ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Экспериментальные исследования проводили с использованием: 2% раствора формалина («Биомед», Россия), 0,6% уксусной кислоты («Реахимсервис», Россия), буторфанола тартрата (ОАО «Московская фармацевтическая фабрика», Россия), морфина гидрохлорида (ОАО «Московская фармацевтическая фабрика», Россия), U-50,488 - («SIGMA», США), норбиналторфимина (nor-BNI) («SIGMA», США) налоксона (ОАО «Московская фармацевтическая фабрика», Россия), галоперидола («Gedeon Richter», Венгрия), апоморфина гидрохлорида («ICN Biomedical», США), L-3,4-диоксифенилаланина (L-ДОФА) («Sigma», США), клофелина («Биомед», Россия), резерпина («Sigma», США), 5-гидрокситриптофана (5-ОТФ) («Sigma», США), ареколина («Sigma», США), никотина («Sigma», США), пикротоксина («ICN Biomedical», США), бикукуллина («Sigma», США).

Для приготовления буферных растворов использовали химически чистые реактивы: натрия хлорид, калия хлорид, кальция хлорид, магния хлорид, магния сульфат, натрия гидрокарбонат, калия дигидрофосфат, глюкоза, трис-(оксиметил)-аминометана гидрохлорид производства «Мосреактив» (Россия).

Эксперименты были выполнены на 983 нелинейных половозрелых белых мышах массой 20-25 г, 176 нелинейных белых крысах массой 220-250 г, 15 кроликах породы «Шиншилла» массой 4-4,5 кг. Все животные были доставлены из питомников: ООО «Питомник РАМТН» (г. Москва), ФГУП ПЛЖ «Рапполово» РАМН (Ленинградская обл., д. Рапполово), ФГУП "НИИ ГТП" ФМБА России (г. Волгоград). Содержание животных осуществлялось в стандартных условиях вивария ВолгГМУ на полнорационной диете (ГОСТ Р 50258-92), с соблюдением правил лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ, регламентированных ГОСТ Р 51000.3 96 [1996] и ГОСТ Р 51000.4 96 [1996], а также правил и Международных рекомендаций «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» [The European Convention, 1986]. Все экспериментальные исследования были выполнены согласно заключению этической экспертизы от 17.12. 2011 г, протокол № 149-2012, лицензии на осуществление деятельности по обороту наркотических средств, психотропных веществ и их прекурсоров, культивированию наркосодержащих растений (ЛО-34-04-000022 от 12.10.2012г.) и приказу ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава России «О назначении лиц, допущенных к работе с наркотическими средствами и психотропными веществами, внесенными в Список I, прекурсорами и культивируемыми наркосодержащими растениями (Приказ № 1351-КМ от 12.11.2013 г.) Исследования проведены с использованием субстанции соединения РУ-1205 дигидрохлорида 9-(2-морфолиноэтил)-2-(4-фторфенил)имидазо[1,2-а]бензимидазола, синтезированного ЗАО «ЭМПИЛС-ФОХ» (г.Ростов-на-Дону) и готовых лекарственных форм (инъекционной и твердой дозированной), производства ФГБУ «НИИ фармакологии им В.В.Закусова» РАМН (г. Москва).

1. 
   Исследование обезболивающего эффекта.
   

Тест горячей пластины основан на поведенческих реакциях, контролируемых супраспинальными структурами, в ответ на болевое воздействие. При помещении животного на горячую поверхность (55°С) с достижением порога болевой реакции наблюдаются двигательные реакции беспокойства: отдергивание лап, облизывание подушечек лап, подпрыгивание, которые характеризуются самой сложной организацией рефлекса с вовлечением корковых и подкорковых структур головного мозга. Данная экспериментальная модель позволяет не только оценить обезболивающее действие вещества, но и определить уровень вмешательства в нейромедиаторные процессы ЦНС [Kitchen I., Crowder M., 1985].

Мышей помещали на термостатически контролируемую, электронагревательную поверхность, окруженную цилиндром диаметром 15 см с установленным температурным режимом. Регистрировали латентный период (ЛП) болевой реакции в виде облизывания задних лап. При отсутствии активности в течение 30-секундного интервала (максимальное время экспозиции) за ЛП принимались 30 секунд.

Критерием анальгетического эффекта считали статистически значимое увеличение латентного периода реакции после введения исследуемого вещества. Показатели ЭД₅₀ анальгетической активности веществ определялись на основе кривой зависимости доза-эффект, а также рассчитывали эффективность тестируемых веществ по показателю %МВЭ %(максимально возможный эффект)



ЛП_о – латентный период ноцицептивной реакции в опытной группе;

ЛП_к - латентный период ноцицептивной реакции в контрольной группе;

30 – максимальное время экспозиции [Karami R., 2011].

Данная ноцицептивная модель предназначена для оценки обезболивающего действия соединений с вовлечением различных уровней организации болевой чувствительности у лабораторных крыс при электрическом раздражении. Метод основан на измерении порогового напряжения, при котором появляются рефлексы «Отдергивание хвоста», «Вокализация», «Пролонгированная вокализация» (голосовая ноцицептивная реакция после разряда), в реализацию которых вовлекаются структуры спинного мозга, ствола мозга, таламуса соответственно [Le Bars D., 2001].

Болевое раздражение проводили электрической стимуляцией корня хвоста крыс биполярными электродами с использованием электростимулятора лабораторного (ЭСЛ-2, Россия), прямоугольными импульсами длительностью 10 мсек, частотой стимуляции 100 Гц, продолжительностью 1 сек. Регистрировали пороговые величины напряжения, соответствующие появлению ноцицептивных реакций с интервалом 30 минут. Критерием анальгетического эффекта считали статистически значимое увеличение пороговых величин напряжения после введения веществ относительно контрольных значений для каждой точки измерения.

1.3. Методы химического раздражения.

Формалиновый тест.

Тест имитирует реакции, развивающиеся при операционных кожных разрезах. Одним из механизмов ноцигенного действия формалина является активация TRPA1 каналов, реагирующих в норме на холод и стимулирующих развитие воспаления [Dubuisson D., 1977; McNamara C.R., 2007]. Первая фаза реакции развивается сразу и характеризуется воздействием на первичные афференты боли, вторая фаза отставлена во времени и является болью, вызванной воспалительной реакцией. Животных помещали в индивидуальные пластиковые боксы для адаптации к условиям эксперимента в течение 30 минут до начала тестирования. Гипералгезию моделировали подкожным введением 50 мкл 2% водного раствора формалина в тыльную поверхность правой задней лапки. Регистрировалось число болевых реакций «flinches» (поднятие лапки, облизывание, покусывание места инъекции) с момента введения формалина и на протяжении всего периода наблюдения с учетом острой (первые 10 мин) и воспалительной (с 10 по 60 мин) фаз ноцицептивного ответа.

Анальгетическую активность соединений оценивали отдельно для I и II фаз ноцицептивного ответа по уменьшению числа болевых реакций относительно таковых у контрольных животных.

Тест «Уксусные корчи».

Данный тест является общепринятой моделью висцеральной ноцицепции и направлен на изучение периферической анальгетической активности новых веществ с использованием метода химического раздражения ноцицепторов брюшины и оценкой характерных двигательных ответов [Koster R., 1959].

Болевая реакция «корчи» представляет собой специфические поведенческие ответы на действие раздражающих химических веществ, включающие сокращения брюшных мышц с одновременным вытягиванием задних конечностей, прогибом спины, и напоминают боль при перитоните [Prisinzano T.E., 2005].

Специфическую болевую реакцию вызывали введением 0,6% раствора уксусной кислоты внутрибрюшинно (0,1 мл/10 г массы тела животного). Критерием антиноцицептивной активности считали статистически значимое уменьшение количества «корчей» за 15 минутный период наблюдения после инъекции уксусной кислоты относительно контрольной группы животных.

Степень анальгезии выражалась в процентном соотношении, которую рассчитывали по формуле:

_, где

N_к – число корчей в контрольной группе животных;

N_o- число корчей в опытной группе животных

Показатели ЭД₅₀ определяли на основе кривой зависимости доза-эффект.

В основе данного теста [Randall L.O., Selitto J.J., 1957] лежит возникновение афферентной болевой импульсации при постепенно усиливающемся давлении на фоне острого воспаления химическим раздражителем. Механическую гипералгезию индуцировали введением формалина с применением дозированного нарастающего механического давления, точечно приложенного к задней лапке крысы. Животным в вентролатеральную поверхность правой задней лапки подкожно вводили 50 мкл 2% раствор формалина. Регистрировали порог ноцицептивного ответа (вес в граммах, при достижении которого появлялся рефлекс «отдергивания лапки») через 2 минуты после инъекции формалина.

Обезболивающий эффект исследуемых веществ оценивали с точки зрения изменения порога болевой реакции в сравнении с контрольной группой животных.

1.5. Модель нейропатического болевого синдрома.

Тест тактильной аллодинии.

Нейропатический болевой синдром у крыс создавали путем наложения 4 свободных лигатур вокруг седалищного нерва на уровне подколенной ямки выше места его трифуркации на N. tibialis, N. peroneus и N. suralis [Bennett G.J., Xie Y.K., 1988]. Хроническую перевязку седалищного нерва крыс проводили под наркозом (хлоралгидрат 400 мг/кг). Животным в день перявзки и последующие 14 дней вводили исследуемые соединения. На 14-й день после операции оценивали интенсивность развития механической аллодинии с помощью волосков Фрея весом от 0,06 до 23,96 г (Frey hairs, Sweden). Для каждого волоска тестирование проводили по 5 раз с интервалом 1–2 с. Определяли минимальный порог реакции, вызывающий отдергивание лапы в предъявлении из пяти. Расчитывали показатель 50% порога болевой реакции



Xf – значение величины финального волоска Фрея (в log единицах);

K – стандартное значение коэффициента;

δ – среднее значение разницы между стимулами (в log единицах) [Chaplan S.R., 1994].

Критерием анальгетического эффекта считали статистически значимое повышение болевого порога в группе животных, получавших исследуемое соединение, относительно контрольной группы.

1.6. Дизайн исследования.

При изучении анальгетической активности соединения РУ-1205 и буторфанола тартрата на моделях термического, электрического, химического и механического раздражения, соединения вводили внутрибрюшинно в дозах 0,01; 0,1 и 1 мг/кг, животные контрольной группы получали эквивалентный объем дистиллированной воды. При моделировании нейропатического болевого синдрома в тесте тактильной аллодинии исследуемое соединение и препарат сравнения вводили внутрибрюшинно в дозе 1 мг/кг ежедневно на протяжении 14 дней, контрольной группе животных - эквивалентный объем дистиллированной воды.

В процессе изучения фармакокинетических свойств использовали физико-химический метод определения в биоматериале концентрации исследуемого вещества – высокоэффективная жидкостная хроматография*. Количественное определение проводили на компьютеризованной системе Shimadzu (Япония) с УФ-детектором при λ=205 нм на аналитической колонке SUPELCOSIL LC-18 (5мкм; 100 мм х 4,6мм). Мобильная фаза включала ацетонитрил (J.T. Baker, США) и буферную систему, состоящую из однозамещенного фосфата калия 50 мМ рН=5,0 в соотношении 1:1. Соединение РУ-1205 вводили крысам однократно подкожно в дозе 50 мг/кг. Забор проб крови осуществляли после декапитации животных через 5, 10, 20, 40 минут и через 1, 2, 4, 8 и 12 часов после введения, а также через 5 минут после введения изотонического раствора натрия хлорида контрольной группе животных.

* - выражаем благодарность за проведенные исследования д.б.н., зав.лаборатории фармакокинетики Смирновой Л.А. и аспиранту каф.фармакологии Ращенко А.И.

Кровь стабилизировали 5% раствором натрия цитрата. Зависимость концентрации соединений от времени изучали в плазме крови, которую получали центрифугированием при 3000 об/мин в течение 15 минут.

Обезболивающую активность соединения изучали на модели электрического раздражения в тесте «Отдергивание хвоста». Вещество РУ-1205 вводили подкожно в дозе 5 мг/кг.

2. 
   Исследование механизмов анальгетического действия.
   
1. 
   Изучение механизма анальгетического действия in silico.
   

2. Изучение механизма анальгетического действия in vitro.

Регистрацию малоуглового светорассеяния проводили на приборе «Лайт-Скан» («Люмекс», Россия). Эксперименты были выполнены на тромбоцитах кроликов породы «Шиншилла». Богатую тромбоцитами плазму получали по способу, описанному Люсовым В.А., Белоусовым Ю.Б. (1971). Для этого венозную кровь, получаемую из краевой ушной вены кроликов, стабилизировали 3,8% раствором цитрата натрия (рН 6,0) в соотношении 9:1. Полученную кровь

* - выражаем благодарность за проведенные исследования д.б.н. Васильеву П.М.

центрифугировали в течение 10 мин при 1000 об/мин. Функциональную активность тромбоцитов исследовали методом малоуглового светорассеяния [Э.Ф. Дергачев, патент RU 2108579, C1 6 G01 N 33/49].

Эксперименты проводили в термостатируемой кюветной камере. Гомогенность и изотропность гидродинамического турбулентного режима обеспечивались специальной конструкцией мешалки. На кювету, содержащую 5 мл среды и 0,1 мл плазмы, обогащенной тромбоцитами, под углом 90º направлялся свет от лазерного источника. Регистрация интенсивности светорассеяния осуществлялась фотодиодами в диапазоне углов 2-14 градусов (с шагом в 2 градуса), сигналы с фотодиодов через первичный блок преобразования поступали в регистрирующее устройство. Внесение тромбоцитов приводило к повышению начального сигнала (А), величина которого была пропорциональна концентрации клеток в кювете. Быстрое увеличение интенсивности светорассеяния в углу 12 градусов (А¹²) отражало процессы сферизации тромбоцитов, вызванные повышением уровня внутриклеточного кальция.

Динамика интенсивности светорассеяния рассчитывалась по формуле:

[(A₁ - А)/ А]×100%, где

А- начальная величина сигнала светопропускания;

А₁ – последующее ее значение при введении индуктора активации.

Исследуемое соединение и препарат сравнения – селективный агонист каппа-опиоидных рецепторов – U-50,488 изучали в концентрации 1×10^-4 М, время экспозиции составляло 2 минуты. Величины ЭК₅₀ рассчитывали методом регрессионного анализа.

Механизм каппа-рецепторного действия оценивали по способности угнетать вызванные электрической стимуляцией сокращения изолированного семявыносящего протока кролика (СПК), богатого каппа-опиоидными рецепторами [Oka T., 1980]. Исследования проводили на специальной установке фирмы Ugo Basile (Италия) для работы с изолированными органами. Выделенный препарат СПК длиной 10-15 мм закрепляли между двумя электродами и помещали в ванночку объемом 10 мл, содержащую физиологический раствор при температуре 37°С и постоянной аэрации воздухом. Регистрировали исходный сократительный ответ органов.

Исследуемое вещество и препарат сравнения – селективный агонист каппа-опиоидных рецепторов – U-50,488 добавляли в ванночку в возрастающих концентрациях. О степени каппа-опиоидергической активности судили по разнице сократительного ответа, вызванного электрической стимуляцией между контрольными и опытными значениями.

С помощью регрессионного анализа были рассчитаны показатели ЭК₅₀ – концентрации агониста, ингибирующей сократительный ответ гладкомышечного органа на 50%. Для подтверждения каппа-опиоидергического влияния соединений на сократительный ответ изолированных препаратов, проводили тесты с селективным каппа-антагонистом – норбиналторфимином (nor-BNI).

Для оценки опиоидного рецепторного механизма действия исследуемого вещества изучали его влияние на вызванные стандартной электрической стимуляцией сокращения изолированного сегмента подвздошной кишки крысы (ПКК), богатой μ-опиоидными рецепторами [Coupar I.M., 1995, Gray A.C., 2005]. До начала эксперимента животные содержались в условиях 24-часовой пищевой депривации при свободном доступе к воде. После декапитации производилось вскрытие брюшной полости, извлекался участок подвздошной кишки длиной 30 см (отступив минимум 10 см от слепой кишки) и помещался в теплый физиологический раствор Кребса. Стимуляцию проводили супра-максимальными 40 V прямоугольными импульсами продолжительностью 1 мсек и частотой 10 Гц, 8-секундными сериями, генерируемыми стимулятором ЭСЛ-2 (Россия). Серии импульсов подавались с интервалом в 3 минуты. Регистрация биологического ответа производилась с использованием комплекса аппаратуры UGO BASILE (Италия) для работы на изолированных органах и тканях лабораторных животных. Исследуемые вещества добавляли в ванночку в возрастающих концентрациях. О степени каппа-опиоидергической активности судили по разнице сократительного ответа, вызванного электрической стимуляцией между контрольными и опытными значениями. С помощью регрессионного анализа были рассчитаны показатели ЭК₅₀. Для подтверждения опиоидного характера действия веществ выполнялись тесты с антагонистом опиоидных рецепторов – налоксоном.

Оценку опиоидного компонента механизма обезболивающего действия изучаемого соединения проводили с помощью анализатора опиоидергической системы - неселективного антагониста опиоидных рецепторов - налоксона (10 мг/кг, п/к). Тестирование оценки анальгетической активности проводили на фоне совместного введения испытуемого вещества (в дозе ЭД₈₀, в/бр) и блокатора мю- подтипа опиоидных рецепторов. Исследование болевой чувствительности проводили на модели термического раздражения в тесте «Горячая пластина». В качестве препарата сравнения использовали буторфанола тартрат.

Исследование каппа-опиоидного механизма анальгетической активности проводили на фоне совместного введения изучаемого вещества (в дозе ЭД₈₀, в/бр) и селективного антагониста каппа-опиоидных рецепторов – норбиналторфимина (10 мг/кг, п/к). Анальгетическую активность исследуемого соединения и препарата сравнения – U-50,488 изучали на модели термического раздражения в тесте «Горячая пластина».

3. 
   Взаимодействия с анализаторами нейромедиаторных систем.
   

Для оценки нейрохимического спектра действия исследуемого вещества применялись разнообразные методические приемы при сочетанном введении исследуемого соединения с анализаторными агентами. Влияние на моноаминергические структуры мозга изучали в тестах с галоперидолом, апоморфином, фенамином, клофелином, резерпином, 5-гидрокситриптамином, L-ДОФА; холинергическое действие определялось с учетом модуляции эффектов ареколина, никотина; ГАМК-эргическое влияние - в тесте с пикротоксином, бикукуллином.

3. 
   Изучение общефармакологических свойств.
   

1. 
   Исследование острой токсичности соединения.
   

* - выражаем благодарность за проведенные исследования к.б.н, с.н.с НИИ фармакологии ВолгГМУ Мазановой Л.С.

движений, наличие судорог и их характер, наличие тремора, следующим показателям: характер двигательной активности, координация рефлекторных реакций на внешние раздражители (звуковые и тактильные), состояние шерстного

покрова (шерсть взъерошенная или гладкая, блестящая или тусклая) и рефлексам положения согласно принятой шкале при визуальном наблюдении [Irwin S., 1968]. Через сутки после введения вещества за животными наблюдали 2 раза в день утром и вечером в течение 2-х недель. Изучали острую токсичность субстанции, твердой и инъекционной лекарственной форм соединения РУ-1205.

2. 
   Влияние на развитие синдрома отмены с провокацией налоксона.
   

У мышей регистрировали число прыжков, корчей, встряхиваний, тремора в виде барабанного боя и птоза на протяжении одного часа после инъекции налоксона. Оценивали исходную массу тела мышей, массу через 4 часа и на 5 день после введения веществ, а также через 2 часа после инъекции налоксона. Критерием выраженности синдрома отмены считали уменьшение числа прыжковых реакций относительно группы, получавшей по такой же схеме морфин.

3. 
   Изучение общефармакологических свойств с использованием схемы многотестового наблюдения по Ирвину.
   

Тестируемое соединение вводили животным в дозах 0,1; 1; 10; 25; 50; 100 мг/кг. Наблюдение проводили в течение трех часов после введения соединения РУ-1205. Оценивали общее состояние, характер шерстного покрова. При оценке нервно-мышечной возбудимости фиксировали наличие судорог, парезов, тремора, подергиваний, рефлекторных реакций на внешние раздражители – звуковые (постукивание по клетке), тактильные (прикосновения к коже), наличие синдрома Штраубе. Регистрировали роговичный рефлекс и рефлекс со слухового прохода. Функциональное состояние вегетативной нервной системы оценивали по размеру зрачка, птозу верхнего века, уринации, дефекации, пилоэрекции, характеру и частоте дыхания. Влияние препарата на обменные процессы и терморегуляцию исследовали путем термометрии с помощью электротермометра («OMRON», Германия). Изучали эмоциональность (груминг, беспокойство, страх, агрессия, вокализация, настороженность) и двигательную (локомоции, стереотипия, реактивность, пассивность) активность. Возбудимость животных оценивали по общему уровню двигательной активности, степени их агрессивности. Реактивность рассматривали в связи с характером реакции животных на изменение окружающей обстановки (перемещение на открытый стол и т.д.). Мышечную координацию оценивали в тесте сцепления с горизонтальной проволокой (количество баллов соответствовало числу лап на проволоке). Настороженность определяли по ориентировочным рефлексам (при этом, в качестве раздражителя использовался хлопок руками). Агрессивность и пугливость животных оценивали при прикосновении корнцангом. Определение специфической антиноцицептивной активности проводили с использованием теста «Горячая пластина».

Статистическую обработку данных проводили с использованием программы «GraphPad Prism 5.0», Microsoft Office Excel 2003 (Microsoft, США) с использованием непараметрического метода сравнения независимых групп Манна-Уитни (U-test), точного критерия Фишера для альтернативных реакций, рангового однофакторного анализа Краскела-Уоллиса. Показатели ЭД₅₀, ЭК₅₀, рассчитывали методом наименьших квадратов. Для расчета ЛД₅₀ при изучении острой токсичности вещества РУ-1205 применяли классический метод Личфилда-Вилкоксона с использованием регрессионной статистики (Microsoft Excel), позволяющей рассчитывать этот показатель на основе результатов фармакологических испытаний изучаемого вещества по тестам с альтернативной формой реакции. Уровень значимости p<0,05.