Ковалева М.К., Мензянова Н.Г

Ковалева М.К., Мензянова Н.Г.

В настоящее время для изучения закономерностей старения в качестве моделей используют клеточные культуры животных и растений. Однако клетки млекопитающих, переведенные в систему in vitro, адаптируясь к новым условиям, могут существенно изменять свои свойства. Альтернативой клеточным культурам, полученным из многоклеточных организмов могут быть культуры одноклеточных организмов такие как эукариточеские микроводоросли рода Dunaliella.

В работе культура Dunaliella viridis Teodor. была использована для проверки гипотезы влияния средовых факторов на процессы старения. Согласно этой гипотезе, создание «оптимальных» условий для функционирования в случае вегетативного размножения клеток может влиять на «репликативное старение». В качестве показателей «репликативного старения» культуры использовали степень плоидности клеток, которую оценивали по содержанию ДНК, триацилглицеридов, β-каротина, карбонилированных белков, а также содержанию РНК и белков в процессе длительного культивирования разных субкультур Dunaliella viridis. С целью получения различных субкультур и создания различных условий функционирования клетки микроводорослей пересаживали на свежую среду Артари с разной частотой: 1) субкультура-10 – частота пересадки 10 дней (на стадии экспоненциальной фазы);2) субкультура-20 – частота пересадки 20 дней (на стадии перехода в стационарную фазу); 3) субкультура-30 – частота пересадки 30 дней (на стадии ранней стационарной фазы); 4) субкультура-40 – частота пересадки 40 дней (на стадии поздней стационарной фазы).

Было обнаружено, что к 10-му пассажу культивирования в клетках субкультуры-40 (стационарная фаза роста) увеличивалось содержание ДНК и триацилглицеридов (ТГ) в 2, 6 раза, содержание β-каротина в 2 раза, доля карбонилированных белков увеличивалась в 2 раза, а содержание РНК уменьшалось по сравнению с клетками, находящимися в экспоненциальной фазе роста (субкультура-10), то есть к 40-м суткам роста культуры формировался возрастзависимый эпигенотип. Исходя из этого, субкультуру-10 можно определить как «молодую» культуру, а субкультуру-40 – как «стареющую». При дальнейшем культивировании субкультур D. viridis на протяжении 2-х лет было показано, что эпигенотип субкультуры-10 оставался неизменным: содержание ДНК, ТГ и β-каротина, которое может служить показателем старения культур, не изменялось на протяжении всего культивирования. Увеличение содержания ДНК, ТГ и β-каротина было характерно для субкультур-20, -30 и -40. Так, если выразить скорость увеличения плоидности в разных субкультурах через величину тангенса угла наклона кривой содержания ДНК в процессе пассирования, то для субкультуры-10 он равен 0,14, для субкультуры-20 – 0,17, а для субкультуры-30 – 1,12, то есть почти в 10 раз больше, чем в субкультуре-10. Содержание ДНК в клетках субкультуры-40 варьировало от пассажа к пассажу, но было выше, чем в клетках субкультуры-10. Подобные закономерности были выявлены и для содержания ТГ и β-каротина в клетках субкультуры-40, т. е., снижение частоты пересадки приводило к снижению вариабельности исследуемых показателей.

Таким образом, создание определенных условий для функционирования культур микроводорослей (частота пересадки) оказывает влияние на формирование возрастзависимых эпигенотипов, а также на стабильность сформировавшегося эпигенотипа в процессе длительного культивирования.
Свободнорадикальные часы организма и антиоксиданты:
от химии к системной биологии

Кольтовер В.К.

Свободнорадикальная гипотеза старения была выдвинута в середине XX века (Harman, 1954). К настоящему времени доказано, что в клетках аэробных организмов образуется анион-радикал кислорода (супероксидный радикал, O­₂^·-), возникающий как продукт «электронной утечки» при сбое в работе электрон-транспортных цепей (ЭТЦ) окислительного фосфорилирования. Этот радикал и его продукты (активные формы кислорода, АФК) играют существенную роль в старении [Анисимов, 2008]. Работа мозга человека при надежной защите от O­₂^·- могла бы продолжаться до 250 лет [Кольтовер, 2004].

Известны успешные попытки продления жизни с помощью химических ингибиторов свободнорадикальных реакций – антиоксидантов. Рекордный эффект показал природный антиоксидант ресвератрол (3,5,4’-тригидроксистильбен): продление жизни нематод, мышей и других животных на 40-60 % (Baur, Sinclair, 2006). Однако способность антиоксидантов, синтетических и природных, перехватывать радикалы ничтожно мала по сравнению со специализированными антиоксидантными ферментами. In vivo, антиоксиданты обеспечивают не прямую, а превентивную защиту от АФК. Например, дибунол (бутилированный гидрокситолуол, BHT), улучшая снабжение тканей кислородом, предотвращает индуцируемое гипоксией/ишемией превращение митохондрий в генераторы O₂^•– [Koltover, 1995]. «Антиоксиданты направленного митохондриального действия» MitoVit-E и SkQ1 [Skulachev et al., 2009] не столько перехватывают О₂^•–, сколько предотвращают его образование как мягкие разобщители окислительного фосфорилирования [Кольтовер, 2010]. Подобный профилактический эффект может обеспечить стабильный изотоп ²⁵Mg. Благодаря магнитному полю ядерного спина магнитный изотоп служит существенно более эффективным кофактором окислительного фосфорилирования, чем немагнитные изотопы ²⁴Mg и ²⁶Mg. Между тем, чем эффективнее идет синтез ATP в активном центре ATP-синтазы, тем меньше вероятность сбоя в работе ЭТЦ с утечкой электрона и возникновением О₂^•– [Koltover, 2012]. Превентивный антиоксидантный эффект BHT реализуется через систему гормональной регуляции редокс-гомеостаза [Frolkis et al., 1990]. Медиаторами ресвератрола служат сиртуины – семейство NAD⁺-зависимых деацетилаз, модифицирующих хроматин [Pearson et al., 2008]. Флавоноиды индуцируют экспрессию антиоксидантных ферментов СОД и каталазы [Nelson et al., 2006]. Более того, фенольные соединения и другие антиоксиданты действуют на микробиоту, в частности, ферментируются микрофлорой желудка и кишечника [Ginsburg et al., 2011].

Таким образом, в XXI веке задачи выяснения механизмов антиоксидантной терапии сместились из химической физики в системную биологию.

Работа выполнена при поддержке РФФИ, проекты № 10-03-01203а и 12-04-90424-Укр_а.
ИССЛЕДОВАНИЕ МЕТИЛИРОВАНИЯ ГЕНОВ ПАРКИНОВ ПРИ БОЛЕЗНИ ПАРКИНСОНА МЕТОДОМ HRM