ГЛАВА 3. ИЗУЧЕНИЕ АНТИНОЦИЦЕПТИВНОЙ АКТИВНОСТИ СОЕДИНЕНИЯ РУ-1205

Каппа-рецепторные лиганды являются перспективной группой веществ для разработки анальгетиков, лишенных серьезных побочных эффектов, характерных для типичных опиатов [Rusovici D.E., 2004; Butelman E.R., 2013]. Боль представляет собой сложную систему сенсорного, моторного, эмоционального реагирования с вовлечением когнитивных функций, факторов окружающей среды, гендерных различий, в значительной мере модулированных ЦНС [Kivell B., 2010]. Именно это объясняет отсутствие какой-либо одной специфической ноцицептивной модели, позволяющей в достаточной степени оценить боль, и необходимость при изучении анальгетической активности новых веществ одновременно использовать несколько поведенческих моделей болевых реакций с проведением комплексной оценки обезболивающего действия потенциальных анальгетиков [Martin M., 2003; Rice A., 2008].

Доклиническое изучение боли опирается на ноцицептивные тесты, которые включают в себя электрические, тепловые механические и химические раздражители. Некоторые из них основаны на определении латентного периода появления ноцицептивной реакции. В этом случае стимул можно рассматривать как фиксированный. Другие – на увеличении силы раздражителя, их называют переменными, третьи – на наблюдении и фиксировании определенной поведенческой реакции [Barrot M., 2012]. Модуляция боли может осуществляться на различных уровнях – периферическом, спинальном и супраспинальном. Для понимания нейронных механизмов болевых синдромов используют тесты на животных, включающие моделирование соматической, висцеральной, острой и тонической боли, индуцированной механическими, электрическими, термическими и химическими стимулами. Данная экспериментальная система позволяет получить спектр анальгетических характеристик новых веществ и в определенной мере прогнозировать характер их обезболивающего действия у человека [DeLeo J.A., 2006].

3.1. Обезболивающий эффект РУ-1205 при термическом раздражении в тесте «Горячая пластина».

При помещении животного на горячую поверхность и достижении порога болевой чувствительности регистрировали ноцицептивную реакцию в виде облизывание задней лапы. Латентный период ноцицептивного ответа на болевой раздражитель в контрольной группе мышей составлял 8,5±0,8 секунд. Соединение РУ-1205 при предварительном внутрибрюшинном введение в дозах 0,01; 0,1 и 1 мг/кг вызывало статистически значимое увеличение порога болевой реакции относительно контроля в 1,8; 2,5; 2,8 раз соответственно, тогда как буторфанола тартрат увеличивал латентный период ноцицептивной реакции в 1,5; 1,8 и 2 раза соответственно (табл. 3.1).

Исследуемое соединение превосходило препарат сравнения - буторфанол по анальгетической активности и широте терапевтического действия в 3,3 и 5,3 раза соответственно (табл. 3.2).

Учитывая, что для клиники более важно понятие «эффективность» лекарственных веществ, которую определяют по величине максимального эффекта, был рассчитан максимально возможный анальгетический эффект тестируемых веществ. Установлено, что соединение РУ-1205 в дозах 0,01; 0,1; 1 мг/кг превосходило по обезболивающей эффективности препарат сравнения в 1,7; 2,3; 1,3 раза соответственно (табл. 3.3).

Таблица 3.1

Влияние соединений РУ-1205 и буторфанола на антиноцицептивные эффекты в тесте «Горячая пластина» (при в/бр введении) (M±m).

Доза, мг/кг	Латентный период, сек
	РУ-1205	Буторфанол
Контроль (n=8)	8,5±0,8
0,001 (n=8)	12,0±1,4*	11,8±0,9*
0,01 (n=8)	15,4±1,3*	12,5±0,9*
0,1 (n=8)	20,9±2,6*	15,0±1,9*
1 (n=8)	23,5±2,6*	17,1±1,9*

Примечание: * -статистически значимо по отношению к контрольной группе животных (р≤0,05).

Таблица 3.2

Таблица 3.3.

При постепенно нарастающем электроболевом раздражении корня хвоста крыс наблюдались соответствующие ноцицептивные реакции: рефлекс «Отдергивания хвоста», голосовые реакции - «Вокализация», «Пролонгированная вокализация», характеризующие эмоциональный компонент боли. В группе контроля данные показатели составляли в среднем 0,72±0,05; 1,22±0,07 и 1,63±0,05 мВ соответственно.

Соединение РУ-1205 в изученном диапазоне доз 0,01-1,0 мг/кг при внутрибрюшинном введении оказывало дозозависимое антиноцицептивное действие. В тесте «Отдергивания хвоста» исследуемое вещество в дозах 0,01; 0,1; 1,0 мг/кг вызывало статистически значимое увеличение порогового напряжения ноцицептивной реакции на 59; 82 и 95% соответственно (p<0,05) (рис. 3.1). Значения порогового напряжения голосовой реакции животных в тестах «Вокализации» и «Пролонгированной вокализации» при внутрибрюшинном введении в дозах 0,01; 0,1; 1,0 мг/кг статистически значимо увеличивались на 64 и 61; 103 и 111; 128 и 132% соответственно (p<0,05) (рис. 3.2; 3.3). Максимальный антиноцицептивный эффект развивался на 90 мин наблюдения, выходил на плато, сохранялся достоверно высоким в течение периода регистрации (5 ч до 20% снижения анальгетической активности).

Рис. 3.1. Влияние соединения РУ-1205 и препарата сравнения - буторфанола тартрата на выраженность болевого синдрома при электрическом раздражении в тесте «Отдергивание хвоста» (в дозе ЭД₈₀, в/бр).

Рис. 3.2. Влияние соединения РУ-1205 и препарата сравнения - буторфанола тартрата на выраженность болевого синдрома при электрическом раздражении в тесте «Вокализация» (в дозе ЭД₈₀, в/бр).

Рис. 3.3. Влияние соединения РУ-1205 и препарата сравнения - буторфанола тартрата на выраженность болевого синдрома при электрическом раздражении в тесте «Пролонгированная вокализация» (в дозе ЭД₈₀, в/бр).

Установлено, что на данной экспериментальной модели наиболее выраженная антиноцицептивная активность отмечается на моделях алгезии, замыкающихся на уровне продолговатого мозга и таламуса, в тестах «Вокализация» и «Пролонгированная вокализация», где соединение РУ-1205 превосходит по величине обезболивающей активности и индексу относительной безопасности эталонный препарат в 3,3 и 5; 5,3 и 8 раз соответственно. В тесте «Отдергивания хвоста», характеризующем спинальный уровень организации болевой чувствительности, исследуемое соединение равно по уровню ЭД₅₀ и индексу относительной безопасности буторфанолу и превосходит препарат сравнения по продолжительности действия в 1,6 раза (табл. 3.4).

Таблица 3.4

Подкожное введение 2% формалина в поверхность задней лапки вызывало характерную бифазную поведенческую ноцицептивную реакцию «flinch» (поднятие лапки, облизывание, покусывание места инъекции): острую или I фазу (первые 10 минут с пиком действия через 5 минут после введения формалина) и воспалительную или II фазу (с 10 по 60 минуту с максимальной реакцией на 30 минуте) ноцицептивного ответа.

При подкожном введении формалина количество болевых реакций в виде поднятия конечности у контрольных животных в первой фазе составило 142,2±8,0, во второй фазе – 381,6±15,2.

В первой фазе формалинового теста соединение РУ 1205 при внутрибрюшинном введении в дозах 0,01; 0,1 и 1 мг/кг уменьшало число вздрагиваний конечности на 27%, 39% и 55% соответственно. Во второй фазе – на 15%, 42% и 54% соответственно. В данном тесте анальгетическая активность исследуемого соединения была равна препарату сравнения – буторфанолу (рис.3.4).

По уровню ЭД₅₀ тестируемое вещество было равно буторфанолу и превосходило эталонный препарат по широте терапевтического действия во II фазе ноцицептивного ответа в 1,8 раза (табл. 3.5).

А.

Б.

Рис. 3.4. Влияние соединения РУ-1205 и буторфанола на болевой порог крыс в тесте формалиновой боли (при в/бр введении): А - влияние соединений в острой фазе; Б - влияние соединений в воспалительной фазе.

Таблица 3.5

Уксусная кислота при внутрибрюшинном введении раздражает серозные оболочки и вызывает у мышей сокращение абдоминальной мускулатуры. В контрольной группе животных среднее число корчей составило 27,9±1,8. Вещество РУ-1205 изменяло болевую чувствительность – вызывало дозозависимое снижение числа корчей. Так, в дозе 0,01 мг/кг исследуемое соединение уменьшало количество корчей на 37% относительно уровня контрольной группы, в дозах 0,1 мг/кг и 1 мг/кг – на 55% и 77% соответственно. Препарат сравнения – буторфанол в дозах 0,01 мг/кг; 0,1 мг/кг и 1 мг/кг ингибировал уксусные корчи на 35%; 50% и 82% соответственно (табл. 3.6).

Таблица 3.6

Влияние соединений РУ-1205 и буторфанола на антиноцицептивные эффекты в тесте «Уксусные корчи» (при в/бр введении) (M±m).

На модели механической гипералгезии величина болевого порога в контрольной группе животных составила 729,5±47,2 г.

Тестируемое соединение РУ-1205, как и буторфанол, дозозависимо увеличивало порог болевой чувствительности в ответ на действие нарастающего механического стимула, точечно приложенного к задней лапке крысы в условиях формалиновой гипералгезии. Исследуемое вещество в диапазоне доз 0,01-1,0 мг/кг вызывало статистически значимое увеличение порога отдергивания лапки на 17,3; 59,2 и 100% соответственно (p<0,05) (табл.3.7).

По уровню ЭД₅₀, индексу относительной безопасности соединение РУ-1205 было сопоставимо с препаратом сравнения - буторфанолом (табл. 3.8).

Таблица 3.7

Влияние вещества РУ-1205 и буторфанола на величину болевого порога при механическом давлении в тесте Рандалл-Селитто (при в/бр введении) (M±m).

*- ЛД₅₀ буторфанола тартрата (в/бр, мыши) по данным BBPSDY Pharmacology and Biochemical Properties of Drug Substances (American Pharmaceutical Assoc., 2215 Constitution Ave., NW, Washington, DC 20037).

При моделировании нейропатического болевого синдрома, вызванного перевязкой седалищного нерва значение 50% порога болевой реакции в контрольной группе животных составило 1,42±0,3 г.

Исследуемое соединение РУ-1205 на 14 день после перевязки при ежедневном внутрибрюшинном введении в дозе 1 мг/кг повышало порог тактильной аллодинии на 64% по отношению к контрольной группе. Препарат сравнения – буторфанола тартрат превосходил изучаемое соединение на данной ноцицептивной модели в 4 раза (табл. 3.9).

Таблица 3.9

Соединение РУ-1205 при подкожном введении на модели электрического раздражения в тесте «Отдергивание хвоста» проявляло выраженную антиноцицептивную активность с максимальным значением через 2 часа после ведения вещества. Анальгетический эффект сохранял статистически значимые величины по отношению к контрольной группе животных до 4 часов экспериментального исследования.

При подкожном пути введения соединение РУ-1205 циркулирует в плазме крови на протяжении 12 ч. Фармакокинетическая кривая носит моноэкспоненциальный характер. Максимальная концентрация наблюдается через 30 мин после введения и составляет 10,2 мкг/мл, после чего происходит резкое снижение ее значения. Начиная со второго часа исследования, концентрация соединения РУ-1205 находится в состоянии равновесия.

При изучении взаимосвязи фармакокинетических и обезболивающих свойств отмечается разница во времени достижения пика концентрации и максимального антиноцицептивного эффекта соединения РУ-1205, что можно объяснить особенностями прохождения через гематоэнцефалический барьер. Также было отмечено, что через 8 часов исследования наблюдается повторное незначительное увеличение анальгетическгого эффекта, в то время как концентрация находится в состоянии равновесия (рис.3.5). Данные результаты свидетельствуют о возможном наличии активных метаболитов.

Рис. 3.5. Зависимость изменения порога болевой чувствительности по отношению к контролю и изменения содержания соединения РУ-1205 в плазме крови после подкожного введения.

В результате проведенных исследований была выявлена выраженная дозозависимая анальгетическая активность вещества РУ-1205 на различных моделях ноцицептивных реакций.

Установлено, что изучаемое соединение эффективно блокирует ноцицептивные реакции на спинальном, супраспинальном уровнях организации болевой чувствительности, запускает как центральные, так и периферические механизмы анальгезии. Наиболее выраженное антиноцицептивное действие отмечается на центральных моделях алгезии в тестах «Горячая пластина», «Вокализация» и «Пролонгированная вокализация», где соединение РУ-1205 превосходит по обезболивающей активности и индексу относительной безопасности эталонный препарат в среднем в 4 и 6 раз соответственно. В тестах, характеризующих периферический уровень организации болевой чувствительности (Рандалл-Селитто, «уксусных корчей», формалиновой боли), исследуемое вещество равно по уровню ЭД₅₀ буторфанолу. На модели нейропатического болевого синдрома исследуемое соединение статистически значимо уменьшает развитие тактильной аллодинии после перевязки седалищного нерва, хотя и уступает по активности препарату сравнения.

Величина максимальной анальгетической активности соединения РУ-1205 не совпадает по времени с пиком концентрации в плазме крови, что, вероятно, связано с особенностями проникновения тестируемого вещества через гематоэнцефалический барьер. Повторное увеличение обезболивающей активности без возрастания концентрации может свидетельствовать о наличии метаболитов соединения РУ-1205.