеином, или 0,125% восстановленным глютатионом, для хранения половых клеток быков в течение 72 часов при температуре 4⁰С, J.Nadroo и другие [225] не установили разницы в качестве живучести сперматозоидов.

По данным Битюкова Е.Н. и Прокопцева В.М., [214] введение в эякуляты хряков восстановленного глютатиона увеличивало ее переживаемость и оплодотворяющую способность сперматозоидов. Известно, что коровье молоко после нагревания может использоваться для разбавления эякулята сельскохозяйственных животных [226]. R.Flipse и др. [227] установлено, что непрогретое молоко содержит антистрептококковое вещество лактеин, которые токсичны для половых клеток животных. I.Hutton Poton S. [228] нашли, что при нагревании выше 80⁰С SH- группы молока активируются и подавляют токсичность лактеина и становится пригодным для разбавления спермы животных.

Royd B. и др. проводя опыты с тиогликоевой кислотой [229] установили, что добавление к молоку реагента равноценно нагреванию до 92⁰С. Такой же эффект с цистеином и глютатионом получен Jonhson L. [230] и другими исследователями [231]; [232]; [233]; [234] . При добавлении их к сперме быков, также улучшилась абсолютный показатель живучести сперматозоидов.

Предположение относительного изменения сульфгидрильных группы при замораживании спермы производителей в литературе имеются различные противоречивые взгляды [214]; [235]; [236]; [237]; [238]; и [239].

В частности Е.Н. Битюков [214] наблюдал, что замораживание нативной спермы хряков или отмытых от плазмы сперматозоидов а жидком азоте и последующее оттаивание приводит к необратимому прекращению подвижности сперматозоидов, значительному снижению активности дегидрогеназ и уменьшению определяемого количества сульфгидрильных групп в половых клетках в среднем 34%. Уменьшение определяемого количества SH- групп в половых клетках под влиянием замораживания зависит от исходного содержания этих групп в гаметах.

В то же время А.Г.Нарижный [235] утверждает, что в процессе технологической обработки эякулята при замораживании содержание SH- групп в нем остается практически неизменным.

Я.И.Профиров и др. [240] проведены исследование количественного содержания SH- групп в плазме эякулята и мембранах половых клеток баранов при замораживании в жидком азоте (196 ⁰С). Перед замораживанием эякуляты баранов их разбавляли в соотношении 1:2 0,25М сахарозой. Мембраны изолировали из свежеполученных и замороженных половых клеток. Авторами установлено, что около 96% от общего содержания сульфгидрильных групп эякулята баранов находятся в клетках и только 4% в плазме спермы. Причем 97-98% SH- групп половых клеток и плазмы связаны с протеином и всего лишь 2-3% встречаются в свободном ( несвязанном) виде.

Общее количество сульфгидрильных групп в цельном свежеполученном эякуляте баранов составило 21 мМ/мг, а в мембранах половых клеток - 147 мМ/мг белка, т.е. в 7 раз больше. По их мнению, замораживание вызывает уменьшение общего количества сульфгидрильных групп в эякуляте, в основном связанных с белком спермы. В мембранах снижение количества SH- групп происходит еще в большей степени. Авторы предполагают, что уменьшение количества сульфгидрильных групп в эякуляте и особенно в мембранах сперматозоидов при замораживании связано с криоповреждением половых клеток.

В целом. анализ приведенных выше литературных данных, несмотря на их противоречивость, позволяют сделать вывод о важной роли сульфгидрильных групп в метаболических процессах живых клеток, в том числе и сперматозоидах производителей.

Учитывая положительные теоретические стороны этих исследовании и с для совершенствования технологию искусственного осеменения свиней, нами решено провести детальное исследования сульфгидрильных групп спермы хряков-производителей, определить наличие или отсутствие связей между уровнем SH- групп и качеством спермы, изучить влияние тиоловых реагентов на жизнеспособность и оплодотворяющую способность спермиев с тем, чтобы использовать полученные результаты для разработки новой среды для криоконсервации спермы хряков производителей.