ГЛАВА 7. ИЗУЧЕНИЕ ОБЕЗБОЛИВАЮЩИХ СВОЙСТВ СОЕДИНЕНИЯ РУ-1205 В ТВЕРДОЙ И ИНЪЕКЦИОННОЙ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМАХ

Одной из важных задач биофармацевтического исследования при создании нового лекарственного препарата является выбор оптимальной лекарственной формы.

Несмотря на расширяющийся поиск альтернативного пути введения лекарственных средств, пероральный остается наиболее популярным, так как данный способ введения является самым приемлемым и удобным для пациентов. Кроме того, это наиболее изученный и отработанный метод заводского производства. К преимуществам таблеток относятся: точное дозирование в условиях массового производства, длительное действие, последовательное всасывание, маскировка неприятных органолептических свойств лекарственных веществ за счет нанесения оболочек, полная механизация процесса изготовления, обеспечивающая высокую производительность, чистоту и гигиеничность таблеток [Yadav G., 2012; Nyol S., 2013].

Тем не менее, при купировании сильного болевого синдрома, возникающего как следствие травмы или заболевания необходимо быстрое наступление фармакологического действия препарата. Наиболее быстрый эффект развивается при парентеральном пути введения, при котором происходит попадание лекарственного вещества сначала в кровь, а затем в зону рецепторов. Чаще всего парентерально вводят инъекционные растворы, обеспечивающие быстрое поступление лекарственного вещества в кровяное русло [York P., 2013].

Величина фармакологической активности лекарственного средства может изменяться в зависимости от применения его в различных лекарственных формах. Таким образом, целесообразным является изучение анальгетической активности соединения РУ-1205 в твердой дозированной и инъекционной лекарственной формах.

7.1. Влияние соединения РУ-1205 в твердой дозированной лекарственной форме на болевой порог при термическом раздражении в тесте «Горячая пластина».

При помещении мыши на горячую поверхность и достижении порога болевой чувствительности латентный период ноцицептивной реакции в виде облизывания задней лапы в контрольной группе животных составил 7,3±0,7 секунд.

Субстанция и гранулят таблеток соединения РУ-1205 в дозе 5 мг/кг при пероральном введении статистически значимо увеличивали латентный период болевой реакции максимально на 146,1 и 138,8% соответственно.

Через 15 минут после введения субстанции соединения РУ-1205 порог болевой реакции статистически значимо повышался на 81,8% и достигал максимального эффекта к 60 минуте. При изучении обезболивающей активности гранулята таблеток РУ-1205 наблюдалось медленное возрастание анальгетического действия с пиком максимального эффекта к 5 часу исследования. Продолжительность действия лекарственной формы сохранялась до 8 часов (Рис.7.1.).

При оценке пикового времени и продолжительности анальгезии, вызванной гранулятом таблеток, было установлено смещение кривой зависимости «время-эффект» вправо и увеличение продолжительности действия в 1,5 раза по сравнению с таковыми субстанции вещества РУ-1205.

Рис. 7.1. Влияние субстанции и гранулята таблеток соединения РУ-1205 на антиноцицептивные эффекты в тесте «Горячая пластина» (5 мг/кг, per os).

Латентный период ноцицептивного ответа на термическое раздражение в контрольной группе животных составлял 8,9±0,8 секунд.

При подкожном введении субстанции и лиофилизата соединения РУ-1205 в дозе 1мг/кг наблюдалось сходное возрастание обезболивающей активности с пиком максимального эффекта через 2 часа после их введения (86,5% и 104,5% соответственно). Далее следовало медленное снижение анальгетической активности субстанции и лиофилизата исследуемого соединения (рис. 7.2).

По величине обезболивающей активности и продолжительности действия статистически значимых различий между субстанцией и инъекционной лекарственной формой выявлено не было.

Рис. 7.2. Влияние субстанции и лиофилизата соединения РУ-1205 на антиноцицептивные эффекты в тесте «Горячая пластина» (1 мг/кг, п/к).

В результате проведенных исследований было установлено, что гранулят таблеток и лиофилизат соединения РУ-1205 проявляют статистически значимую анальгетическую активность равную субстанции исследуемого вещества на модели термического раздражения в тесте «Горячая пластина».

Обезболивающий эффект субстанции соединения РУ-1205 и лекарственных форм вещества при подкожном и пероральном введении является статистически значимым и сохраняется до 8 часов экспериментального исследования.

При оценке пикового времени и продолжительности анальгезии отмечается некоторая пролонгация обезболивающей активности гранулята таблеток изучаемого соединения по сравнению с субстанцией, что, вероятно, связано с фармакокинетическими особенностями.

По фармакодинамическим показателям статистически значимых различий в анальгетической активности между субстанцией и лиофилизатом соединения РУ-1205 выявлено не было.

ГЛАВА 8. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Опиоидные анальгетики используются для лечения боли на протяжении многих столетий и являются наиболее эффективным классом лекарственных препаратов, применяемых при различных видах болевых синдромов [Ahlbeck K., 2011]. Несмотря на то, что опиоиды являются одними из самых мощных анальгетиков, доступных для лечения большинства видов сильных болей, их клиническое использование ограничено рядом побочных эффектов, которые могут быть периферическими и центральными [McNicol E., 2003]. Другими важными проблемами использования опиоидных анальгетиков являются толерантность к обезболивающему действию и развитие зависимости [Collett B.J., 1998; Ballantyne J.C., 2003].

Одним из перспективных направлений создания новых анальгетиков является поиск их среди избирательных агонистов опиоидных рецепторов [Kivell B., 2010]. Агонисты каппа-опиоидных рецепторов привлекают особое внимание благодаря их способности оказывать мощный обезболивающий эффект без явлений зависимости и побочных эффектов, характерных для мю-агонистов [Clark C.R., 1988; Hunter J.C.,1990]. Таким образом, каппа-опиоидные рецепторы рассматриваются как потенциальная мишень действия новых безопасных анальгетиков [Kivell B., 2010].

Предварительные исследования по направленному поиску агонистов каппа-опиоидных рецепторов в Волгоградском государственном медицинском университете позволили выявить соединение под лабораторным шифром РУ-1205 с выраженной каппа-агонистической активностью [Гречко О.Ю., 2010].

Существуют убедительные доказательства потенциальной роли каппа-опиоидной рецепторной системы в развитии анальгезии с вовлечением различных структур коры головного мозга, среднего, ствола мозга, спинного мозга, периферических отделов нервной системы, каждый из которых вносит свой вклад в формировании сенсорного феномена [Pasternak G.W., 2011]. В литературных источниках имеются многочисленные данные об эффективности агонистов каппа-опиоидных рецепторов при различных болевых синдромах [Wilson J.L., 2000; Dortch-Carnes J., 2005; Nakao K., 2010]. Так, селективные агонисты каппа-опиоидных рецепторов используют при купировании послеоперационной боли, ожоговой травме [Wilson J.L., 2000; Camilleri M., 2008], нейропатическом болевом синдроме [Tao Y., 2008; Vanderah T., 2010], висцеральной боли при перитоните, хирургических вмешательствах, панкреатите, дисменорее [Rivière P., 2004; Tao Y., 2008; Wang Y., 2010; Pasternak, 2011], ревматоидном артрите [Kivell B., 2010].

Изучение антиноцицептивной активности нового соединения – РУ-1205 позволило выявить выраженное дозозависимое анальгетическое действие исследуемого вещества на различных ноцицептивных моделях, характеризующих различные уровни организации болевой чувствительности. Установлено, что обезболивающее действие тестируемого вещества реализуется на различных уровнях проведения и модуляции ноцицептивной чувствительности с вовлечением сложноорганизованной системы сегментарных, супрасегментарных и периферических нейрофизиологических механизмов. Наиболее выраженная анальгетическая активность отмечалась на центральных моделях алгезии, характеризующих супраспинальный уровень болевой чувствительности, где соединение РУ-1205 превосходило по обезболивающей активности и индексу относительной безопасности, в диапазоне изучаемых доз, препарат сравнения в среднем в 4 и 6 раз, соответственно. В тестах, характеризующих периферический уровень организации болевой чувствительности, исследуемое вещество было равно по величине обезболивающей активности буторфанолу. Тест «Горячая пластина» характеризуется самой сложной организацией рефлекса на супрспинальном уровне и вовлекает корковые и подкорковые структуры головного мозга [Le Bars, 2001].

Модель электрического раздражения корня хвоста крыс позволяет оценить обезболивающий эффект исследуемого соединения на супраспинальном и спинальном уровне организации болевой чувствительности. Так, тест «Отдергивание хвоста» является показателем спинальной аналгезии и позволяет оценить наличие центрального механизма обезболивающего действия соединения [Carrol N. M., Lim P. K., 1960], а в тесты «Вокализация» и «Пролонгированная вокализация» вовлекаются, главным образом, структуры ствола мозга. В данном экспериментальном исследовании наиболее выраженная обезболивающая активность отмечалась на моделях алгезии, замыкающихся на уровне продолговатого мозга и таламуса, в тестах «Вокализация» и «Пролонгированная вокализация», где соединение РУ-1205 превосходило по величине обезболивающей активности и индексу относительной безопасности эталонный препарат в 3,3 и 5; 5,3 и 8 раз соответственно. В тесте «Отдергивания хвоста» исследуемое соединение по величине анальгетической активности было равно буторфанолу и превосходило его по продолжительности действия в 1,6 раза.

В настоящее время имеется значительный литературный материал о существовании периферически-регулируемой каппа-опиоидной антиноцицепции на моделях соматической и висцеральной боли, особенно в условиях воспаления [Aldrich J.V., 2009; Kivell B., 2010; Pasternak G.W., 2011; Butelman E.R., 2013]. В многочисленных независимых исследованиях было убедительно доказано, что на экспериментальных моделях висцеральной боли каппа-агонисты проявили себя как самый эффективный класс опиоидных анальгетиков [Rivière P., 2004; Stein C., 2009; Kivell B., 2010].

Формалиновый тест считают самым предсказательным с точки зрения потенциального применения новых молекул в клинической практике [Le Bars D., 2001; Rice A., 2008], и, как полагают, является клинической моделью как острой (фаза I), так и воспалительной боли (фаза II) [Dubuisson D., 1977; Mochizucki D., 2004]. В первой фазе формалинового теста соединение РУ-1205 при внутрибрюшинном введении в дозах 0,01; 0,1 и 1 мг/кг уменьшало число флинчей на 27%, 39% и 55% соответственно. Во второй фазе – на 15%, 42% и 54% соответственно. По уровню ЭД₅₀ тестируемое вещество было равно буторфанолу и превосходило эталонный препарат по широте терапевтического действия во II фазе ноцицептивного ответа в 1,8 раза. В тесте механической формалин-индуцированной гипералгезии - Рандалл-Селитто с преимущественным супрасегментарным уровнем замыкания рефлекса и вовлечением периферических механизмов ноцицепции, соединение РУ-1205 было сопоставимо по обезболивающей активности с препаратом сравнения. Полученные результаты хорошо согласуются с данными литературы, свидетельствующими о выраженной активности каппа-агонистов в условиях воспаления [Kivell B., 2010; Pasternak G.W., 2011].

На модели висцеральной гипералгезии, имитирующей острый перитонит, в тесте «Уксусные корчи» [Prisinzano T.E., 2005], показатель ЭД₅₀ соединения РУ-1205 составил 0,05 мг/кг и был равен по величине препарату сравнения. Данные результаты согласуются с литературными данными, в которых показана эффективность каппа-агонистов на данной модели в относительно низких дозах [Rivière P., 2004; Vanderah T.W., 2010].

Нейропатическая боль возникает как прямое следствие поражения или заболевания соматосенсорной системы и является гетерогенным состоянием, которое трудно поддается лечению и ухудшает качество жизни, физическое и психического здоровье пациентов [Boogaard S., 2013]. Модели нейропатической боли у лабораторных животных вызывают схожие симптомы нейропатического болевого синдрома у людей [Kivell B., 2010]. Хотя механизм тактильной аллодинии до конца неясен, известно, что данное явление связано с изменениями в спинном мозге, опосредованными активацией чувствительных волокон С/Аδ типа малого диаметра. Имеются литературные данные об эффективности селективных каппа-агонистов на модели нейропатической боли у животных [Sounvoravong S., 2004]. Соединение РУ-1205 уменьшало развитие тактильной аллодинии после перевязки седалищного нерва по сравнению с контролем на 64%, хотя и уступало по активности препарату сравнения – буторфанолу тартрату.

Полученные результаты о влиянии соединения РУ-1205 на болевую чувствительность на различных уровнях организации рефлексов, позволяют предположить возможность его применения в качестве потенциального анальгетика при ноцицептивных реакциях различного генеза.

Изучение взаимосвязи фармакокинетики и фармакодинамики является необходимым для оценки зависимости концентрации исследуемых веществ в плазме крови и наблюдаемых эффектов [Meibohm B., 1997]. Величина максимальной анальгетической активности соединения РУ-1205 не совпадала по времени с пиком концентрации в плазме крови, что может быть связано с особенностями проникновения исследуемого соединения через гематоэнцефалический барьер. Повторное увеличение обезболивающей активности без возрастания концентрации может свидетельствовать о наличии метаболитов соединения РУ-1205.

Следующим этапом исследования явилось изучение механизма действия соединения РУ-1205 с использованием комплексного подхода, включающего серию экспериментов in silico, in vitro и in vivo.

Экспериментальные исследования in silico были проведены для подтверждения каппа-рецепторного механизма действия изучаемого вещества. Методами молекулярной механики и квантовой химии были построены 3D-модели и выполнен 2D-,3D-анализ сходства структур с последующим докингом в сайт связывания 3D-модели каппа-рецептора. В ходе комплексной оценки in silico выявлен высокий уровень геометрического сходства вещества РУ-1205 с трехмерной структурой селективного каппа-агониста – U-50,488, а также установлено образование стабильного комплекса исследуемого соединения с сайтом связывания каппа-рецептора.

Исследования in vitro на тромбоцитах кролика проводили с использованием метода малоуглового светорассеяния, который позволяет оценить стадию активации тромбоцитов, эксклюзивно экспрессирующих на своей поверхности каппа-подтип опиоидных рецепторов [Дергачев Э.Ф. и др., 1998; Миндукшев И.В., 1996; Сакаев М.Р., 2000]. Была выявлена высокая норбиналторфимин-обратимая каппа-агонистическая активность исследуемого соединения на данной модели. Соединение РУ-1205 превосходило по каппа-опиоидному рецепторному действию и индексу относительной безопасности препараты сравнения буторфанол и U-50,488 в 2,3; 2,6 и 5,3; 35,8 раз соответственно. Однако модель тромбоцитов, хотя и является одной из наиболее популярных для оценки молекулярного механизма действия новых фармакологических соединений, она не относится к стандартным методам. Известно, что семявыносящий проток кролика cпецифичен для изучения каппа-рецепторных лигандов [Oka et al., 1980], а активация µ- опиоидных рецепторов вызывает угнетение сокращения подвздошной кишки крыс [Сoupar I.A., 1995; Gray A.C. et al., 2005]. Таким образом, для выявления рецепторного компонента действия соединения РУ-1205 были выполнены эксперименты in vitro на препаратах семявыносящего протока кролика и подвздошой кишки крысы с учетом тканеспецифичности и использованием высокоселективных лигандов рецепторных макромолекул [Воронина Т.А., 2012]. Тестируемое вещество проявляло выраженные каппа-агонистические свойства in vitro на препаратах СПК, эксклюзивно экспрессирующих субпопуляцию каппа-опиоидных рецепторов, статистически значимо и норбиналторфимин-обратимо ингибировало стимулированные электрическими импульсами сокращения СПК в диапазоне наномолярных концентраций (ЭК₅₀ 2,2×10^-9М) и превосходило по этим показателям буторфанол. Также было установлено, что изучаемое вещество не эффективно на препаратах подвздошной кишки крысы и проявляет незначительное (23,8% и 27,6% соответственно) ингибирующее влияние только в максимальных концентрациях (100 µМ). Тогда как морфин, наоборот, не проявлял какой-либо активности на препаратах семявыносящего протока кролика, но налоксонообратимо подавлял электроиндуцированные сокращения изолированного отрезка подвздошной кишки крысы, что согласуется с результатами других авторов [Gray A., 2005]. Это позволяет сделать вывод об отсутствии влияния соединения РУ-1205 на мю-опиоидные рецепторы. Подобные результаты представлены в литературных источниках для селективного агониста каппа-опиоидных рецепторов – U-50,488 [Lu S.N., 1991].

Важным этапом при изучении механизма действия является оценка способности антагонистов опиоидных рецепторов блокировать анальгетическое действие исследуемых веществ в условиях целостного организма. В экспериментах in vivo проводили исследования рецепторного механизма действия исследуемого соединения при совместном введении РУ-1205 с неселективным антагонистом опиоидных рецепторов – налоксоном и селективным антагонистом каппа-опиоидных рецепторов – норбиналторфимином в тесте «Горячая пластина». Было выявлено статистически значимое снижение анальгетической активности - при предварительном подкожном введении налоксона и норбиналторфимина анальгетическая активность соединения РУ-1205 статистически значимо уменьшалась в 6,3 и 6,2 раза соответственно. Представленные результаты подтверждались литературными данными, которые описывают дозозависимую норбиналторфимин-обратимую анальгезию на модели электростимуляции кожи хвоста и повышении порога голосовой реакции, а также в тестах Гаффнера, «Горячей пластины» селективных каппа-агонистов [Ackley M.A., 2001; Drake C.T., 2007].

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о преимущественном каппа-рецепторном компоненте действия производного конденсированных бензимидазольных систем - соединения РУ-1205.

Для того чтобы расширить представления о механизме действия соединения РУ-1205 с установленным каппа-рецепторным профилем изучали его влияние на проявления действия различных нейромедиаторных анализаторов (табл. 8.2).

При изучении влияния исследуемого соединения на каталептогенный эффект галоперидола было выявлено, что соединение РУ-1205 не вызывает статистически значимых изменений каталептогенных свойств галоперидола. В тесте с агонистом дофаминовых рецепторов апоморфином было установлено, что вещество РУ-1205 статистически значимо не влияет на выраженность апоморфин-индуцированной стереотипии у животных, что указывает на отсутствие у него способности блокировать дофаминергическую нейропередачу в нигростриатной системе мозга. В тесте с фенамином, было выявлено статистически значимое снижение гиперактивности мышей по сравнению с контрольной группой животных, которым вводили фенамин. Данные результаты предположительно могут указывать на способность исследуемого соединения блокировать дофаминовую нейропередачу в мезолимбической системе мозга. Однако нельзя исключать и другие механизмы снижения двигательного поведения животных, учитывая, то, что фенаминовая гиперактивность может быть обусловлена высвобождением из нервных окончаний различных катехоламинов (норадреналина, дофамина и серотонина) [Robertson S. D., 2009; Kleijn J., 2012]. Отсутствие потенцирования эффектов малых доз L-ДОФА при взаимодействии веществ, говорит об отсутствии у соединения РУ-1205 МАО-ингибирующего действия. При оценке влияния тестируемого вещества на холинергическую нейропередачу были проведены тесты с никотином и ареколином. Так было выявлено, что изучаемое вещество не изменяет длительность тремора, вызванного никотином и ареколином. Это свидетельствует об отсутствии центрального действия РУ-1205 на М- и Н-холинергическую нейропередачу. Соединение РУ-1205 не оказывало статистически значимого действия на гипотермические эффекты клофелина, а также выраженность гипотермии, блефароптоза, двигательных расстройств, вызванных резерпином. Данные результаты позволяют сделать заключение об отсутствии влияния исследуемого соединения на адренергическую нейропередачу. Изучаемое вещество не оказывало влияние на серотонинергическую систему мозга, что подверждалось в тесте с предшественником серотонина – 5-гидрокситриптофаном. В тестах с пикротоксином и бикукуллином, моделирующих судороги, было установлено, что соединение РУ-1205 снижает количество судорожных приступов, что, вероятно, может быть обусловлено как аллостерическими взаимодействиями с компонентами ГАМК-_А рецепторного комплекса [Birnir В., 2000] так и влиянием на Ca²⁺-зависимые-K⁺ токи [Pflieger J.F., 2002].

Таблица 8.2