ГЛАВА 4. ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМОВ АНАЛЬГЕТИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ СОЕДИНЕНИЯ РУ-1205

Мишенями действия опиоидов для осуществления их фармакологических эффектов являются три типа опиоидных рецепторов - µ, δ, κ [Pan Z.Z., 1998]. Несмотря на широкое распространение классических опиоидных анальгетиков – агонистов µ-опиоидных рецепторов, их применение ограничено серьезными побочными эффектами, такими как угнетение дыхательного центра, наркогенный потенциал, развитие толерантности к анальгетическому действию [Cod E.E., 2009; Yekkirala A.S., 2013]. Известно, что селективные агонисты κ – опиоидных рецепторов наряду с выраженной анальгетической активностью, не вызывают нежелательных эффектов, характерных для типичных опиоидов [Millan M.J., 1989].

Для изучения селективности к κ-опиоидным рецепторам и выявления побочных эффектов, связанных с влиянием на µ-рецепторы, используется целый ряд информативных подходов, включающих как исследования in vitro, так и in vivo: биохимические, иммунологические, методы по радиолигандному связыванию, а также компьютерные технологии in silico [Воронина Т.А., 2012]. Вместе с тем, несмотря на точные количественные характеристики степени сродства веществ и рецепторных комплексов, получаемых при помощи этих методов, основным их недостатком является использование в качестве объекта изучения лиганд-связывающих участков рецепторных структур, а не собственно функционально активных рецепторных комплексов. С этих позиций, значительный интерес представляют модели, основанные на исследовании свойств функционально активных рецепторов в условиях, близких нативным. В рамках данного подхода для оценки каппа-рецепторного механизма действия вещества РУ-1205 проведено комплексное исследование, включающее серию экспериментов in silico, in vitro на тромбоцитах и изолированных органах, а также на моделях экспериментальной патологии in vivo.

4.1. Изучение механизма анальгетического действия соединения РУ-1205 in silico.

Для подтверждения каппа-рецепторного механизма действия вещества РУ-1205 in silico были построены методами молекулярной механики и квантовой химии 3D-модели протестированного вещества и селективного каппа-агониста U50,488, выполнен 2D-,3D-анализ сходства структур с последующим докингом в сайт связывания 3D-модели каппа-рецептора.

Установлено, что исследуемое соединение РУ-1205 имеет достаточно высокое 3D-геометрическое сходство с высокоселективным каппа-опиоидным агонистом U-50,488 и образует прочный лиганд-рецепторный комплекс, для которого расчетная величина энергии докинга сопоставима с соответствующим показателем для U-50,488 (табл. 4.1; рис. 4.1).

Таблица 4.1

Рис. 4.1. Модель сайта связывания каппа-опиоидного рецептора с докированными молекулами РУ-1205 и каппа-селективного агониста U-50,488

Соединение РУ-1205 проявляет высокую каппа-агонистическую активность in vitro на тромбоцитах кролика. Исследуемое соединение вызывало дозозависимую норбиналторфимин-обратимую активацию тромбоцитов и превосходило по каппа-опиоидному рецепторному действию, индексу относительной безопасности препараты сравнения буторфанол и U-50,488 в 2,3; 2,6 и 5,3; 35,8 раз соответственно (табл. 4.2).

Таблица 4.2

Величина каппа-агонистической активности (ЭК₅₀), острой токсичности (ЛД₅₀), условного терапевтического индекс (ТИ = ЛД₅₀/ ЭК ₅₀) буторфанола, U-50,488, вещества РУ-1205 на модели активации тромбоцитов методом малоуглового светорассеяния.

** Res. Compl. Med., 11, 144-149 (2004).

Низкочастотная электрическая стимуляция (10 Гц, амплитуда 50 Вт, 2 мсек) изолированных сегментов семявыносящего протока кролика (СПК) вызывала сокращения гладкомышечных препаратов. Соединение РУ-1205 проявило высокую концентрационно-зависимую эффективность, подавляя вызванные электрической стимуляцией сокращения препарата СПК в диапазоне наномолярных концентраций (рис. 4.2). Ингибирующая активность (ЭК₅₀) изучаемого соединения и препаратов сравнения рассчитывались методом регрессионного анализа (рис. 4.3). По величине ЭК₅₀ соединение РУ-1205 было равно селективному агонисту каппа-опиоидных рецепторов - U-50,488 и превосходило буторфанола тартрат. Эффекты изучаемого вещества на фоне инкубации ткани с селективным антагонистом каппа-опиоидных рецепторов nor-BNI в концентрации 1 µM угнетались на 91%. Норбиналторфимин блокировал эффекты U-50,488 на 79%, а буторфанола на 56% (рис. 4.4).

Рис. 4.2. Влияние соединения РУ-1205, U-50,488 и буторфанола на вызванные электрической стимуляцией сокращения препарата семявыносящего протока кролика.

Рис. 4.3. Определение величины эффективной концентрации (ЭК₅₀) для соединения РУ-1205 и U-50,488 на модели сокращения препарата изолированного семявыносящего протока кролика.

Рис . 4.4. Влияние соединений РУ-1205, U-50,488 и буторфанола (в дозе ЭД₈₀) на вызванные электрической стимуляцией сокращения препарата семявыносящего протока кролика.

& - статистически значимо по отношению к буторфанол-индуцированным эффектам (р≤0,05).

Соединение РУ-1205 и буторфанол в диапазоне наномолярных концентраций оказались не эффективны и только в максимальных концентрациях (100 µМ) проявляли незначительное (23,8% и 27,6% соответственно) ингибирующее влияние на вызванное электрической стимуляцией сокращение препарата кишечника, которое не устранялось как в присутствии каппа-селективного антагониста норбиналторфимина, так и неизбирательного опиоидного антагониста налоксона. Тогда как морфин налоксонообратимо подавлял электроиндуцированные сокращения изолированного отрезка подвздошной кишки крысы (рис. 4.5). При этом показатель ЭК₅₀ на указанной экспериментальной модели составил 2,6×10^-7М, что согласуется с данными литературы [Gray A.C., 2005].

Рис. 4.5. Влияние неселективного опиоидного антагониста налоксона на ингибирование сократительной активности подвздошной кишки крысы морфином и соединением РУ-1205.

Специфичность опиоидного характера действия соединения РУ-1205 оценивали in vivo на модели термического раздражения в тесте «Горячая пластина». Тестирование болевой чувствительности проводили на фоне совместного введения исследуемого вещества и неселективного антагониста опиоидных рецепторов налоксона (10 мг/кг, п/к). Вещество РУ-1205 и препарат сравнения – буторфанола тартрат в дозе ЭД₈₀ при внутрибрюшинном введении вызывали статистически значимое налоксонобратимое действие (рис.4.6).

Рис. 4.6. Влияние соединений РУ-1205 и буторфанола тартрата (в дозе ЭД₈₀) при предварительном введении налоксона (10 мг/кг, п/к) на антиноцицептивные эффекты в тесте «Горячая пластина».

Для подтверждения влияния соединения РУ-1205 на каппа-рецепторный компонент анальгетической активности были проведены исследования с селективным антагонистом каппа-опиоидных рецепторов – норбиналторфимином в тесте «Горячая пластина».

При предварительном подкожном введении селективного антагониста каппа-опиоидных рецепторов – норбиналторфимина (10 мг/кг) анальгетическая активность соединения РУ-1205 и препарата сравнения – U-50,488 статистически значимо уменьшалась в 6,2 и 2,2 раза соответственно (рис. 4.7).

Рис. 4.7. Влияние соединений РУ-1205 и U-50,488 (в дозе ЭД₈₀) при предварительном введении норбиналторфимина (10 мг/кг) на антиноцицептивные эффекты в тесте «Горячая пластина».

Результаты проведенного исследования по изучению механизма действия соединения РУ-1205 свидетельствуют о селективности действия к каппа-опиоидным рецепторам. Так, на первом этапе экспериментального исследования механизма действия методом in silico было установлено, что соединение РУ-1205 проявляет свойства каппа-агониста и по прогнозной оценке величины активности сопоставимо с таковой высокоизбирательного агониста каппа-опиоидных рецепторов - U50,488. Для подтверждения полученных данных были проведены исследования in vitro на тромбоцитах кролика и изолированных органах животных и определено, что тестируемое вещество оказывает выраженную каппа - агонистическую активность и не влияет на мю-опиоидные рецепторы. В экспериментальных исследованиях in vivo тестируемое вещество вызывает норбиналторфимин-обратимую антиноцицептивную активность на центральной модели экспериментальной патологии.

Нейротропные средства, в том числе и каппа-селективные агонисты, реализуют свои эффекты с вовлечением различных нейромедиаторных систем мозга [Pasternak G.W., 2011]. Для расширения представлений о механизме действия нового соединения актуальным является изучение его влияния на проявления действия различных нейромедиаторных анализаторов [Воронина Т.А., 2012]. Исследование влияния новых молекул на нейрональные процессы в ЦНС представляет интерес не только с точки зрения выяснения общих принципов их действия, но и дальнейшей разработки рациональных путей поиска более совершенных лекарственных средств с заданными свойствами и минимальными нежелательными эффектами.

Для оценки спектра нейротропной активности применяют разнообразные методические приемы при совместном введении исследуемого соединения с анализаторными агентами, избирательно влияющие на определенные нейромедиаторные системы как в результате позитивного (агонисты, предшественники моноаминов, ингибиторы МАО), так и негативного (блокаторы поглощения, депонирования медиатора, антагонисты) действия. Данный подход позволяет оценить преимущественный вклад нейромедиаторов и взаимодействующих с ними структур в реализацию нейротропных эффектов изучаемого вещества и уточнить нейрохимические основы его действия.

5.1. Взаимодействие с дофаминергическими структурами головного мозга.

5.1.1. Влияние на каталептогенный эффект галоперидола.

Известно, что типичные нейролептики вызывают у животных выраженную каталепсию, обусловленную стереоселективной блокадой D₂-рецепторов на уровне стриарной системы, что в значительной степени коррелирует с выраженностью экстрапирамидных расстройств [Воронина Т.А., 2012].

Галоперидол в дозе 1 мг/кг при внутрибрюшинном введении индуцировал развитие состояния каталепсии, проявляющееся в застывании животного в непривычной позе. Через 30 минут наблюдения выраженность эффекта у контрольных животных составляла 5,1±0,5 баллов и достигала максимальных значений к 60 минуте исследования.

Установлено, что тестируемое вещество РУ-1205 при внутрибрюшинном введении в дозе 1 мг/кг не вызывало статистически значимых изменений каталептогенных свойств галоперидола у крыс опытной группы по сравнению с контрольными животными, получавшими галоперидол (табл.5.1).

Таблица 5.1

Влияние соединения РУ-1205 (1 мг/кг в/бр) на каталептогенный эффект галоперидола (1 мг/кг в/бр) у крыс (M±m).

Фенамин при введении животным увеличивает спонтанную двигательную активность, что предположительно может быть обусловленно непрямой стимуляцией D₂-рецепторов и, как следствие, усилением дофаминергической нейропередачи в мезолимбической системе мозга [Островская Р.У., 2012].

При внутрибрюшинном введении в дозе 5 мг/кг фенамин в 2,3 раза увеличивал показатели локомоторной активности грызунов в актометре. Соединение РУ-1205 в дозе 1 мг/кг при внутрибрюшинном введении статистически значимо снижало фенамин-индуцированные поведенческие проявления на 47,3% (табл. 5.2).

Таблица 5.2

Данный тест является одним из наиболее информативных и широко используется для выявления способности веществ блокировать дофаминергическую нейропередачу в нигростриатной системе мозга [Островская Р.У., 2012].

Исследуемое вещество РУ-1205 в дозе 1 мг/кг при внутрибрюшинном введении статистически значимо не влияло на выраженность апоморфин-индуцированной стереотипии (1 мг/кг) у животных (табл. 5.3).

Таблица 5.3

Эксперименты с предшественником дофамина проводись для выявления у тестируемого вещества MAO-ингибирующего действия.

Известно, что большие дозы L-ДОФА (500 мг/кг) в отличие от малых (100-150 мг/кг) вызывают стереотипию. Соединения со свойствами ингибиторов МАО будут потенцировать эффекты малых доз анализаторного вещества, и, соответственно, демонстрировать поведенческие реакции, характерные для высоких доз L-ДОФА.

Так, предшественник дофамина L-ДОФА в дозе 500 мг/кг вызывал развитие стереотипии, тогда как низкие дозы анализатора (100 мг/кг) не приводили к каким-либо изменениям поведенческой активности мышей. Комбинация тестируемого соединения РУ-1205 + L-ДОФА не оказывала модулирующего влияния на дофаминергическую нейротрансмиссию и, как следствие, поведенческие эффекты низких доз L-ДОФА (табл. 5.4).

Таблица 5.4

Влияние соединения РУ-1205 (1 мг/кг в/бр) на эффекты L-Дофа (100 мг/кг в/бр), (M±m).

При введении Н-холиномиметика - никотина в дозе 6 мг/кг подкожно у экспериментальных животных отмечался тремор. Сочетанное введение соединения РУ-1205 в дозе 1 мг/кг и анализаторного вещества не вызывало статистически значимых изменений латентного периода и длительности тремора по отношению к контрольной группе животных, получавшей никотин (табл. 5.5).

Таблица 5.5

Влияние вещества РУ-1205 (1 мг/кг в/бр) на выраженность никотин-индуцированного (6 мг/кг п/к) тремора (M±m).

Вещество/группа__Ректальная_температура,_С°'>Вещество/группа__Латентный_период,_мин__Длительность_тремора,_мин'>Вещество/группа	Латентный период, мин	Длительность тремора, мин
Интактный контроль (n=10)	-	-
Контроль (РУ-1205) (n=10)	-	-
Контроль (Никотин) (n=10)	1,1±0,1	3,3±0,3
РУ-1205 + Никотин (n=10)	1,2±0,2	3,2±0,4

5.2.2. Влияние на ареколиновый тремор.

Данный тест позволяет выявить или исключить возможные центральные М-холинергические свойства в нейромедиаторном спектре действия соединения РУ-1205. Ареколин вызывает тремор у самцов беспородных мышей, связанный с активацией М-холинорецепторов [Воронина Т.А., 2012]. Ареколин при подкожном введении в дозе 25 мг/кг индуцировал развитие тремора у мышей. Соединение РУ-1205 в дозе 1 мг/кг существенно не влияло на стимулирующие эффекты ареколина (табл. 5.6).

Таблица 5.6

Влияние соединения РУ-1205 (1 мг/кг в/бр) на выраженность ареколинового (25 мг/кг п/к) тремора (M±m).

Вещество/группа	Длительность тремора, мин
Интактный контроль (n=10)	-
Контроль (РУ-1205) (n=10)	-
Контроль (Ареколин) (n=10)	15,5±0,9
РУ-1205 + Ареколин (n=10)	17,8±0,8

5.3. Воздействие на адренергическую систему.

5.3.1. Влияние на гипотермический эффект клофелина.

Данный тест позволяет изучить возможное вовлечение адренергических нейрохимических механизмов в реализацию действия нового соединения, в основе которого лежит способность модулировать эффекты стимуляции пресинаптических ₂-адренорецепторов низкими дозами клофелина. При этом регистрируется резкое уменьшение потока симпатической импульсации из ЦНС, выраженное снижение секреции норадреналина из нервных окончаний, что сопровождается гипотермией, общим угнетением, уменьшением двигательной активности [Андреева Н.И., 2005].

Клофелин в дозе 0,1 мг/кг индуцировал статистически значимое понижение ректальной температуры максимально на 4,4˚С (р<0,05) на 90 и 120 минутах наблюдения по сравнению с интактными животными. Соединение РУ-1205 не оказывало статистически значимого действия на эффекты клофелина (табл. 5.7).

Таблица 5.7

Основные эффекты резерпина связаны с нарушением способности везикул, содержащих медиаторы, захватывать, сохранять биогенные амины за счет взаимодействия с механизмом захвата, зависимым от Mg²⁺, АТФ, что ведет к истощению запасов норадреналина, дофамина, серотонина в нейронах мозга. В экспериментах in vivo резерпин оказывает депрессивное влияние на структуры мозга животных, вызывая уменьшение двигательной активности, гипотермию, блефароптоз и другие эффекты [Воронина Т.А., 2012].

В контрольной группе животных резерпин в дозе 2,5 мг/кг при внутрибрюшинном введении оказывал выраженное действие: понижение ректальной температуры на 4,1˚С (р<0,05), блефароптоз выраженностью 2,8±0,3 балла, резкое угнетение локомоторной активности на 97 % (р<0,05). Изучаемое вещество РУ-1205 в дозе 1 мг/кг не влияло на выраженность гипотермии, блефароптоза, а также двигательных расстройств (табл. 5.8).

Таблица 5.8

В настоящее время накоплен фактический материал, свидетельствующий о важной роли ГАМК-ергической системы в осуществлении антиноцицептивного действия известных каппа-опиоидных агонистов [Lemos J.C., 2011; Schwarzer C., 2011]. Для изучения возможного участия ГАМК-ергической системы в реализации противосудорожного эффекта, проводят исследования с пикротоксином и бикукуллином, оказывающим влияние на разные участки ГАМК-ергического рецепторного комплекса.

В тесте с антагонистом ГАМК_А-рецепторов - пикротоксином исследуемое вещество РУ-1205 статистически значимо увеличивало латентный период развития тремора, клонических судорог в 2,4 и 1,2 раза соответственно и уменьшало (на 24,4%) число пикротоксин-индуцированных судорожных припадков (р<0,05) (табл. 5.9).

Таблица 5.9

Влияние соединения РУ-1205 (1 мг/кг в/бр) на эффекты пикротоксина (2,5 мг/кг в/бр) у мышей, (M±m).

При подкожном введении бикукуллина в дозе 2,7 мг/кг наблюдалось развитие повторяющихся клонических судорог у экспериментальных животных. Соединение РУ-1205 в дозе 1 мг/кг приводило к статистически значимому увеличению длительности латентного периода развития судорог в 1,4 раза и снижению числа судорожных приступов в 2,2 раза по сравнению с контрольной группой животных, получавшей бикукуллин (табл. 5.10).

Таблица 5.10

Влияние соединения РУ-1205 (1 мг/кг, в/бр) на эффекты бикукуллина у мышей (M±m).

Предшественник серотонина — 5-окситриптофан — вызывает у мышей характерный гиперкинез в виде резких встряхиваний головой (twitches) продолжительностью 30–60 мин, что объясняется активацией серотонинергической системы ЦНС [Островская Р.У., 2012].

В ходе эксперимента отмечался 5-окситриптофан-индуцированный феномен резкого встряхивания головой с максимумом действия с 10 по 20 минуту регистрации с последующим постепенным снижением эффекта. Комбинация изучаемого вещества РУ-1205 в дозе 1 мг/кг с метаболическим предшественником серотонина статистически значимо не влияло на стимулирующие эффекты 5-окситриптофана (табл. 5.11).

Таблица 5.11

В результате изучения влияния соединения РУ-1205 с установленной каппа-опиоидной активностью на другие нейромедиаторные системы были выявлены нейрохимические закономерности его действия.

В тесте с фенамином, было выявлено статистически значимое снижение гиперактивности мышей по сравнению с контрольной группой животных, которым вводили фенамин. Данные результаты предположительно могут указывать на способность исследуемого соединения блокировать дофаминовую нейропередачу в мезолимбической системе мозга. Однако нельзя исключать и другие механизмы снижения двигательного поведения животных, учитывая, то, что фенаминовая гиперактивность может быть обусловлена высвобождением из нервных окончаний различных катехоламинов (норадреналина, дофамина и серотонина) [Robertson S. D., 2009; Kleijn J., 2012].

При проведении исследований с пикротоксином и бикукуллином, моделирующих судороги, было выявлено противосудорожное действие соединения РУ-1205. Вероятно, данная активность может быть обусловлена как аллостерическими взаимодействиями с компонентами ГАМК-_А рецепторного комплекса [Birnir В., 2000] так и влиянием на Ca²⁺-зависимые-K⁺ токи [Pflieger J.F., 2002].

Было выявлено, что тестируемое вещество не оказывает влияния на эффекты адренергических, серотонинергических и холинергических анализаторов нейромедиаторных систем.