Дьячков И.С., Кудрявцев И.В., Харазова А.Д., Полевщиков А.В.*

* ГУ НИИ экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург

Сбор экспериментального материала проводили в августе-сентябре 2004 г. на базе ББС им. акад. О.А.Скарлато ЗИН РАН. Целомоциты A.rubens получали с помощью шприца в консервирующий раствор (30 мМ ЭДТА в 2,6% растворе NaCl) и число целомоцитов определяли в камере Горяева. Клетки отделяли от целомической жидкости центрифугированием при 250g в течение 10 минут и переводили в культуральную среду, устанавливая концентрацию клеток равной 2 млн/мл. В состав культуральной среды входили среда RPMI-1640 с подведённой осмотичностью до 25‰, стабилизированную добавлением HEPES и бикарбоната Na и обогащенную 2% эмбриональной телячьей сыворотки и 80 мкг/мл гентамицина. Все компоненты среды стерилизовали мембранной фильтрацией. Целомоциты A.rubens инкубировали в лунках камеры Терасаки в объёме 15 мкл методом «висячей капли» при t=15^оС во влажной атмосфере. Клетки стимулировали внесением 5 мкл ФГА, Кон А и лимфоцитарного митогена (ЛМ) в разных концентрациях в течение 12, 24, 48, 72, 96 ч. Контролем служило внесение равного объема культуральной среды. Об уровне метаболической и пролиферативной активностей судили по включению меченых по тритию уридина и тимидина, которых вносили на последние 12 ч инкубации в объеме 2 мкл. По окончании инкубации клетки переносили на толстые бумажные фильтры и высушивали, останавливая опыт и предотвращая радиоактивное загрязнение. Каждый опыт был воспроизведён шестикратно. Учет включившейся метки вели путем сцинтилляционного счета на базе отдела иммунологии НИИЭМ РАМН. С этой целью каждый фильтр выдерживали в избыточном объеме воды в течение 30 мин для удаления невключившейся метки, обрабытывали избытком 5% раствором ТХУ (15 мин) для преципитации белка и 1-2 мин – 100 этанолом. После высушивания образцы переносили в виалы со сцинтиллятором. Радиометрический учет вели на счётчике Rackbeta, и результат выражали числом импульсов за 1 мин (CPM, имп/мин).

Полученные результаты свидетельствовали о том, что на всех точках наблюдения уровень включения меток в культуры достоверно превышал фоновые значения. Динамика включения ³Н-уридина отличалась от динамики для ³Н-тимидина, доказывая сохранение жизнеспособности клеток даже на сроке 96 ч культивирования. Выявлены различия в ответе культур целомоцитов на различные митогены. Так, наивысшие показатели включения ³Н-уридина были получены при ответе на 50 мкг/мл ФГА через 96 ч инкубации (42363030 имп/мин), в то время как наивысший уровень для ³Н-тимидина отмечен при ответе на лимфоцитарный митоген (в разведении 1:4) через 72 ч культивирования и составил 1239329 имп/мин. Уровни включения метки в контрольных культурах составляли в среднем от 300 до 1600 имп/мин по всем срокам для обеих меток. Разработанная модификация классического метода клеточной иммунологии представляет собой первую успешную попытку оценки пролиферативной и метаболической активностей целомоцитов A.rubens in vitro в условиях полевого стационара. Работа поддержана грантами РФФИ № 04-04-49069 и 04-04-49342.

Дьячков И.С., Кудрявцев И.В., Харазова А.Д., Полевщиков А.В.* Оценка пролиферативной и метаболической активности целомоцитов Asterias rubens in vitro в ответ на митогенную стимуляцию

* ГУ НИИ экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург

При анализе результатов были выявлены особенности ответа у каждого животного, поэтому в таблице 1 приведены наиболее типичные закономерности, полученные для одного из животных. Анализируя пролиферативный ответ целомоцитов при стимуляции различными митогенами выявлено, что при всех используемых концентрациях на точках 24 и 48 ч включение ³Н-тимидина максимально, что может свидетельствовать о существовании, как минимум двух популяций целомоцитов.

Максимальная пролиферативная активность выражена на сроках 24 и 72 ч, причём определяющим фактором клеточных циклов является срок инкубации целомоцитов с митогенами при всех использованных концентрациях митогенов.

Воздействие митогенов на целомоциты, возможно, носит характер митостатика, т. к. их воздействие носит концентрационно независимый характер и может приводить к снижению пролиферативной активности целомоцитов. Возможно, что митостатический эффект на некоторых сроках объясняется использованием слишком высоких концентраций митогенов, при которых не происходит кластеризации рецепторов за счет избытка митогена.

При анализе данных по метаболической активности целомоцитов выявлено, что как в опытных, так и в контрольных культурах прирост абсолютных значений включения ³Н-уридина имел место на поздних сроках культивирования (на 4 и 5-е сутки) для всех митогенов, когда он достоверно превышал уровень включения на более ранних сроках.

Работа поддержана грантами РФФИ № 04-04-49069 и 04-04-49342.

Елисеева Е.В., Кулакова М.А., Андреева Т.Ф. Анцестральная и кооптированная функции постериальных Hox генов в личиночном развитии полихет Nereis virens и Platynereis dumerilii
Обобщение всех имеющихся на сегодняшний день данных по структурной организации и функционированию Hox генов билатеральных животных позволяет заметить, что одна из трёх основных филогенетических групп билатеральных животных – Lophotrochozoa – изучена в этом отношении явно недостаточно. А между тем, это именно та группа животных, которая демонстрирует колоссальное разнообразие морфологических планов организации тела, в создание которого в эволюции, без сомнения, был вовлечен кластер Hox генов. Выявление структурной организации и правил функционирования Hox-генов у лофотрохозойных животных могут прояснить основы создания морфологического разнообразия в этой группе животных. Анализ экспрессии Hox генов в развитии нереид - одних из примитивных в эволюционном плане представителей группы Lophotrochozoa (Tessmar-Rable and Arendt, 2003), чья генетическая сеть и Нох-гены, как ее составляющие, претерпели минимальные изменения в ходе эволюции, может дать представление о функции Hox генов, реализовывавшейся у предка лофотрохозойных животных.

Опираясь на молекулярно-филогенетические взаимоотношения, построенные на основании ряда индивидуальных структурных особенностей Hox генов, можно разделить кластер Hox генов билатеральных животных на три части: антериальная группа генов, срединная группа генов, постериальная группа генов (de Rosa et al., 1999). Число генов, входящих в постериальную группу, может значительно варьировать от одного (AbdB) у дрозофилы до шести у ланцетника (Ferrier et al., 2000).

В пределах ветви Lophotrochozoa мало данных, относительно наличия в кластере постериальных Hox генов и их паттерна экспрессии. Присутствие таких генов показано для головоногого моллюска Euprimna scolopes (Kallaerts et al., 2002), для планарии Dugesia japonica (Nogi, and Watanabe., 2001). Нами получены данные о функционировании постериальных генов полихет Nereis virens (Nvi-post1, Nvi-post2) и Platynereis dumerilii (Pdu-post1, Pdu-post2).

Pdu-post2 начинается экспрессироваться на стадии средней метатрохофоры. Зона экспрессии ограничена пигидиальной областью на протяжении всего личиночного развития. Таким образом, постериальный ген кластера экспресссируется в самом постериальном отделе тела животного, что укладывается в общее для Hox генов всех билатеральных животных правило пространственной колинеарности экспрессии. В этом случае, наряду с некоторыми другими генами Hox кластера червя, Pdu-post2 принимает участие в реализации анцестральной функции генов Нох кластера, заключающейся в регионализации тела вдоль антериально-постериальной оси. Паттерн экспрессии и функция Pdu-post2 и Nvi-post2 идентичны.

Экспрессия Pdu-post1 начинается на стадии поздней трохофоры. Его экспрессия ассоциирована с территориями формирования хетоносных мешков всех трёх личиночных сегментов. Динамика экспрессии коррелирует с процессом закладки и развития хетоносных мешков. Как и в случае post2, паттерны экспрессии ортологичных генов Pdu-post1 и Nvi-post1 идентичны. Функция генов post1 не связана с осевым паттеринигом. Pdu-post1 и Nvi-post1 были кооптированы в ходе эволюции для спецификации областей закладки хетоносных мешков, являющихся эволюционной инновацией полихет.

Таким образом, для нереид нами показано наличие в кластере двух генов постериальной группы: post1 и post2, при этом post2 сохранил функцию в регионализации тела вдоль АР оси, а post1 был вовлечён в программу закладки хетоносных мешков. Сходная ситуация наблюдается и у планарии (Platyhelmintes), в геноме которой также обнаружено два постериальных Hox гена: DjAdb-Ba, DjAbd-Bb, оба они являются ортологами гена post2 кластера полихет. DjAbd-Ba экспрессируется в хвостовом отделе тела червя, тогда как DjAbd-Bb утратил функцию в регионализации тела животного вдоль АР оси, он экспрессируется в нескольких клеточных типах по всему телу животного (Nogi and Watanabe, 2001).

*ИЭФБ РАН

Концентрация клеток в гемолимфе B. undatum отличается существенной индивидуальной и сезонной вариабельностью. Так, летом 2003 года, при среднем значении 1.8*10⁶клеток/мл, максимальное количество гемоцитов в циркуляции обнаружено в начале июля и в середине августа (1.8*10⁶ и 3.0*10⁶, соответственно). Минимальные оценки приходились на конец июня (1.0*10⁶). Предположительно, нестабильность этого параметра отражает различный уровень активированности защитной системы у разных особей и сезонные различия физиологического статуса моллюсков, обусловленные половым циклом.

Циркулирующие клетки гемолимфы трубача в целом представлены одним клеточным типом. Зафиксированные немедленно после взятия из буккального синуса клетки имеют средний диаметр 9.1 мкм, диаметр ядра 6,8 мкм и ядерно-цитоплазматическое отношение этих клеток (0.75) значительно смещено в сторону ядра. Цитохимическое окрашивание не выявило гранулированных или зернистых элементов в слабо базофильной цитоплазме гемоцитов, и поэтому клетки B. undatum можно классифицировать как гиалиноциты. Однако, окончательное решение этого вопроса возможно только после проведения электронно-микроскопических исследований.

Окрашивание гемоцитов реактивом Шиффа выявило, что большинство клеток в популяции содержат рассеянные отложения гликогена в цитоплазме. Цитохимическое определение ферментов показало, что гемоциты трубача не содержат эндогенной пероксидазы и не продуцируют этот фермент при индукции фагоцитоза. Активность кислой фосфатазы обнаружена как фоновое окрашивание цитоплазмы и, в более ярко выраженной форме, в фагосомах.

Эксперименты с иммуноцитохимическим выявлением инъецированного животным бромдеоксиуридина (БрДУ), обнаружили его включение в ядра 1.8% гемоцитов через 12 часов после инъекции. Наличие в циркуляции клеток, находящихся a фазе синтеза ДНК, свидетельствует о протекании кроветворных процессов в том числе и непосредственно в циркуляторной системе.

В присутствии ионов кальция гемоциты трубача способны как формировать клеточные агрегаты, так и распластываться на стекле и пластике. Обработка субстрата полилизином и органосиланом усиливает адгезивную способность клеток. Цейтраферная микрофотосъемка обнаружила высокую амебоидную подвижность гемоцитов. В экспериментах in vitro клетки фагоцитировали зимозан (клеточные стенки дрожжей), бактерии и частицы латекса. Однако, доля фагоцитирующих клеток невелика и не превышает 10%. В условиях in vitro гемоциты B. undatum способны генерировать активные формы кислорода. С помощью фотометрического метода оценки интенсивности восстановления нитросинего тетрозолия (НСТ-тест) обнаружено небольшое, но статистически достоверное увеличение синтеза кислородных метаболитов клетками при фагоцитозе зимозана. При этом важно отметить, что синтетическая активность зарегистрирована не только внутри-, но и внеклеточно. Оценка цитотоксичности гемоцитов B. undatum не обнаружила литической активности клеток по отношению к эритроцитам человека (группа AB). Однако, в плазме (бесклеточной гемолимфе) B. undatum присутствуют соответствующие гемолитические факторы.

Полученные результаты позволяют рассматривать моллюска B. undatum, наряду с Littorina littorea, как потенциальный модельный объект для сравнительных иммунобиологических исследований.

Работа выполнена при поддержке Российского Фонда Фундаментальных Исследований (грант РФФИ № 03-04-49392-а).

*кафедра физиологии микроорганизмов Биологического факультета МГУ, Москва

** ГУ НИИ экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петебрург
Целью данного исследования было изучения влияния повторного введения эритроцитов человека (ЭЧ) на динамику численности целомоцитов, их метаболическую активность и на динамику титров гемагглютининов. В эксперименте было использовано 400 неповрежденных морских звезд A.rubens (Asteroidea, Forcipulata) с длиной луча не более 6 см, собранных в районе ББС ЗИН РАН. Первичную иммунизацию проводили в конце июнь, вторичную – в конце июля, а третичную – в конце августа 2004 года. В промежутках между иммунизациями животных опытной (инъекция в конец одного из лучей 1 мл 2% суспензии ЭЧ) и контрольной группы (инъекция 1 мл 0,85% р-ра NaCl) содержали в садках на глубине 3-4 метров. На сроках 1-120 ч после иммунизации оценивали число клеток в 1 мл целомической жидкости (с помощью камеры Горяева), их способность к продукции активных форм кислорода (спонтанный и зимозан-индуцированный НСТ-тест), метаболическую активность целомоцитов (МТТ-тест), титр гемагглютининов (реакция гемагглютинации).

Результаты исследований показали, что через месяц после первичного введения ЭЧ у морских звезд сохранялась относительно высокая концентрация клеток, но не наблюдалось увеличения их метаболической активности. Первичная иммунизация сопровождалась 3-кратным увеличением числа клеток уже через 1 ч после введения ЭЧ, также было отмечено еще два прироста концентрации клеток. При повторных иммунизациях не удалось зарегистрировать достоверных приростов числа клеток ни на ранних, ни на поздних сроках. В контрольных группах при повторных инъекциях кривые концентрации клеток практически совпадали. При изучении способности целомоцитов к спонтанной продукции активных форм кислорода показано, что при первичной иммунизации наблюдались пикообразные приросты на сроках 9 и 48 ч, в то время как при повторном введении антигена достоверных отличий от начальной точки не наблюдали. В контрольных группах отмечена сходная динамика продукции О₂^–. Вместе с тем в индуцированном НСТ-тесте повторно иммунизированные животные уже через 1 ч отвечают 2-3,5-кратным приростом продукции О₂^–, и аналогичные показатели достигаются в интервале 9-24 ч. Повторное введение 0,14 М р-ра NaCl также приводило в приростам продукции О₂^– ранних сроках (6-9 ч), но их амплитуда была значительно ниже. Исследование метаболической активности целомоцитов выявило, что если первичное введение ЭЧ вело к снижению данного показателя, то вторичное и третичное – к его увеличению на ранних сроках после иммунизации, на сроках свыше 48 ч кривые всех трех групп имели сходную динамику. Динамика титров гемагглютининов при первичной и повторных введения ЭЧ не имела различий. Многократные иммунизации также не приводили к ускорению элиминации антигена из целомической жидкости.

Таким образом, повторное введение ЭЧ не приводило к усилению ответа, опосредуемого как клеточными, так и гуморальными защитными механизмами, и не влияло на скорость удаления антигена из циркуляции, что однозначно указывает на отсутствие иммунологической памяти у данной группы животных, а также на высокую эффективность реакций врожденного иммунитета. Более того, повторные иммунизации приводили к ослаблению клеточного ответа на вводимый антиген, что может рассматриваться в качестве “отрицательной” иммунологической памяти.

Работа поддержана грантами РФФИ №04-04-49069 и 04-04-49342.

*кафедра физиологии микроорганизмов Биологического факультета МГУ, Москва

** ГУ НИИ экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург
В сравнительно-иммунологических исследованиях традиционным модельным антигеном являются эритроциты млекопитающих, в отношении которых однако могут возникать сомнения в адекватности данной модели применительно к изучению защитных реакций морских беспозвоночных. С целью сравнения параметров ответа на эритроциты человека (ЭЧ) и иные антигены, с которыми морские звезды контактируют в среде обитания, было предпринято данное исследование. Всего было отобрано 4 группы морских звезд A.rubens (Asteroidea, Forcipulata) по 60 неповрежденных животных с длиной луча не более 6 см. Контрольной группе животных в конец одного из лучей вводили 1 мл 0,85% р-ра NaCl, а другим группам – равный объем 2%-ю суспензию ЭЧ (группа 1), 2%-ю суспензию зимозана (группа 2) или 2%-ю суспензию живых бактерий Pseudomonas sp., выделенных с покровов A.rubens (группа 3). После иммунизации животных помещали в садки на глубину 2-2,5 м. На сроках 1-120 ч после иммунизации от 6 животных каждой группы получали образцы целомической жидкости, в которых определяли концентрацию клеток в 1 мл целомической жидкости (камера Горяева), способность клеток к продукции активных форм кислорода (НСТ-тест), интенсивность их метаболической активности (МТТ-тест), а также титр гемагглютининов (реакция гемагглютинации).

Стереотипным ответом на введение антигена является прирост концентрации клеток в целомической жидкости на ранних сроках. В группе 1 максимальное количество клеток было зарегистрировано уже через 3 ч после иммунизации. В группах 2 и 3 максимальная концентрация клеток была отмечена на сроках 6 и 9 ч соответственно. В контрольной группе число клеток на ранних сроках снижалось с последующим восстановлением до исходных показателей к 12 ч. После срока 72 ч кривые числа клеток во всех четырех группах совпадают. При оценке спонтанной продукции О₂^– показано, что у животных групп 2 и 3 на сроках 1-48 ч количество целомоцитов, синтезирующих О₂^–, значительно превышает аналогичный показатель контрольной и 1-й групп, причем, при сходной динамике на сроках свыше 72 ч разница между группами сохраняется. В индуцированном НСТ-тесте найдено, что продукция О₂^– возрастает через 1 ч во всех группах, и в группах 1-3 медленно снижается до срока 12 ч, в то время как в контроле возрастает и достигает максимума в точке 6 ч. Вторая волна прироста продукции О₂