Мусабеков айдос туменбаевич
жүктеу/скачать 3.93 Mb.
|
Таким образом из изученных тиоловых реагентов (цистеамин, цистеин и меркаптоэтанол) наиболее положительное влияние на сперматозоиды хряков оказал β-меркаптоэтанол. При добавлении этого реагента к консервирующей глюкозо-хелато-цитратно-желточно-калиевую среду у сперматозоидов после оттаивании, обнаружено достаточно высокая функциональную полноценность и пригодность к использованию для осеменении свиноматок. 
Рисунок 7- Влияние β-меркаптоэтанола на качественные показатели спермы 3.3.2 Влияние унитиола на активность и абсолютную показатель живучести криоконсервированных сперматозоидов Ранее нами указано, что (раздел 3.1.2), что унитиол в широком диапозоне концентрации увеличивает абсолютную показатель живучести сперматозоидов при кратковременном хранении спермы хряков. Реагент снижает число сперматозоидов с поврежденными акросомами, стабилизирует содержание сульфгидрильных групп гамет и плазмы спермы, сохранности активности тиоловых ферментов и увеличивает абсолютный показатель живучести и оплодотворяющую способность сперматозоидов. На основании вышеуказанных положительных влиянии реагента ан сперму хряков нами принято решение об изучении влияние унитиола на сохранность функциональной полноценности заморожено-оттаянной спермы хряков. Влияние унитиола на активность и время переживания сперматозоидов при замораживании исследовались в концентрациях 0,014%; 0,021%; 0,028% и 0,035%. Полученные результаты по влиянию унитиола на активность и абсолютную показатель живучести криоконсервированных сперматозоидов приведены в таблице 47. Результаты исследования показывают как в таблице 47, что активность сперматозоидов замороженного в среде с унитиолом, после оттаивания значительно выше, чем в контроле. Таблица 47- Влияние унитиола, добавленного в среду ГХЦЖК на активность и абсолютную показатель живучести (АПЖ) сперматозоидов после их замораживания-оттаивания
Достоверное увеличение активности сперматозоидов наблюдается под воздействием унитиола в концентрациях 0,014; 0,021; 0,028%. Наибольший процент подвижных сперматозоидов после замораживания-оттаивания спермы получено при использовании унитиола в концентрации - 0,021%. Очень важным показателем жизнеспособности сперматозоидов является абсолютный показатель живучести, так как этот показатель высоко коррелирует с оплодотворяющей способностью половых клеток. Абсолютный показатель живучести сперматозоидов, после замораживания-оттаивания в среде с унитиолом (при всех испытанных концентрациях), тоже выше времени переживания чем в контроле. Наибольшее увеличение абсолютного показателя живучести (138%) наблюдается при концентрации унитиола 0,021%. Еще большая разница между опытом и контролем обнаруживается при учете абсолютного показателя живучести сперматозоидов, до сохранения подвижности 5% половых клеток (табл. 48). При концентрации унитиола 0,021% эта разница составляет 85,9%. Концентрация унитиола 0,014% хотя и увеличивает количество выживших после замораживания-оттаивания клеток, достоверного увеличения абсолютную показатель живучести гамет их (до потери подвижности) не вызывает. Действие же унитиола в концентрации 0,035% достоверно увеличивает только абсолютную показатель живучести гамет (рис. 8).
Рисунок 8- влияние различных разбавителей на сперму хряков Анализ таблицы 48 показывает, что после криоконсервации активность сперматозоидов с унитиолом выше на 0,2 балла или 6,6%, соответственно абсолютный показатель живучести на 1,1 часа или 42,3%; сохранность сульфгидрильных групп у сперматозоидов больше на 10,7 %; число поврежденных акросом ниже на 10,6%. В среде с унитиолом активность общих дегидролгеназ равна 45,8±3,35 мин, следовательно у гамет обменные процессы протекает более замедленном режиме. Таким образом, полученные данные в ходе исследования показывают, что тиоловое соединение - унитиол способен сохранять целостность структурных элементов половых клеток, от воздействия сверхнизких температур и вполне может быть использован при разработке новой среды для криоконсервации половых клеток хряков-производителей, 3.3.3 Изучение влияние дитиотреитола на функциональную полноценность заморожено-оттаянной спермы хряков Экспериментальные работы по исследованию влияния тиоловых соединений на устойчивость сперматозоидов при замораживании-оттаивании спермы хряков-производителей проведены в широком диапазоне концентраций реагентов. Так в частности - цистеамин 10-2 -10-6М, цистеин 10-2 ... 10-7М и меркаптоэтанол - 10-2 - 3·10-4 М. Опыты проводили на расщепленных эякулятах: эякулят делили на несколько частей и разбавляли средой ГХЦЖКМ с добавлением тиолового соединение, в испытываемых концентрациях. Контролем служила та же среда без тиоловых соединений. Как видно из таблицы 49, антиоксидант дитиотреитол при хранении половых клеток 37°С оказывает определенное защитное влияние на замороженно-оттаянной сперматозоиды хряков. Наиболее положительное криозащитное действие получено при внесении дитиотреитола в концентрации 1·10-5 М. При указанном концентрации активность заморожено-оттаянных сперматозоидов находились на уровне 5,0-5,1 баллов, у 70-71% сперматозоидов акросомы были неповрежденными, а абсолютный показатель живучести сперматозоидов (при 37°С) достигло 80,2-81,3 усл. ед.
Влияние дитиотреитола на активность и абсолюную показатель живучести (АПЖ) сперматозоидов после их замораживания-оттаивания при хранении в условиях +18°С представлены в таблице 50. Все иученные концентрации реагента (1·10-2 -1·10-7 М) оказали положительное влияние на криоконсервированной сперме хряков. Но особо криустойчивость половым клеткам оказали концентрация дитиотреитола 1·10-4 -1·10-5 М. При этих дозах реагента активность и абсолюную показатель живучести (АПЖ) сперматозоидов после их замораживания-оттаивания повышаются на 25,1 – 27,3%. В следующей серии экспериментов, таблица 51, изучено совместимость дитиотреитола со средой ГХЦЖК. После добавления дитиотреитола (в концентрации 1·10-5 М) в среду ГХЦЖК скорость движения сперматозоидов составила в среднем 96,2 мкМ/с или примерно на уровне контрольной группой. Дитиотреитол заметно улучшает абсолютный показатель живучести гамет. Так в частности в опытных образцах на в среднем составила 3,4 ч. или выше на 36.0%. Таблица 50-. Влияние дитиотреитола на активность и абсолюную показатель живучести (АПЖ) сперматозоидов после их замораживания-оттаивания
Таблица 51- Влияние дитиотреитола (1·10-5 М), добавленного в среду ГХЦЖК на функциональную полноценность заморожено-оттаянной спермы хряков
Обнаружено также, что при добавлении дитиотреитола достаточно на высоком уровне сохраняются и внутриклеточных сульфгидрильных групп (70,4%). С дитиотреитолом активность общих дегидролгеназ особо не изменются, в то же время активность цитохромоксидазы увеличивается более чем в 2 раза. Таким образом, добавленние дитиотреитола в среду ГХЦЖК положительно влияют на сохранения функциональной полноценности спермы хряков, следовательно. реагента можно использовать при разработке новой среды для криоконсервации эякулятов в качестве одного из криопротекторов. 3.3.4 Исследования совместного действия мочевины и унитиола на функциональную полноценность заморожено-оттаянной спермы хряков Учитывая, что предедующих исследованиях у оттаянных сперматозоидов наибольшее увеличение подвижности было получено при введение в среду мочевины, а увеличение абсолютного показателя живучести - под воздействием унитиола, принято решение по изучению совместного влияния этих веществ на половые гаметы хряков. Эксперименты проведены в двух вариантах: первый - на эякулятах разбавленных средой с унитиолом и мочевиной в отношении 1:1 и второй - на сперматозоидах отделенных от плазмы с полной заменой ее средой с унитиолом и мочевиной (ГХЦЖКУМ). Результаты опытов представлены в таблице 52. Как следует из этой таблицы, все концентрации мочевины в сочетании с унитиолом дают достоверное повышение активности и абсолютный показатель живучести сперматозоидов. Однако, наиболее высокие результаты по времени переживания сперматозоидов при температуре +37 С после замораживания-оттаивания наблюдается при концентрациях мочевины 0,30%. Отделение плазмы благоприятно сказывается на активности и времени переживания сперматозоидов после оттаивания. Процент подвижных клеток также выше в сперме, замороженной после удаления плазмы и замены ее разбавителем, чем в разбавленной 1:1. Так, при сочетании унитиола в концентрации 0,014% и мочевины 0,30% в сперме, замороженной без отделения плазмы, количество перенесших замораживание сперматозоидов составляет 29% (2,9 балла) против 20% (2,0 балла) в контроле без мочевины и унитиола; ВП сперматозоидов увеличивается от 1,7 часа в контроле до 2,3 часа в опыте или на 35%. При замораживании в этой же среде сперматозоидов, отделенных от плазмы, процент подвижных клеток достигает 44%, т.е. более чем в два раза превышает подвижность сперматозоидов в контрольной среде (ГХЦЖК) с плазмой. Абсолютный показатель живучести клеток при этом увеличивается до 5,06 часа против 1,7 часа в контроле, что составляет 197,6%. При сравнении с контрольным вариантом, где сперматозоиды также отделены от плазмы, увеличение абсолютного показателя живучести составляет 156%. При сочетании концентраций мочевины: 0,15; 0,30; 0,45% с 0,028% унитиола результаты опытов с разбавленной спермой достоверно не отличается от результатов при сочетании 0,014% унитиола с вышеназванными концентрациями мочевины. Однако в опытах со сперматозоидами, отделенными от плазмы (с заменой ее на среду), при концентрациях 0,028% унитиола и 0,30% мочевины, время переживания клеток выше чем в среде с концентрацией унитиола 0,014% и мочевины 0,30% и составляет 6 часов, что более чем в 3,5 раза превышает абсолютный показатель живучести контрольных сперматозоидов, не отделенных от плазмы, и на 87% выше, чем в контроле с отделенной плазмой. Активность сперматозоидов после оттаивания при этом составляет 4,8 балла (48%) против 2,0 балла (20%) в первом контроле и 2,6 балла (26%) - во втором (табл. 53). Если учитывать абсолютный показатель живучести сперматозоидов по сохранению подвижности 5% клеток, то видно, что в данном случае концентрация мочевины 0,30% в сочетании с 0,028% унитиола дает наилучший эффект увеличение абсолютного показателя живучести равный 3,6 часа, что выше времени переживания, учитываемого по полному прекращению подвижности в контрольных вариантах. Изучено влияние совместного введение унитиола и мочевины в среду ГЦХЖК на функциональную полноценность заморожено-оттаянной спермы хряков (табл.54). По сравнению с контролем при совместном ведении реагентов абсолютный показатель живучести увеличиваются на 36,0%, сохранности сульфгидрильных групп на 13,2 %, число поврежденных акросом уменшаются на 34,2% и активность цитохромоксидазы повышаются на 111,7% (рис 9). 
Рисунок 9- Влияние совместного введение унитиола и мочевины в среду ГЦХЖК на функциональную полноценность заморожено-оттаянной спермы хряков Таблица 52 Совместное влияение унитиола и мочевины в среде ГЦХЖК при замораживании спермы хряка на активность и абсолютный показатель живучести сперматозоидов после оттаивания
Таблица 53- Абсолютный показатель живучести сперматозоидов (по сохранению 5% подвижности) в среде с унитиолом и мочевиной без плазмы после замораживания –оттаивания
Таблица 54- Влияние совместного введение унитиола и мочевины в среду ГЦХЖК на функциональную полноценность заморожено-оттаянной спермы хряков
Таким образом изменение состава среды введением унитиола в концентрации 0,028% и мочевины 0,30% позволяет повысить процент подвижных клеток и абсолютный показатель живучести после замораживания-оттаивания. Улучшение функциональную полноценность заморожено-оттаянной спермы хряков дали нам основание включить этих веществ, в состав разрабатываемой новой среды для криокнсервации спермы хряков. 3.3.5 Исследование влияния тиоловых соедиенеий на некоторые структурно-метаболические показатели заморожено-оттаянной сперматозоидов Для выяснения механизма действия тиоловых соединений на криоустойчивость сперматозоидов и определения направления для дальнейшего совершенствования технологии замораживания было исследовано влияние тиоловых соедиенеий на структурно-метаболические показатели гамет хряков. После замораживания-оттаивания у сперматозоидов оценивали сохранность акросом, ферментов лактатдегидрогеназы и цитохромоксидазы. Наряду с этим также определяли интенсивность дыхания и состояние дыхательной цепи. Как видно из таблицы 55 унитиол, дитиотреитол и меркаптоэтанол достоверно снижает долю сперматозоидов с поврежденной акросомой. Таблица 55- Влияние тиоловых соедиений на сохранность акросом после замораживания и оттаивания спермы
При добавлении в среду дитиотреитола и унитиола сохранность акросом сперматозоидов находится на уровне 79,12-79,14%, что выше чес в контроле на 7,8-8,0% (табл. 55). Анализ полученных результатов (рис. 10) показал, что цистеин не защищает акросому сперматозоидов хряка от повреждающего действия замораживания-оттаивания. Кроме того цистеина не оказывает защитного влияния и на сохранность в сперматозоидах фермента лактатдегидрогеназы (табл. 56). Не отличалась активность лактатдегидрогеназы от контроля и в пробах замороженных с меркантоэтанолом. Обнаружено также, что по сравнению с контролем унитиол и дитиотреитол достоверно увеличивает сохранность фермента сперматозоидов. Исследование активности цитохромоксидазы измеряемой по времени развития окраски показало, что все тиоловые препараты уменьшают активность данного фермента, участвующего в терминальном участке дыхательной цепи. Наибольшее снижение активности, более 10 раз, наблюдалось в пробах замороженных с меркаптоэтанолом (табл. 56). Повидимому такое снижение активности (ингибирования) цитохромоксидазы связано с переключением дыхания преимущественно на аэробный гликолиз. В контрольном опыте было установлено, что используемые в опытах тиоловые соединения обладают гипоксическим действием. Скорость поглощения кислорода из среды унитиолом, дитиотреитолом и меркаптоэтанолом составляет 2...4 натомов О2 в мин. 
Рисунок 10- Влияние тиоловых соедиений на сохранность акросом Таблица 56- Активность лактатдегидрогеназы и цитохромоксидазы в замороженно-оттаянной сперме хряков с тиоловыми соединениями
3.3.6 Влияние тиоловых соединений на показатель энергетического обмена в сперме хряков на разных этапах замораживания Энергетические основы подвижности сперматозоидов были разработаны советскими и иностранными учеными (Маnn Т.[34], Энгельгардт В., Яровая Г.А. [167]). Исследователи показали, что центральная роль в энергетике принадлежит аденозинтрифосфату. Содержание АТФ является важным фактором в регуляции движения сперматозоидов. По данным Л.Г. Мороз и др. [90], содержание АТФ в сперме быка и барана 8,7 и 8,6 мг в 100мл, а в сперме хряка - 3,3 мг. Показан параллелизм между содержанием АТФ и подвижностью спермиев. Количество АТФ, быстро расходуемого в процессе движения сперматозоидов, поддерживается на постоянном уровне с помощью двух взаимосвязанных процессов - гликолиза и дыхания. Следует напомнить, что гликолитический процесс слагается из ряда последовательных ферментативных реакций, в результате которых глюкоза оказывается расщепленной на две молекулы молочной кислоты. Определение АТФ в образцах сперматозоидов. Эксперименты проведены на сперме хряков крупной белой породы. В связи с отсутствием АТФ в семенной плазме, предварительное отделение сперматозоидов от плазмы не проводилось. Экстрагирование АТФ из сперматозоидов проводилось по методу Л.Г. Мороз с соавторами [233]. Для этого из каждого образца спермы отбирали пробу объёмом 0,05 мл и добавляли в неё 0,45 мл диметилсульфоксида. После 20 минутной экстракции при комнатной температуре определяли содержание АТФ биолюминисцентным методом с помощью портативной люминометра ЕМILIТЕ-1003А. Для проведения анализа в кювету люминометра помещали 0,5 мл АТФ реагента, содержащей иммобилизированную люциферазу светляков, люцеферин, соль магния, компоненты буферной смеси и стабилизаторы, и регистрировали фоновое свечение. Затем в кювету вводили экстрагированный образец спермы в объеме 0,1 мл и регистрировали приращение интенсивности свечения (I обр.). Для проведения внутренней калибровки, в ту же кювету вводили 0,1-0,2 мл стандартного раствора АТФ и регистрировали приращение сигнала. Расчет концентрации АТФ в образце проводили по формуле:
где: Vст. и Vобр.- объём соответственно стандарта АТФ и образца, АТФ ст.- концентрация АТФ в стандарте. Содержание АТФ в сперматозоидах животных напрямую коррелирует с их подвижностью и оплодотворяющей способностью (Ерохин А.С. и др [55], Foulkes J.А. [75], Кichev G. [76], Wilmut I. е.а. [86]). В связи с совершенствованием методов криоконсервации спермы хряков представляет несомненный практический интерес изучение динамики содержания АТФ в сперматозоидах под влиянием глубокого замораживания в зависимости от методов криоконсервации. Результаты эксперимента по изучению содержания АТФ в сперматозоидах хряков представлены в табл. 57. Из этой таблицы видно, что в процессе замораживания-оттаивания происходит резкое снижение уровня АТФ в сперматозоидах хряков. Через 5 минут после оттаивания уровень АТФ снизился на 37,7% по сравнению с нативными образцами.
Наряду с этим также уменьшилось на 54,4% подвижность сперматозоидов и 39,8% число сперматозоидов с поврежденной акросомой. Дальнейшая инкубация оттаянных образцов при 37°С способствовала значительному снижению подвижности и содержания АТФ в сперматозоидах. Через 2 часа после оттаивания содержание АТФ в сперматозоидах снизилось в 5,15 раза по сравнению с начальным уровнем (Р<0,01). Следовательно, в процессе замораживания-оттаивания в сперматозоидах хряков происходят значительные деструктивные изменения мембранных структур, в результате чего происходит быстрый гидролиз АТФ под действием ферментов, которые содержатся в клетках и семенной плазме. Нами, изучено влияния на уровень АТФ в сперматозоидах в различных способах разбавления спермы хряков перед замораживанием, представлено в таблице 58. Анализ таблицы 58 показывают, что способ разбавления спермы перед замораживанием оказывает определенное влияние на содержание АТФ в сперматозоидах после замораживания-оттаивания и на их подвижность. Так, сразу после разбавления содержание АТФ в пробах с диализной обработки была выше контроля на 6,5 нмоль/108кл (или выше на 12,5%). Более лучшая сохранность АТФ при диализной обработке наблюдается и после криоконсервации-оттаивания спермы хряков. Таблица 58- Влияние способа разбавления спермы перед замораживанием на содержание АТФ в сперматозоидах
Разница по содержанию АТФ между общепринятым методом разбавление спермы и диализной обработкой составила через 5 мин. после оттаивания - 3,4 нмоль/108кл (или выше на 12,1%), Эт разницы наблюдается до двух часов после оттаивания спермы хряков. В частности через 60 мин. - 1,8 и через 120 мин. – 1,6 нмоль/108кл (или выше на 13,5%). Таким образом, при диализной обработке выявлено более высокое удержание АТФ по сравнению с общепринятым способом разбавления. В диализной группе также отмечено менее резкое снижение подвижности оттаянных сперматозоидов. Поученные данные свидетельствуют о том, что диализный метод разбавления спермы хряков способствует более эффективной защите сперматозоидов в процессе их криоконсервации. Вероятно, это объясняется лучшими условиями стабилизации мембранных структур сперматозоидов в процессе эквилибрации. Кроме того, при этом из состава спермы могут удаляться низкомолекулярные компоненты, оказывающие биодеструктивное влияние на мембраны сперматозоидов. Таким образом, проведенные лабораторные и производственные эксперименты в свиноводческих хозяйствах Южного Казахстана свидетельствуют, что диализный метод разбавления спермы хряков перед замораживанием оказывает больший криозащитный эффект на половые гаметы в сравнении с общепринятым методом разбавления эякулятов. Влияние тиоловых соединений на показатель энергетического обмена в сперме хряков на разных этапах замораживания представлены в таблице 59.
Таблица 59- Влияние тиоловых соединений на показатель энергетического обмена в сперме хряков на разных этапах замораживания
Анализ таблицы 59 показывают, что в целом тиоловые соединение способствуют сохранению более высокой степени АТФ в сперме. Другой причиной снижения активности цитохромоксидазы в пробах с меркаптоэтанолом является усиление свободного окисления не связанного с синтезом АТФ, что видно по низкой величине стимуляции дыхания с ДНФ, VДНФ/ Vсукц =1,47 против 1,7 в контроле. Доля свободного окисления в пробах спермы разбавленной средой содержащей меркаптоэтанол возрастает уже при охлаждении спермы до +40С перед ее замораживанием. Величина стимуляции дыхания ДНФ после эквилибрации по сравнению со стимуляцией дыхания свежеразбавленных сперматозоидов падает от 3,40 до 2,70. В то же время унитиол оказал значительное защитное действие на сохранность сопряженности дыхания с фосфорилированием. Как видно из таблицы 59 величина стимуляции дыхания сперматозоидов с ДНФ - (VДНФ/Vсукц) в сперме разбавленной средой с унитиолом выше контроля и после эквилибрации 3,01 против 2,90, и после замораживания-оттаивания - 1,78 против 1,69. 3.3.7 Влияние унитиола на общую активность и изоферментный спектр лактатдегидрогеназы Полученные ранее данные показали что, введение унитиола в среду ГХЦЖК при замораживании спермы хряков увеличивает абсолютный показатель живучести сперматозоидов и обеспечивает сохранность лактатдегидрогеназы сперматозоидов хряка после их замораживания-оттаивания лучше, чем другие тиоловые соединения. Поэтому в следующей серии экспериментов поставлена задача - изучение влияние унитиола на активность лактатдегидрогеназы и ее изоферменты. Опыты были поставлены в конце февраля и начале марта на хряках крупной белой породы. Эякуляты семени от опыта к опыту сильно отличались друг от друга по объему и концентрации сперматозоидов. В связи с этим к каждому варианту опыта ставили свой контроль. Результаты опытов по изменению общей активности лактатдегидрогеназы и ее изоферментного спектра при разбавлении спермы средой, после эквилибрации и замораживания-оттаивания представлены в таблице 60. Анализ таблицы показывают, что при разбавлении спермы средой с унитиолом (0,028%) - ГХЦЖКУ (опыт) происходит увеличение активности фермента как в сперматозоидах так и плазме. В частности активность ЛДГ в сперматозоидах после разбавления спермы средой ГХЦЖК (контроль) равна 6,74 мкМ пировиноградной кислоты на 109 клеток. Унитиол (среда ГХЦЖКУ) увеличивает активность фермента в сперматозоидах до 7,99 мкМ, что на 18,5% выше активности, чем в контроле (P<0,01). В плазме спермы опытной группы активность лактатдегидрогеназы составило - 2,85 мкМ, а контроле - 4,81 мкМ. Достоверность полученных результатов Р=0,01. После эквилибрации спермы при температуре +5 С в течение трех часов происходит значительное снижение активности фермента в сперматозоидах: в среде ГХЦЖК до 5,44 мкМ и в среде ГХЦЖКУ (опыт) до 5,70 мкМ. После замораживания-оттаивания спермы активность лактатдегидрогеназы сперматозоидов в контроле снижается до 3,71 мкМ. Это составляет - 55% от активности фермента после разбавления спермы. Значительное (на 33%) снижение активности лактатдегидрогеназы после замораживания наблюдается и в опытном варианте. Но разница активности между опытным и контрольным вариантами в этом случае больше 38% по сравнению с разницей в свежеразбавленной сперме (19%). Это свидетельствует, что выход фермента из сперматозоидов и ее инактивация в среде с унитиолом (ГХЦЖКУ) на 19% меньше чем в контрольной среде (ГХЦЖК). Установлено что, активность лактатдегидрогеназы в плазме спермы после замораживания-оттаивания возрастает. Так это увеличение на 1 мл плазмы в контроле составило 3,3 мкМ и в опыте 3,4 мкМ. Электрофоретическое разделение лактатдегидрогеназы на отдельные изоферменты показало, что активность ЛДГ4 и ЛДГ5 значительно превышает активность остальных изоферментов и в сперматозоидах и в плазме спермы. После разбавления спермы средой ГХЦЖК (контроль) активность ЛДГ4 и ЛДГ5 в сперматозоидах составило соответственно 33,4 и 44,9% от суммарной активности всех изоферментов лактатдегидрогеназы (табл. 28). Разбавление спермы средой с унитиолом (0,028%) вызывает некоторое изменение процентного соотношения изоферментов. При этом, по сравнению с контролем наблюдается увеличение активности изофермента ЛДГ2 в сперматозоидах. Активность ЛДГ1, ЛДГ3, ЛДГ4 и ЛДГ5 достоверно не меняются как в контроле, так и в опытных группах. После эквилибрации процентное соотношение изоферментов в опытной среде ГХЦЖКУ, не отличается от соотношения в контрольной среде. Замораживание-оттаивание вызывает уменьшение активности ЛДГ1 в среде ГХЦЖК, а в опыте наблюдается снижение соотношения изоферментов ЛДГ1 и ЛДГ3 сперматозоидов по сравнению с их активностью после разбавления семени. Активность ЛДГ4 и ЛДГ5 в среде с унитолом после замораживания достоверно не отличается от активности остальных групп. В плазме спермы хряков соотношение активности изоферментов после разбавления, эквилибрации и замораживания достоверно не меняется. Рассматривание активности изоферментов выраженную в мкМ пировиноградной кислоты от общей активности ЛДГ представлены в табл. 29. Анализ таблицы 61 показывают, что при разбавлении спермы средой ГХЦЖКУ наблюдается увеличение активности всех изоферментов лактатдегидрогеназы по сравнению с контролем. Увеличение ЛДГ1 составило на - 2,5%; ЛДГ2 - 46,7%; ЛДГ3 - 29,1%; ЛДГ4 - 18,2% и ЛДГ5 на 19,1%.
ГХЦЖК (контроль) и ГХЦЖКУ (опыт)
Наблюдается значительное снижение активность изоферментов после замораживания-оттаивания во всех группах (табл. 61). Однако следует заметить что, по сравнению с контрольной средой, в среде с унитиолом выше активность изоферментов сперматозоидов после замораживания-оттаивания. Так, активность изоферментов сперматозоидов ЛДГ1 на 8,7%; ЛДГ2 - 57,8%; ЛДГ3 - 24,2%; ЛДГ4 - 27,4% и ЛДГ5 на 49,3%. При сравнении этих разниц с разницами в активности изоферментов сперматозоидов после разбавления свежеполученной спермы можно обнаружить, что у криоконсервированной сперматозоидов значительно снижается некоторые изоферменты лактатдегидрогеназы. Эти разницы составляют по активности ЛДГ1 от 22,5% до 8,7%. В то же время у изоферменты лактатдегидрогеназы ЛДГ5 наблюдается увеличение этой разницы от 19,1% свежеполученного до 49,3% после замораживания-оттаивания. Это свидетельствует о том, что “анаэробный” изофермент ЛДГ5 при замораживании-оттаивании сперматозоидов в среде с унитиолом сохраняется лучше чем “аэробный” изофермент лактатдегидрогеназы ЛДГ1. Несколько иная картина наблюдается с изоферментами плазмы спермы. После разбавления со средой ГХЦЖКУ в плазме спермы в опытных группах наблюдается увеличение активности изоферментов ЛДГ1, ЛДГ4 и ЛДГ5 Однако после замораживания-оттаивания сперматозоидов достоверной разницы между активностью изоферментов лактатдегидрогеназы между группами не наблюдается.
Исследование влияние совместного введения в среду унитиола и мочевины на активность лактатдегидрогеназы и ее изоферментов проведены в весенние периоды. В среду добавляли унитиола концентрации 0,028%, а мочевину 0,30%. Результаты опытов представлены в таблицах 30 и 31. Замечено, что сезоны года в определенной степени влияют на активности лактатдегидрогеназы и ее изоферментов. По сравнению с другими сезоанми года весенние периоды активность лактатдегидрогеназы и ее изоферментов ниже, особенно у изоферментов - ЛДГ1; ЛДГ2 и ЛДГ3 (табл. 61). Из анализа таблицы видно, что общая активность ЛДГ сперматозоидов и плазмы у свежеразбавленных в опытной среде значительно выше, по сравнению с контрольным вариантом. Активность ЛДГ сперматозоидов в опыте составляет 9,02 мкМ против 7,30 мкМ пировиноградной кислоты в контроле, а плазмы 2,34 мкМ против 0,94 мкМ. Разница между опытом и контролем статистически достоверна и составляет для сперматозоидов 23,5% (P<0,02) и плазмы 148,9% (P<0,01). После замораживания-оттаивания активность лактатдегидрогеназы сперматозоидов в среда ГЦЖДУМ еще больше превосходит активность лактатдегидрогеназы сперматозоидов по сравнению с контрольной группой Таблица 61- Изменение активности изоферментов ЛДГ сперматозоидов хряков при замораживании в среде ГХЦЖК с добавлением (ГХЦЖКУ) n=6
Так, активность лактатдегидрогеназы в контроле 3,88 мкМ против 5,12 мкМ в опыте, т.е. выше на 32%. Поученные незначительные разницы между группами по активности лактатдегидрогеназы в плазме спермы после замораживания и после эквилибрации были не достоверными. Исследование изоферментов лактатдегидрогеназы показывает, что разбавление спермы средой ГЦЖДУМ хотя и увеличивает активность изоферментов в 1-2 мк Молях пировиноградной кислоты, но не влияет на их процентное соотношение, наблюдаемое в среде ГХЦЖК. Процентное соотношение активности изоферментов ЛДГ1 - ЛДГ5 в среде с унитиолом и мочевиной не изменяется и после замораживания-оттаивания сперматозоидов. В то время как в контрольном варианте (среда ГХЦЖК) после замораживания-оттаивания активность ЛДГ1 достоверно снижается. Соотношение изоферментов лактатдегидрогеназы в плазме после эквилибрации и замораживания достоверно не изменяется. Поученные данные, в которой активность изоферментов лактатдегидрогеназы выражена в мкМ пировиноградной кислоты, показывают, что при разбавлении спермы средой с унитиолом и мочевиной (ГЦЖДУМ) наблюдается значительное увеличение активности изоферментов сперматозоидов по сравнению с их активностью в среде ГХЦЖК (контроль). Эти увеличение составили - ЛДГ1 на 56,1%; ЛДГ2 - 43,6; ЛДГ4 - 20,7 и ЛДГ5 на 21,8%. Наблюдаемое увеличение ЛДГ3 31,2% из-за большого разброса статистически не оправдано. Эквилибрация и замораживание-оттаивание в среде ГЦЖДУМ как и в контрольном варианте вызывает снижение активности изоферментов и сперматозоидах. Разница между опытом и контролем для ЛДГ1 достигает до 177%, для ЛДГ2 - 96,8%, ЛДГ4 - 27,4% и ЛДГ5 - 44,7%. Достоверной разницы активности между опытом и контролем не обнаруживается только для изофермента ЛДГ3. В плазме как и в сперматозоидах при разбавлении спермы средой ГЦЖДУМ происходит увеличение активности всех изоферментов. Однако после замораживания-оттаивания активность изоферментов в опытной среде выше чем в среде ГХЦЖК. Таким образом можно отметить, что в среде с унитиолом (0,028%) и мочевиной (0,30) - среда ГЦЖДУМ, наряду с повышением общей активности всех изоферментов и их устойчивости в клетках к повреждающему действию охлаждения и замораживания-оттаивания наблюдается лучшее сохранение в сперматозоидах активности изоферментов ЛДГ1 и ЛДГ2, связанных с дыханием и сосредоточенных в митохондриях.
Предующие исследовании показали, что для стабилизации функциональной поноценности сохраняемой вне организма спермы хряков, наиболее эффективно влияют унитиол и дитиотреитол. Эти тиоловые соедиенеия в широком диапозоне концентраций увеличивает подвижность и абсолютный показатель живучести сперматозоидов при кратковременном хранении, стабилизируют скорость движения и продлевает оплодотворяющей способности гамет хряков. Учитывая эти положительные стороны унитиола и дитиотреитола изучены их влияния на функциональное состояние заморожено-оттаянной спермы хряков. Полученые данные представлены в таблице 62. Как видно из таблицы 62 лучшие результаты по всем качественным показателям спермы хряков и оплодотворяемость свиноматок были получены при введении в состав среды унитиола и дитиотреитола. Таблица 62- Влияние унитиола и дитиотреитола в среде ГХЦЖКМ на функциональное состояние заморожено-оттаянной сперматозоидов хряков
При этом абсолютный показатель живучести заморожено-оттаянных сперматозоидов, по сравнению с контролем увеличиваются на 33,3 – 40,7%, число поврежденных акросом уменшаются на – 11,1 – 17,3%, сохранность SН-групп увеличиваются на 6,4-9,7%, увеличиваются сохранности оплодотворяющая способности сперматозоидов хряков на 26,8-31,3%. Эти тиоловые соедиения не влияют на сохранности поросят до 2-х месячного возраста. Таким образом установлено, что унитиол и дитиотреитол положительно влияют на функциональное состояние заморожено-оттаянной сперматозоидов хряков, следовательно их целесообразно включить в состав среды для замораживания спермы хряков.
Результаты проведенных исследований по влиянию унитиола и мочевины на устойчивость сперматозоидов хряка к повреждающему действию низких температур позволили разработать среду для криоконсервации спермы хряков. Новая среда, под условным названием глюкозо-цитрато-дитиотреитоло-унитиоло-мочевиновая-желточная ( жүктеу/скачать 3.93 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
