Образовательная программа «6D060722- молекулярная и клеточная биология»



бет2/11
Дата11.07.2016
өлшемі2.9 Mb.
#192326
түріОбразовательная программа
1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11

ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ

5'UTR – 5'-untranslated region

3'UTR – 3'untranslated region

AJCC – American Joint Committee on Cancer

CDS – coding sequence

CIMP – CpG island methylator phenotype

CIN – Chromosomal instability

dsRBD – double stranded RNA binding domain

ELISA – Enzyme-linked immunosorbent assay

HITS-CLIP - high-throughput sequencing of RNA isolated by crosslinking immunoprecipitation

L mir – длина микроРНК

MSI – microsatellite instability

PAR-CLIP - photoactivatable-ribonucleoside-enhanced crosslinking and immunoprecipitation

pSILAC - Stable isotope labelling with amino acids in cell culture

qPCR - quantitative real time polymerase chain reaction

TNM – tumor- node-metastasis

RACE – Rapid amplification of 5’complementary DNA ends

RNA-Seq – high-throughput sequencing technologies

RIIID – Rnase III domain

siRNA – small interfering RNA

ssRNA – single stranded RNA

s/l - количество сайтов на определенную длину мРНК

UICC – Union for International Cancer Control

5ФУ – 5 фторурацил

н. - нуклеотид

При-микроРНК – первичная микроРНК

Пре-микроРНК – микроРНК прекурсор

РТК — рак толстой кишки

РСК – роковые стволовые клетки

СК – стволовые клетки



Cр. знач. - среднее значение


ВВЕДЕНИЕ
Общая характеристика работы. Работа посвящена исследованию генов и микроРНК, которые участвуют в развитии рака толстой кишки и их структурно-функциональных характеристик и особенностей взаимодействия друг с другом.

Актуальность темы исследования.

Одно из актуальных направлений современной биологии является разработка молекулярных маркеров для диагностики опухолей разных локализаций. Определение рака на поздних стадиях является основной причиной высокой смертности от онкологических заболеваний. Рак толстой кишки входит в тройку самых распространенных онкозаболеваний во всем мире с высоким уровнем смертности [1]. Ключевой проблемой является отсутствие методов ранней диагностики. Канцерогенез - сложный многоступенчатый процесс накопления генетических и эпигенетических нарушений, при котором наблюдаются изменения в генах белков и генах микроРНК [2]. Вогелстеин с соавторами разработали схему нарушений, которые регистрируются последовательно на разных стадиях рака толстой кишки [3], но этот набор генов не нарушен у всех больных [4, 5]. Результаты по изучению экспрессии генов, секвенированию полных геномов рака и изучению эпигенетических нарушений показали, что определить основной набор генов для каждого вида рака очень трудно [6]. В большинстве случаях рак толстой кишки определяют на поздних стадиях с наличием множественных мутаций, вследствие чего определить последовательность нарушений очень трудно. Рак в 65-85% случаях возникает в следствии спорадических мутаций [7]. В развитии болезни участвуют множество генов и один ген может участвовать в развитии нескольких онкозаболеваний [8], что также усложняет поиск селективных маркеров диагностики. Установление ассоциативных связей генов, участвующих в онкогенезе, и разработка молекулярных маркеров для диагностики онкозаболеваний является актуальным. Множество работ посвящены изучению ключевых сигнальных путей важных при возникновении рака толстой кишки, которые исследуют генетические и эпигенетические нарушения генов. Тем не менее, генезис основной доли генетических синдромов, обуславливающих высокий риск развития рака толстой кишки, еще не установлен [9]. В данной работе, анализируя накопленные в мире данные по раку толстой кишки, были предложены гены наиболее важные в развитии этого заболевания. На основе этих генов выявлены микроРНК, которые участвуют в их регуляции. МикроРНК — это одноцепочечные РНК, которые регулируют активность генов на уровне мРНК [10]. В последние годы эти регуляторные молекулы активно изучаются, так как они дают надежду в области диагностики, прогнозирования, лечения рака. МикроРНК осуществляют регуляцию трансляционной эффективности мРНК или скорости деградации мРНК за счет комплементарного связывания с мишенью, поэтому экспрессии мРНК не дает достоверную информацию. Так как при высоком уровне экспрессии мРНК синтез его продукта может быть снижен за счет микроРНК [11]. Данные экспрессии микроРНК отражают более достоверную информацию. В настоящее время только для небольшого количества микроРНК определены мРНК-мишени. Большинство микроРНК растений направляют процесс расщепления мРНК-мишеней, образуя почти полностью комплементарные дуплексы с ними [12]. У животных взаимодействие микроРНК с мРНК-мишенью происходит при более низкой степени комплементарности и приводит к подавлению трансляции [13]. На основе небольшого количества экспериментально определенных мРНК мишеней C. elegans были созданы программы, предсказывающие мишени для микроРНК [14]. Опыт первых работ по in silico определению мишеней для микроРНК животных показал необходимость фильтров для снижения доли ложно-позитивных сайтов микроРНК [15]. Сейчас известны десятки программ для предсказания мишеней микроРНК. При создании первых алгоритмов для поиска мишеней были экспериментально определены только несколько сотен микроРНК. Сейчас количество аннотированных, экспериментально подтвержденных микроРНК превышает более двух тысяч микроРНК. Сайты микроРНК, предсказанные разными программами, доступны на разных базах данных (http://www.TargetScan.org/, http://www.micro-RNA.org/, http://diana.pcbi.upenn.edu/cgi-bin/micro_t.cgi, http://pictar.mdc-berlin.de/). Для множества микроРНК нет информации по генам мишеням, так как информация обновляется ежедневно и не успевает пополняться в базах по мишеням микроРНК. В большинстве проектов поиск сайтов мишеней для микроРНК проводится для тысяч генов одновременно. Поэтому на данный момент особенности взаимодействия микроРНК с мРНК-мишенью имеют много неточностей и нуждаются в дальнейшем исследовании. Сайты микроРНК в большинстве случаев определяются в 3' нетранслируемой области [16, 17]. Хотя ряд экспериментальных работ показал наличие сайтов микроРНК во всех участках мРНК (5'UTR, CDS, 3'UTR) [18]. В настоящей работе мы провели поиск сайтов микроРНК по всей последовательности мРНК. Установление ключевых микроРНК в развитие рака толстой кишки, может стать основой для разработки молекулярных маркеров в диагностике этого заболевания.

Объекты исследования – нуклеотидные последовательности 54 генов и 784 межгенных микроРНК.

Предмет исследования – структурно-функциональные свойства генов и микроРНК ассоциированных с развитием рака толстой кишки, и сайтов взаимодействия этих генов с микроРНК.

Цель и задачи работы. Целью исследования является поиск генов и микроРНК, ответственных за развитие рака толстой кишки, изучение их структурно-функциональных характеристик, изучение особенностей взаимодействия между микроРНК и генами мишенями.

Задачи исследования.



    1. 1. Определить гены, ассоциированные с развитием рака толстой кишки, и описать их характеристики.

    2. 2. Определить микроРНК, ассоциированные с развитием рака толстой кишки, и описать их характеристики.

    3. 3. Найти сайты связывания межгенных микроРНК с мРНК генов, ответственных за развитие рака толстой кишки, и изучить особенности их связывания.

4. Изучить распределение сайтов связывания микроРНК в 5'UTR, CDS, 3'UTR мРНК и выявить особенности взаимодействия микроРНК с вторичной структурой мРНК.

5. Изучить различия между сайтами связывания, предсказанными программами RNAhybrid, TargetScan и miRanda.

6. Изучить филогенетическую консервативность сайтов, расположенных в белок кодирующей последовательности мРНК.

Научная новизна исследования.

Впервые создана база данных 142 генов и 38 микроРНК, которые ассоциированы с развитием рака толстой кишки. Для определения важных микроРНК в онкогенезе рака толстой кишки была создана методика отбора сайтов связывания микроРНК на основе программы RNAhybrid. С помощью этой методики были предложены 185 ранее не описанных сайтов для 120 микроРНК, которые могут быть основными в регуляции генов, ответственных за развитие рака толстой кишки.

Создана новая классификация сайтов связывания по вкладу микроРНК в энергию гибридизации. Впервые было установлено, что во всех сайтах предсказанных программой RNAhybrid, микроРНК связываются с неспаренными нуклеотидами во вторичной структуре мРНК, которые служат основой для образования связи между микроРНК и мРНК.

Впервые сравнены программы RNAhybrid, miRanda и TargetScan по способности предсказывать сайты связывания с высокой комплементарностью и установлены недостатки программы TargetScan в выявлении таких сайтов.

Впервые установлена филогенетическая консервативность сайтов связывания микроРНК, локализованных в кодирующей области мРНК.

Теоретическая значимость исследования. В результате исследования предложены гены и микроРНК, ассоциированные с развитием рака толстой кишки, которые расширяют фундаментальные представления об этом заболевании. В работе показано наличие в геноме человека сайтов связывания микроРНК с высокой комплементарностью. На основе сайтов, отобранных по разработанной нами методике, были показаны отличия между программами RNAhybrid, TargetScan, miRanda.

Практическая ценность работы. Установленные in silico сайты взаимодействия микроРНК с мРНК могут быть основой для экспериментальных работ по верификации сайтов микроРНК. Введенная методика по отбору сайтов может быть использована для выявления сайтов с высокой комплементарностью. Полученные данные по микроРНК могут использоваться для разработки молекулярных маркеров в диагностике рака толстой кишки. Разработанная методика изучения филогенетической консервативности сайтов в кодирующей последовательности мРНК может применяться для подтверждения сайтов связывания микроРНК.

Основные положения, выносимые на защиту:

Созданная база данных по генам и микроРНК, ассоциированным с развитием рака толстой кишки, и их сайты взаимодействия пригодны для разработки молекулярных маркеров этого заболевания.

Геном человека содержит множество генов, которые имеют сайты связывания микроРНК с высокой комплементарностью. В 5'UTR, CDS и 3'UTR мРНК генов человека имеют сайты связывания микроРНК. Плотность сайтов микроРНК в 5'UTR в несколько раз выше, чем CDS и 3'UTR.

Существуют три вида сайтов связывания микроРНК с мРНК в зависимости от вклада микроРНК в энергию гибридизации: 5'-доминантный, 3'-доминантный сайты и сайты с центральным доминированием. Неспаренные нуклеотиды во вторичной структуре мРНК служат основой для образования связи между микроРНК и мРНК.



Сайты взаимодействия микроРНК с высокой комплементарностью, расположенные в CDS, имеют высокую филогенетическую консервативность.

Связь с планом основных научных работ. Диссертационная работа выполнена в рамках проекта «Структурно-функциональные свойства генов человека, ответственных за некоторые онкологические заболевания. Их маркирование и диагностика заболеваний».

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены:

  • на Международном конгрессе студентов и молодых ученых «Мир науки»/КазНУ (2010 и 2012, Алматы, Казахстан);

  • на Международной конференции “The 7th and 8th international Conference on Bioinformatics of Genome regulation and Structure \ systems biology.” BGRS\SB'10 и BGRS\SB'12 (2010 и 2012, Новосибирск, Россия);

  • на Международном междисциплинарном симпозиуме «Нанотехнология и ноосферология в контексте системного кризиса цивилизации» (2011, Симферополь-Ялта);

  • на VI Московском международном конгрессе «Биотехнологя: состояние и перспективы развития» (2011, Москва, Россия);

  • на Международной конференции «Advances in Stem Cell Rasearch»/ 3rd EMBO Stem Cell Conference (2011, Paris, France);

  • на Международной конференции «Non-coding RNA, Epigenetic Memory, and the Environment» (2011, London, UK);

  • на международной конференции MCCMB'11 (2011, Moscow, Russia);

  • на Международной конференции «International Conference on Bioinformatics, Computational Biology and Biomedical Engineering» (2011, Paris, France);

  • на Международной конференции “NCRI Cancer conference” (2011, Liverpool, UK);

  • на 13-м Международном PhD симпозиуме «The Rhythm of Life: Cycles in biology» (2011, Heidelberg, Germany);

  • на 2-ой Международной конференции Астана Биотех2011(2011, Астана, Казахстан);

  • на Международной научно-практической конференции «Фармацевтические и медицинские биотехнологии (2012, Москва, Россия)

  • на третьей Московской международной конференции “Molecular Phylogenetics” «MolPhy-3» (2012, Москва, Россия);

  • на 9-ой Международной конференции “Nanosciences & Nanotechnologies” (NN12) (2012, Greece);

  • на Международной конференции Развитие нанотехнологий: задачи международных и региональных научно-образовательных и научно-производственных центров (2012, Барнаул, Россия).

Публикации. Основное содержание диссертации отражено в 31 печатных работах, в том числе 1 статье в международном издании цитируемой в Thomson Royters и 1 статье принятой в журнал с импакт фактором, 1 статье цитируемой в Scopus, 12 статьях в республиканских научных журналах, 16 в тезисах международных конференций и симпозиумов.

Структура диссертации. Диссертация состоит из обозначений и сокращений, введения, литературного обзора, материалов и методов, результатов и обсуждения, включающего 3 подраздела, заключения и списка использованных источников из 350 наименований, содержит 29 таблиц и 13 рисунков и 1 приложение.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ


    1. Рак толстой кишки и его генезис

1.1.1 Рак толстой кишки социально значимое заболевание

Рак толстой кишки (РТК) одно из распространенных онкозаболеваний во всем мире. Часто рак толстой кишки рассматривают как колоректальный рак, то есть рак толстой и прямой кишки. Механизмы возникновения этих новообразований сходные. Согласно данным проекта «Globocan 2008» международной организации исследований по раку, рак толстой кишки занимает третье место по частоте встречаемости у мужчин (после рака легких и рака простаты) и второе у женщин (после рака молочной железы) в мире. Ежегодно в мире регистрируется около миллиона больных колоректальным раком и 440000 смертей от этого заболевания [1]. По смертности это заболевание стоит на четвертом месте (после рака легкого, желудка и печени) среди всех новообразований в мире [19, 20] и составляет примерно 33% летальных исходов в развивающихся странах [21].

В настоящее время колоректальный рак становится все более значимой патологией в Республике Казахстан. Каждый год в республике выявляется более 2000 больных с колоректальным раком [22]. Согласно Приказу Министерства здравоохранения Республики Казахстан № 145 от 16 марта 2011 года в республики Казахстан проводится скрининг для выявления предопухолевых и опухолевых заболеваний толстой и прямой кишки [23]. Основной проблемой малоэффективного лечения рака толстой кишки является выявление заболевания на поздней стадии. Отсутствуют эффективные методы ранней диагностики, вследствие чего заболевание определяется на поздней стадии и часто с сопутствующими метастазами. Выяснение начальных стадий онкогенеза остается актуальным и для этого необходимо установление пусковых причин развития злокачественных опухолей.

1.1.2 Генезис рака толстой кишки

Рассмотрим кратко генетические и эпигенетические нарушения экспрессии белок-кодирующих генов при развитии рака толстой кишки. РТК можно подразделить на две группы: наследственно предрасположенный и спорадический. В разных странах 10-30% случаев развитие рака обусловлено наследственными генетическими изменениями [7]. Принято считать, что спорадический РТК развивается через последовательное накопление генетических и эпигенетических мутаций и, как правило, канцерогенез является многоступенчатым процессом [2]. В некоторых случаях изменяются специфические локусы, детерминирующие активацию онкогенов или инактивацию генов-онкосупрессоров рака. Глобально рак связан с хромосомными и микросателлитными нестабильностями, которые увеличивают возможность приобретения добавочных повреждений генов, значимых для канцерогенеза.

1.1.3 Наследственные синдромы

Существуют несколько факторов риска развития РКТ: возраст старше 50 лет, особенности питания, генетические синдромы, предшествующие заболевания и т.д. Семейные случаи развития рака толстой кишки занимают большой процент этого заболевания. Было показано рядом исследователей, что семейный рак составляет приблизительно 30% [24, 25]. Около 5% всех случаев рака ассоциировано с хорошо изученными наследственными мутациями и охарактеризованной клинической картиной. Этиология оставшихся 20-30% случаев наследственного колоректального рака до конца неизвестна, больные этой группы имеют родственников с полипозом или РТК. Этиология может быть связана с полиморфизмов генов, участвующих в регуляции метаболизма или генов, регулируемых другими генетическими факторами. В ряде случаев причиной могут быть изменения генов в ломких локусах, которые имеют множественные эффекты [9].

К группе генетических синдромов c полипозом относятся диффузный семейный полипоз, синдром Гарднера-Тернера, синдром Пейтца-Джигерса, болезнь Тюрка [26]. Синдромы рака толстой кишки классифицируются на основе клинических, патологических и генетических исследований. В основном синдромы классифицируются по характеристике множественных полипов. Полипозные синдромы делятся на аденоматозные, гамартоматозные и гиперпластические полипозисы [27]. К синдромам с аденоматозными полипами относятся: сидром Линча, семейный аденоматозный полипоз, аттенуированный семейный аденоматозный полипоз, MUTYH-ассоцированный полипоз [28].

Диффузный семейный полипоз, аттенуированный семейный аденомазный полипоз, синдром Гарднера обуславливаются мутациями в гене APC, белок которого отвечает за уровень β-катенина в цитозоле. Белок гена APC негативный регулятор в Wnt/Wingless (Wg) сигнальном пути трансдукции. Разница между этими тремя синдромами в локализации мутации в гене APC. Синдром диффузного семейного полипоза является наиболее распространенным наследственным фактором развития рака толстой кишки, он составляет около 1% от всех случаев возникновения рака [27]. Аденомы развиваются после первой декады жизни. Это заболевание передается по аутосомно-доминантному типу. Диффузный полипоз рассматривается как облигатный предрак, и если его не лечить, то он в 98% случаев перерождается в рак [29]. Средний возраст определения рака 39 лет. В 7% случаях рак развивается к 21 году, а в 95% случаях к 50 годам. Это заболевание может проявляться как остеомы, дентальные нарушения, врожденной гипертрофией пигментного эпителия сетчатки и опухолями вне кишечника (фиброзный рак, рак желудка, щитовидной железы, поджелудочной железы и т. д.) [30].

Аттенуированный семейный аденоматозный полипоз является причиной менее агрессивного вида рака. Заболевание характеризуется меньшим количеством полипов (обычно от 10 до 100). Риск рака толстой кишки составляет 69%, возникновение аденом начинается в более позднем возрасте. Также могут возникать другие патологии [28].

Синдром Гарднера — это вариант диффузного семейного полипоза, который характеризуется симптомами внутри и вне кишечника [31].

Болезнь Тюрка характеризуется диффузным полипозом толстой кишки и опухолями центральной нервной системы [26].

Синдром Линча связывают с возникновением наследственного неполипозного колоректального рака обусловленного мутациями в генах MSH2, MLH1 PMS1, PMS2, MSH6, продукты которых участвуют в репарации ДНК [32]. Синдром Линча является причиной развития РТК в 2-3% случаях этого заболевания. При развитии этого синдрома вероятнее образование небольшого количества полипов. Риск развития рака составляет 80%. Рак толстой кишки и полипы развиваются в раннем возрасте и имеют проксимальное расположение. В 90% случаях синдром Линча возникает за счет мутаций в генах MSH2 и MLH1 [33, 34]. Гены MSH2 и MLH1 также являются причиной развития синдрома Muir-Torre. Синдром Линча характеризуется и наличием микросателлитных нестабильностей. Недавно обнаружено, что делеции в гене EpCAM приводят к развитию одной разновидности неполипозного рака толстой кишки [35].

Группа синдромов гамартоматозными полипами относится к редко встречаемым заболеваниям, при которых полипы развиваются в раннем возрасте. Гамартоматозные полипы образуются при синдроме Пейтца-Джигерса, ювенильного полипозного синдрома, смешанного полипозного синдрома и др. Чаще всего среди гамартоматозных синдромов встречаются синдром Пейтца-Джигерса и синдром ювинильного полипоза. Синдром Cowden тоже относится к этой группе синдромов, но как все остальные синдромы этой группы встречается очень редко [36]. Синдром Пейтца-Джигерса аутосомно-доминантное заболевание, характеризующее гамартоматозными полипами в желудочно-кишечном тракте и пигментными кожно-слизистыми поражениями, которые преимущественно появляются в детстве на губах, слизистой оболочке щек. Сидром может привести к развитию рака желудочно-кишечного тракта, поджелудочной железы, легких, груди, мочевого пузыря и т.д. Индивиды с этим синдромом имеют от 81 до 93% риска развития рака в течение жизни [37, 38].

Ювенильный полипозный синдром не имеет фенотипических характеристик как синдром Пейтца-Джигерса. В основном полипы образуются в толстой кишке, также могут быть в желудке, двенадцатиперстной и тонкой кишке. Риск развития рака составляет 39% в течение жизни [39, 40].



Таблица 1 – Наследственные синдромы рака толстой кишки [9, 24 ,25]


Синдром 

Гены

Закономерность наследования 

Предоминантный рак

Семейный аденоматозный полипозиз (FAP)

APC

Доминантный

Толстая кишка, весь кишечник

Аттенуированный семейный аденомазный полипоз

APC

Доминантный




Синдром Гарднера-Тернера

APC

Доминантный




Аттенуированный полипоз

AXIN2

Доминантный

Толстая кишки

Синдром Пейтца-Джигерса

STK11

Доминантный

Множественный (включая толстую кишки)

Синдром Cowden

PTEN

Доминантный

Множественный (включая толстую кишки)

Синдром Ювинильного полипоза

BMPR1A

Доминантный

Желудочно-кишечный тракт

SMAD4 (DPC4)

Доминантный

Желудочно-кишечный тракт

Сидром Линча



MLH 1, MSH2, MSH6, PMS2

Доминантный

Множественный (включая толстую кишку, мочевой пузырь, и др.)

EPCAM (TACSTD1)

Доминантный

Множественный (включая толстую кишку, мочевой пузырь, и др.)

Muir-Torre синдром

MSH2, MLH1




Также как при сидроме Линча и плюс карциномы сальных желез и молочной железы

MUTYH-ассоцированный полипоз

MYH (MUTYH)

Рецессивный

толстую кишку

Bloom

BLM

Рецессивный

Множественный (включая толстую кишки)

Семейный стромальный рак желудочно-кишечного тракта

KIT




Желудочно-кишечный тракт стромальный рак

PDGFRA




Желудочно-кишечный тракт стромальный рак

Гиперпластические полипозные синдромы встречаются редко, характеризуются множественными или большими гиперпластическими полипами в толстой кишке. В большинстве случаев этиология заболеваний неизвестна. Международная организация Здравоохранения определила критерии гиперпластического полипозного синдрома, согласно которым при синдроме должен быть один из следующих признаков: 1. может быть около 30 (хотя чаще используется 20) гиперпластических полипов расположенных в толстой кишке или от одного до пяти больших полипов в определенной области кишки; 2. должно быть пять гиперпластических полипов, расположенных в проксимальной части сигмоидной толстой кишки [41, 42].

1.1.4 Цитогенетика рака толстой кишки (микросателлитные и хромосомные нестабильности)

Генетические и эпигенетические изменения, которые могут привести к развитию опухоли, следующие: точечные мутации, изменение плоидности, вставки или делеции, транслокации и абберантное метилирование, модификация гистонов (ацетилирование и метилирование гистонов).

Для рака толстой кишки приобретение геномных нестабильностей является одной из предпосылок развития этого заболевания. Существуют три основных вида геномных нестабильностей: микросателлитные нестабильности (MSI), хромосомные нестабильности (CIN) и метилирование CpG островков (CIMP) [6, 43].

Микросателлитные нестабильности являются причиной возникновения 15-20% спорадического рака. Это хорошо изученный вид рака, который происходит за счет потери или инактивации генов ДНК мис-матч репарации [44]. В основном при микросателлитной нестабильности сохраняется нормальный кариотип [45].

Хромосомные нестабильности - частая патология при раке толстой кишки, которая встречается примерно в 80-85% случаях [46]. При хромосомной нетабильности характерно наличие перестроек хромосом и большое количество нарушений. CIN используется для описания анеуплоидов и полиплоидов, делеций хромосом или хромосомных плеч, потеря гетерогенности [47]. Хромосомные нестабильности приводят к потере генов супрессоров-рака, таких как APC, TP53, SMAD4 и др. [8]. Развитие рака толстой кишки связано с часто встречаемыми геномными потерями. Аккумуляция потери 8q21, 15q11-q21, 17p12-13, 18q12-21 локусов и вставки в 8q23, 13q14, 20q13 областях ассоциировано с переходом аденомы в карциному [48]. Было показано, что делеции в хромосоме 4 приводят к развитию агрессивной формы рака, плохим прогнозам течения рака. Появление метастаз в печени связано с делециями 8p и вставками в хромосомах 7q и 17q, также на прогрессирующей стадии метастазирования ассоциированы с делециями 14q и вставками 1q, 11, 12p, 19 [49]. Несколько групп ученых провели полный анализ мутаций, связанных с раком толстой кишки, и было выявлены наиболее часто встречающиеся трисомии: + 7, +13, +20, +Х; среди моносомиков -4, -5, -8, -10, -14, -15, -17, -18, -21, -22, -Y [50].


1.1.5 Эпигенетика и рак толстой кишки

У млекопитающих большинство CpG сайтов (90-98%) метилированы, но в геноме существуют CpG богатые районы, где основная масса островков не метилирована. Также существуют гены, участвующие в импринтинге, которые регулируются за счет метилирования CpG островков в промоторной области.


Таблица 2 - Эпигенетические изменения при раке толстой кишки [51-55]


Гены, участвующие в РТК

Название гена

Функция гена и эпигенетические нарушения

1

2

3

APC

Adenomatosis polyposis coli

Ген супрессор-опухоли

MGMT

O-6-methylguanine-DNA methyltransferase

Репарация ДНК повреждений, гиперметилирование

CDKN2A/P14

Ciclin-dependent kinase inhibitor 2A, alternated readig frame

Ген супрессор-опухоли, регуляция клеточного цикла

HLTF

Helicase-like transcription factor

Фактор ремоделирование хроматина

hMLH1, hMLH2

MutL homolog 1,2

Ген ДНК репарации

CDKN2A/P16

Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A

Ген супрессор-опухоли, регуляция клеточного цикла

CDH13

H-cadherin

Регулятор процессов адгезии-отлипания

UNC5C

Unc-5 homolog C

Один из рецепторов к Netrin-1

DCC

Deleted in colorectal carcinoma

Ген супрессор-опухоли, который контролирует апоптоз

COX2

Prostaglandineendoperoxide synthase 2

Участвует в процессах воспаления, митогенеза, ангиогенеза опухоли, метастазирования

HACE 1

E3 ubiquitine ligase

Метилирование этого гена предшествует метастазированию

RASSF1A

Ras association (RalGDS/AF-6) domain family 1

Ген супрессор-опухоли, в апоптозе ассоциированный с рецептором смерти, расположен в микротрубочках

RUNX3

Runt-related transcription factor 3

Транскрипционный фактор, который может действовать как активатор и супрессор

Продолжение таблицы 2





1

2

3

SOCS1

Suppressor of cytokin signaling 1

Белок гена действует как негативный регулятор в JAK/STAT3 сигнальном пути.

CHFR

Checkpoint with FHA and RING finger

CHFR действует в G2/M чекпоинте, поэтому является геном супрессором

ADAM23

A disintegrine and metalloproteinase domain 23

Белок участвует в многих процессах межклеточного взаимодействия и взаимодействия между клеткой и матриксом

DLEC1

Deleted in lung and oesophageal cancer 1

Ген супрессор-опухоли ингибирующий клеточную пролиферацию

SERF1

Secreted frizzled-related protein 1

Эпигенетическое выключения этого гена приводит к активации Wnt пути

MYOD

Myogenic factor 3

Ингибирует клеточный цикл за счет стимуляции экспрессии p21

P15

Cyclin-dependent kinase inhibitor 2B




P73

Tumor protein p73

Белок участвует в апоптотическом ответе на ДНК повреждения, делеции обнаружены при многих опухолях

Гиперметилирование ДНК происходит в специфических регуляторных сайтах в промоторной области или повторяющихся последовательностях. Высокий уровень метилирования цитозина в CpG островках генов супрессоров-опухоли приводит к блокированию трансляции. В опухолях различной локализации были обнаружены аналогичные нарушения. Эпигенетические нарушения являются признаком рака, в том числе и при РТК. Другие эпигенетические нарушения включают ацетилирование гистонов. Таблица 2 представляет эпигенетические нарушения, которые были обнаружены при РТК [51-55].


1.1.6 Модификация гистонов при раке толстой кишки

Другой вид эпигенетического изменения — модификация хроматина, то есть ковалентная модификация гистонов хроматина. Ацетилирование гистонов - признак активного участка хроматина, процессы ацетилирования-деацетилирования происходят за счет ферментов гистон деацетилаз (HDAC) и гистон ацилтрансфераз. Фосфорилирование серина 10 в гистоне H3 коррелирует с инактивацией генов у млекопитающих, метилирование лизина 9 в гистоне H3 связано с выключением гена. Модификации кончиков гистонов распознаются ферментами ремоделирования хроматинов, которые могут модифицировать структуру хроматина. CDH5 (Chromodomain helicase DNA-binding protein 5) ген супрессор-опухоли, который участвует в процессах пролиферации, апоптоза, клеточного старения. Было найдено, что эпигенетическая инактивация гена CDH5 приводит к абберантному структурному изменению хроматина в геномах раковых больных (РТК, рак молочной железы, рак шейки матки, глиома) [56].



RGC-32 (Response gene to complement 32) ген, который является субстратом и регулятором CDC2, его гиперэкспрессия индуцирует клеточный цикл. Высокий уровень продукта гена RGC-32 было найден на поздних стадиях рака толстой кишки. Нокаут этого гена приводит к увеличению ацетилирования гистонов H2BK5, H2BK15, H3K9, H3K18, H4K8, а также уменьшению экспрессии SIRT1 и уменьшению триметилирования гистона H3K27. Эти данные подтверждают участие гена в РТК за счет регуляции хроматинового ансамбля [57].
1.1.7 Геномный импринтинг при РТК

Метилирование цитозина в промоторной CpG области генов-онкосупрессоров опухоли подавляет транскрипцию и является причиной развития РТК [58]. По некоторым данным изменения отпечатка метилирования (геномный импринтинг) переданного от родителей может играть важную роль в малигнизации. Геномный импринтинг – эпигенетический феномен, характеризующийся моноаллельной экспрессией генов в зависимости от их родительского происхождения. Молекулярную основу такой экспрессии составляют ковалентные модификации ДНК и гистоновых белков, происходящие при созревании половых клеток. Аномалии формирования геномного импринтинга в гаметогенезе или его поддержания на различных этапах онтогенеза являются причинами развития опухоли. Потеря импринтинга в локусе IGF2 обнаружена при раке толстой кишки [59].


1.1.8 Генетический полиморфизм и риск развития рака толстой кишки

Полиморфизм может быть показателем чувствительности разных индивидов к развитию рака толстой кишки. Связь полиморфизма с раком изучают классическим методом генов кандидатов (на основе известных функций генов и их значимости в метаболических путях, связанных с развитием рака толстой кишки) и с помощью геномных ассоциативных исследований, когда тестируется полмиллиона или более однонуклеотидных полиморфизмов. Генетические варианты или полиморфизмы многих генов ассоциированы с риском развития рака толстой кишки (Таблица 3). Варианты генов ассоциированных с РТК включают APC-I1307K, HRAS1-VNTR, MTHFR, NAT1, NAT2, GSTM1, GSTT1, GSTP1 [60, 61].



Таблица 3 – Некоторые гены и локусы, ассоциированные с риском развития РТК [62]

Ген или локус

Вид исследования

Замечания

GSTT1

Мета-анализ ген-ассоциированного исследования

Нулевой генотип GSTT1 гена повышает риск РТК

GSTM1

Мета-анализ ген-ассоциированного исследования

Нулевой генотип GSTM1 гена повышает риск РТК

COX2

Мета-анализ ген-ассоциированного исследования

Полиморфизм в промоторе гена повышает риск РТК

MTHFR

Мета-анализ ген-ассоциированного исследования

MTHFR 677 C>T ассоциирован с риском к РТК

NATs

Взаимодействие гена с окружающей средой

NATs полиморфизм и курение повышает риск РТК

MTR

Мета-анализ ген-ассоциированного исследования

MTR 2756 A>G ассоциирован с риском к РТК

SMAD7

Генетический-ассоциированные исследования

Варианты гена SMAD7 ассоциированы с риском к РТК

APC

Генетический-ассоциированные исследования

APC I1307 ассоциированы с риском к РТК

IGF1

Генетический-ассоциированные исследования

полиморфизм промотора IGF1 гена ассоциирован с развитием Сидрома Линча

8q23.3

Генетический-ассоциированные исследования

Ассоциирован с риском РТК

8q24

Генетический-ассоциированные исследования

Ассоциирован с риском РТК

10p14

Генетический-ассоциированные исследования

Ассоциирован с риском РТК

11q23

Генетический-ассоциированные исследования

Ассоциирован с риском РТК

15q13

Генетический-ассоциированные исследования

Ассоциирован с риском РТК

14q22.2

Мета-анализ геном-ассоциированного исследования

Ассоциирован с риском РТК

16q22.1

Мета-анализ геном-ассоциированного исследования

Ассоциирован с риском РТК

18q21

Геном-ассоциированные исследования

Ассоциирован с риском РТК

19q13.1

Мета-анализ геном-ассоциированного исследования

Ассоциирован с риском РТК

20p12.3

Мета-анализ геном-ассоциированного исследования

Ассоциирован с риском РТК

Описан целый ряд полиморфизмов, для которых был подтвержден риск развития РТК. Например, диабет ассоциированные варианты гена TCF7L2, который участвует в WNT сигнальном пути. Аллели генов IGF-1, IGFBP-3 вместе с разными факторами окружающей среды и образа жизни по разному влияют на риск развития РТК [63]. Один из вариантов 1-рецептора к TGF (TGFBR1*6A) известен как фактор риска развития РТК, который составляет около 3% случаев РТК [64]. Варианты SMAD7 (rs12953717) также связывают с риском развития РТК [65]. Описанные и другие генетические варианты изменяют экспрессию генов, чувствительных к раку толстой кишки. Взаимодействие гена с геном важная детерминанта, которая может определять риск развития рака.

Полиморфизм может влиять на изменения чувствительности гена, например, APC-I1307K вариант гена APC может в 2 раза увеличить риск возникновения аденом. Было показано, что этот вариант чувствителен к мутациям, то есть у обладателей этого варианта повышен риск развития РТК [66, 67].

Другой вариант гена APC (APC-D1822V) имеет очень низкий риск возникновения РТК у женщин после менопаузы, и считается, что обладатели этого варианта толерантны к РТК [68].


1.1.9 Раковые стволовые клетки

Лечение рака толстой кишки предусматривает операционное удаление опухоли и химиотерапию. После такой терапии у большинства больных в течение месяца или года наблюдается ремиссия заболевания. После этого периода в 30-50% случаях происходят рецидивы обычно в виде метастаз. Возобновления рака зависит от стадии, на которой определили рак. На первой стадии колоректального рака у большинства пациентов не возникают рецидивы (95-98%), на второй стадии в 20-25% и на третьей стадии в 40-50% заболевание возобновляется после лечения. Основная доля смертности наблюдается у больных с рецидивами. Основной причиной возникновения рецидивов обусловлено наличием пролиферирующих клеток, против которых не эффективна химиотерапия. В организме только один тип клеток имеет такие свойства, это - стволовые клетки [69].

Нормальные стволовые клетки в толстой кишке расположены в криптах между кишечными субэпителиальными миофибробластами. Эпителий желудочно-кишечного тракта постоянно самообновляется за счет стволовых клеток, большинство дифференцированных клеток желудочно-кишечного тракта обновляются каждые 2-7 дня [70]. В норме СК продуцируют около 1010 клеток, которые дифференцируются по вертикальной оси [71].

Существует предположение, согласно которому накопление генетических и эпигенетических мутаций приводит к образованию раковых стволовых клеток из стволовых клеток взрослого организма [72]. Эти клетки являются причиной малигнизации тканей, а также причиной развития метастазов. После образования таких клеток химиотерапия и лучевая терапия, как правило, малоэффективны, так как у стволовых раковых клеток множество защитных механизмов.



Таблица 4 - Потенциальные маркеры нормальных и раковых стволовых клеток толстой кишки [80]


Маркеры

Функция

Нормальные стволовые клетки толстой кишки

Lgr5 (GPR49)

Ген-мишень Wnt, Lgr5+ клетки после потери гена APC образуют микроаденомы у мышей

Msi-1 (musashi-1)

Белок, связывающий РНК, экспрессируется временно-амплифицирующимися прогениторными клетками

CD29 (integrin β1)

Адгезивная молекула клетки

DCAMKL-1

Киназа

Раковые стволовые клетки толстой кишки

CD133 (Prominin 1)

Вместе с β-катенином увеличивает риск прогрессирования и уменьшает выживаемость после операционного лечения. Коррелирует с Т-стадией и метастазами.

CD24 (HSA)

Адгезивная молекула клетки

OCT4

Экспресия в желудочно-кишечном тракте приводит к дисплазии

SOX2

Участвует в процессах инвазивности и метастазирования.

c-Myc

Стимулирует клеточное обновление, экспрессия увеличена в начальных этапах канцерогенеза

Lgr5 (GPR49)

Ген-мишень Wnt, Lgr5+ клетки после потери гена APC образуют микроаденомы у мышей

Msi (musashi-1)

Белок, связывающий РНК, экспрессируется в временно-амплифицирующихся прогениторных клетках

CD29 (integrin β1)

Адгезивная молекула клетки

CD44 (CDW44)

Адгезивная молекула клетки, рецептор к гиалуроновой кислоте

ALDH1 (ALDC)

Фермент

ESA (EpCAM)

Адгезивная молекула клетки

CD166 (ALCAM)

Адгезивная молекула клетки

Частота встречаемости раковых стволовых клеток 1 на 60 000 раковых клеток толстой кишки [73]. Раковые стволовые клетки толстой кишки имеют определенные фенотипические маркеры, такие как CD133+, CD44+, Musashi-1, EpCAM+, CD166+, CD49f. Эти клетки не экспрессируют белки ответственные за дифференцировку (СК20) [74]. Таблица 4 представляет потенциальные маркеры для определения нормальных и раковых стволовых клеток толстой кишки. В основном раковые стволовые клетки толстой кишки выделяют по CD133+ фенотипу. После выделения раковых стволовых клеток проверяется их потенциал самообновления в среде без сыворотки и потенциал к образованию опухоли на иммунно-дефицитных мышах [75].

Обнаружение раковых стволовых клеток изменило понимание канцерогенеза и стратегию терапии. Исследование раковых стволовых клеток показало, что у этих клеток существуют насосы для выведения лекарств, есть изменения в механизмах ДНК-репарации, изменения в чекпоинтах клеточного цикла, неисправный механизм апоптоза. На данный момент медицина может убить дифференцированные и высоко пролиферирующие клетки, а раковые стволовые клетки пролиферативно неактивны, мало дифференцированы, обходят пути апоптоза [76].

На данное время для лечения больных с РКТ при химиотерапии используют комбинацию препаратов из фторурацила (5ФУ), оксалиплатина и леуковорина (FOLFOX) и комбинацию из 5ФУ, оксалиплатина и иринотекан (FOLFIRI). Также для пациентов с метастазами используются моноклональная терапию против anti-VEGF или EGFR [77]. Хотя при наличии РСК это терапия не эффективна. Для борьбы с РСК на данный момент разрабатываются новые подходы лечения. Во-первых, разрабатываются методы стимуляции процессов дифференцировки РСК [78]. Также разрабатываются подходы подавления механизмов выживания, свойственных стволовым клеткам [79]. При обнаружении эффективных методов элиминации РСК можно будет в большинстве случаев побороть рак.


1.1.10 Стадии РТК

В предыдущей части мы упоминали о стадиях рака толстой кишки. Определение стадии очень важно для прогнозирования и назначения терапии при РТК. Существует анатомическая классификация Дюка (1944), которая рассматривает степень проникновения опухоли в стенку кишечника и вовлечения лимфатических узлов в процесс. В 1950 году в Париже в институте Густава-Росси создали классификацию TNM [81]. В 1987 году Международный Центр против Рака (UICC) и Американский Объединенный комитет по Раку (AJCC) унифицировали TNM классификацию. Последнее седьмое издание TNM классификации с поправками вышло в 2009 году (таблица 5). В TNM классификации показатель Т отражает глубину проникновения первичной опухоли в стенку кишки, показатель N - состояние регионарных лимфоузлов, показатель М - наличие или отсутствие отдаленных метастаз. Недостатком этой классификации является то, что не учитывается размер первичной опухоли [82, 83]. На данный момент обе классификации используются на практике.


Таблица 5 - ТNМ классификация 2009 года [84, 85]







Описание

T

Тх – первичная опухоль не может быть оценена;

Т0 – нет признаков опухолевого роста;

Тis – carcinoma in situ;

Т1 – опухоль распространяется на подслизистый слой;

Т2 – опухоль распространяется на мышечный слой;

Т3 – опухоль проникает через мышечный слой в подслизистую оболочку или в не покрытые брюшиной периколярные ткани;

Т4а - проникновение опухоли в брюшину

Т4b - инвагинация в другие органы или структуры



N

Nx - состояние регионарных лимфатических узлов не может быть оценено

N0 - метастазы в регионарных лимфоузлах отсутствуют

N1: метастазы в 1-3 лимфоузлах

N1a в 1 лимфоузле

N1b в 2-3 лимфоузлах

N1c саттелиты между серозными оболочками, без регионарных лимфоузлов

N2: 4 или больше позитивных лимфоузла

N2a в 4-6 лимфоузлах

N2b в 7 и более лимфоузлах


Изолированные раковые клетки

Эти клетки рассматриваются как N0


Узловые микрометастазы

Рассматриваются как N1

M

Mx наличие метастаз не может быть оценено

M1a наличие одной метастаз в органе

M1b больше одной метастазы в органе или брюшине


Стадии

Стадия I T1 N0M0, T2N0M0

Стадия II IIA - T3 N0M0, IIB - T4a N0M0, IIC - T4b N0M0

Стадия III

IIIA — T1, T2, N1, N2a, M0

IIIB — любая Т кроме T4b; N2b, M0

IIIC — T4b, N1, N2, M0

Стадия IV

IVA - любая Т, любая N, M1a

IVB - любая Т, любая N, M1b


1.1.11 Ключевые пути развития рака толстой кишки

РТК не моногенное заболевание и больные с одинаковой стадией заболевания имеют разный прогнозы течения болезни и разный ответ на лечение, потому что у каждого больного свой набор мутаций в разных генах и очень трудно определить основной путь развития этого заболевания. Хотя считается, что есть набор генов, который в большинстве случаев мутирован при определенном онкологическом заболевании. Вогелстеин с соавторами предполагают, что развитие рака всех локализаций ассоциировано со своим набором ключевых генов [3, 86]. Для РТК это члены Wnt/β-катенин и фосфотидилинозитол-3-киназных путей, онкоген KRAS, ген-онкосупрессор ТР53 и др. (рисунок 1). Ключевые гены нарушены в 50-60% случаев и обнаруживаются у больных с прогрессирующей болезнью на поздних стадиях.

RAS-RAF-MEK-ERK-MAP киназный путь - важный сигнальный путь трансдукции, который обеспечивает клеточный ответ на ростовой сигнал,. Поэтому он участвует в регуляции таких процессов как пролиферация, клеточное выживание, арест клеточного цикла, дифференциация, апоптоз [87]. RAS белок, который находится на внутренней стороне мембраны. RAF, MEK, ERK цитоплазматические протеин-киназы, которые последовательно активируют друг-друга [88]. KRAS активируется посредством протеин-киназы BRAF. Мутации в 12 кодоне гена KRAS были найдены у 8,6% всех пациентов [89] и в среднем у 40% пациентов обнаружены мутации в этом гене [4]. При мутационной активации продукта гена KRAS происходит аберрантная активация EGFR пути. Исследование мутаций в этом гене являются важным прогностическим маркером для лечения с помощью агентов против EGFR (цетуксимаб и панитумумаб). Потому что при наличии мутаций в гене KRAS такое лечение неэффективно. Также мутации в генах этого сигнального пути ассоциированы с раком с микросателлитными нестабильностями [90].

Мутации в гене PIK3CA и делеция гена PTEN также как KRAS являются маркерами для предсказывания устойчивости против EGFR моноклональной терапии. Фосфотидилинозитол 3-киназный путь - сигнальный путь активированный стимуляцией EGFR. В 70% случаях мутации в гене PIK3CA и делеция гена PTEN, которые сопровождаются мутациями в генах KRAS и BRAF, не чувствительны к лечению цетуксимабом и панитумумабом [91, 92].

Wnt/ β-катенин сигнальный путь играет ключевую роль в гомеостазе и поддержании стволовых клеток желудочно-кишечного тракта [93]. Существует градиент Wnt сигнала от основания крипт до ворсинок кишечника [94]. Если у эпителиальных клеток основания крипты нет источника Wnt, то клетки теряют пролиферативную активность и дифференцируются [95, 96]. Ген Adenomatous polyposis coli (APC) играет центральную роль в Wnt сигнальном пути, который действует на деградацию β-катенина [97]. Wnt сигнал ингибирует деградацию β-катенина за счет ингибирования GSK3 [98], параллельно PI3K-зависимый путь стимулирует проникновение β-катенина в ядро [99], где β-катенин взаимодействует с белками семейства LEF/TCF [100]. Этот комплекс активирует транскрипция целого ряда белков: p300, CBP, Hrpt2, Foxo, Bcl9-2, reptin, pontin, Grouchos, Prmt2, CtBP [101]. По одним данным, в 85% случаях спорадического рака толстой кишки есть мутации в гена APC, и в 50% случаях есть активирующая мутация в гене β-катенина [5]. Также за счет ингибирования GSK3 Wnt сигнальный путь активирует mTOR путь, который отвечает за рост и пролиферацию клетки [102]. Один из маркеров раковых стволовых клеток толстой кишки CD44 является мишенью Wnt сигнального пути [103]. Многие исследования показали, что ингибирования Wnt сигнала в РСК может аннулировать их канцерогенные свойства. При блокировании взаимодействия β-катенина с транскрипционным фактором TCF приводит к аресту клеточного цикла на G1 фазе [104, 105]. Для терапии рака разработано множество потенциальных антагонистов Wnt сигнального пути на основе антител, которые могут действовать на разной стадии передачи сигнала. Антагонисты Wnt сигнального пути являются будущим для терапии рака. Основной целью является создание безопасных препаратов, которые целенаправленно будут действовать на раковые клетки или РСК. Еще одна проблема в том, что существует тканеспецифичный и клеткоспецифичный пути, так как есть 19 Wnt лиганд и множество участников этого пути [106].

Термины протоонкоген, онкоген и ген-онкосупрессор часто используются в онкогенетике. Протоонкогены встречаются во всех нормальных клетках, они являются генами белков, многие из которых передают сигнал от мембраны в ядро в процессах клеточной дифференцировки, деления, апоптоза. После мутаций вызывающих онкогенез их называют онкогенами. К онкогенам относятся и гены вирусов, которые встраиваются в геном хозяина. Первый онкоген был обнаружен в опухоли курицы, который являлся встроенным вирусным геном. Гомологи таких генов были найдены у человека, которые тоже относят к онкогенам. К онкогенам человека относятся гены RAS, SRC, BRAF, MYC. v-myc – онкоген вируса миелоцитомы курицы, v-src – онкоген вируса саркомы Рауса.

Рисунок 1 - Сигнальные пути, наиболее часто измененные при раке толстой кишки [110]


Многие гены-онкосупрессоры осуществляют контроль процессов клеточного деления и повреждения ДНК. Гены-онкосупрессоры в норме экспрессируются на определенном уровне, снижение их экспрессии может привести к неопластическим превращениям. К генам-онкосупрессорам относятся MSH2, MLH1 PMS1, PMS2, MSH6, APC, TP53, DCC, PDGFRL [107].

Все гены, участвующие в развитии наследственных синдромов, являются одним из ключевых участников онкогенеза рака толстой кишки и при спорадическом течении заболевания (таблица 1). Кроме генов представленных в таблице 1 на поздних прогрессирующих стадиях рака толстой кишки участвуют такие ключевые гены, как TP53. Ген TP53 кодирует транскрипционный фактор, который является хранителем генома, потому что участвует в таких процессах как ответ на оксидативный стресс, ДНК репарация, регуляция клеточного цикла, апоптоз и многих других метаболических путях. Потеря функции TP53 найдена при многих опухолях, в основном происходят мутации в центральном домене, который отвечает за связывания с ДНК. Инактивирующие мутации в этом гене обнаружены в 29% случаях РТК [108, 109].


1.1.12 Методы диагностики рака толстой кишки

В последние годы множество исследований посвящено секвенированию полных геномов, транскриптомов всех видов рака [111].

В 2006 году была опубликована работа, в которой провели секвенирование 13023 генов в 11 опухолевых линиях РТК. Выявлено 519 генов с мутациями, которые в разных комбинациях присутствуют в этих линиях, так что в среднем в каждой линии опухоли найдено около 90 генов с мутациями. Из 519 генов только 69 генов были ассоциированы с развитием рака толстой кишки [112]. Кроме этих генов по данным литературы и другие гены участвуют в онкогенезе РТК. Следовательно, можно предположить, что количество ключевых генов ассоциированных с раком толстой кишки гораздо больше. Например, в базе HuGE Navigator (www.hugenavigator.org) 491 ген ассоциирован с развитием рака толстой кишки. Поэтому разработать селективные молекулярные маркеры для диагностики очень сложно.

В диагностике РТК на практике используются следующие инструментальные методы обследования: рентгенологический (ирригоскопия, обзорная рентгенография брюшной полости, компьютерная томография), эндоскопический (колоноскопия) и ультразвуковой. Компьютерная томография является основным современным методом первичного обследования больных с РТК. Метод позволяет оценить местное распространение опухоли, наличие отдаленных метастазов. Для повышения чувствительности метода используется дополнительное контрастирование, которое особенно эффективно для паренхиматозных органов [85].

Исследование кала на скрытую кровь один из неинвазивных методов диагностики, основанный на определении крови в стуле. Метод имеет низкую чувствительность (30-50%) [113, 114]. Пациентов с положительным результатом направляют на колоноскопию. Было выявлено, что этот метод на 16% позволяет уменьшать инциденты рака и ликвидировать заболевание на стадии аденомы [115, 116].

Существуют ряд коммерчески доступных тест систем, которые определяют маркеры РТК. В США для ранней диагностики РТК используется ColoSureTM тест, который проверяет метилирование гена Vimentin в кале [117]. В нормальном эпителии толстой кишки этот ген выключен. Тест показывает 77% чувствительность и 83% специфичность по сравнению с тестом на скрытую кровь [118, 119]. Метилирование гена Septin9 коррелирует с наличием РТК. Изучение метилирование Septin9 в плазме коммерциализировано как тест ColoVantage® [120].

Существуют прогностические маркеры, которые помогают прогнозировать ответ на лечение. Очень трудно определить вторую и третью стадию. На второй стадии нет метастаз в регионарных лимфоузлах. На практике трудно определить наличие или отсутствие метастаз в регионарных лимфоузлах. Экспрессия гена GCC (тест PrevistageTM) в лимфоузлах коррелирует со стадией заболевания [121]. Также есть коммерческий тест (ColoPrint®) на основе экспрессии 18 генов, который также используется для точного определения группы с повышенным риском больных со стадией II и III РТК [122]. Другой коммерческий тест (OncoType DX®) предназначен для прогнозирования рецидивов у пациентов со второй стадией заболевания на основе экспрессии 12 генов [123]. В таблице 5 представлено описание всех упомянутых тест систем. Универсальных молекулярных маркеров для ранней диагностики РТК на данный момент нет [124].

Талица 5 - Коммерческие доступные тест системы




Название теста

Биологический материал

Биомаркер

ColoSureTM

Метилирование ДНК в кале

Vimentin

ColoVantage®

Метилирование ДНК в плазме

SEPT9

ColoPrint®

Экспрессия мРНК в опухоли

MCTP1, LAMA3, CTSC, PYROX D1, EDEM1, IL2RB, ZNF697, SLC6A11, IL2RA, CYFIP2, PIM3, LIF, PLIN3, HSD3B1, ZBED4, PPARA, THNSL2, CA4388O2

OncoType DX®

Экспрессия мРНК в опухоли

Ki-67, C-MYC, MYBL2, FAP, BGN, INHBA, GADD45B, ATP5E, PGK1, GPX1, UBB, VDAC2

PrevistageTM

Экспрессия мРНК в лимфоузлах

GCC (GUCY2C)

Надежды в этой области связаны с изучением микроРНК. Обнаружение микроРНК - одно из самых крупных открытий конца XX века. На настоящее время в геноме человека предсказано более 3000 микроРНК, из которых аннотировано более 1000 микроРНК [125]. На микроРНК сфокусировано большое внимание, потому что изменения в их функционировании непосредственно связаны с возникновением, прогрессией и метастазированием злокачественных опухолей. Предполагается, что нарушение синтеза микроРНК является одной из первопричин изменений во многих патологиях, в том числе при раке.




    1. Достарыңызбен бөлісу:
1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11




©dereksiz.org 2024
әкімшілігінің қараңыз

    Басты бет