Образовательная программа «6D060722- молекулярная и клеточная биология»

1.2.1 Обнаружение микроРНК

Впервые микроРНК была обнаружена в 1993 году Викором Амбросам и его коллегами Розалинд Ли и Ронда Феинбаум. Генетический скрининг кольчатого червя Caenorhabditis elegans выявил гены lin-4, который контролирует личиночную стадию развития нематоды и не кодирует белок, а кодирует две РНК молекулы разной длины (22 н. и 61 н.) [10]. Длинная РНК является предшественником короткой РНК и имеет шпилечную вторичную структуру. Lin-4 имеет антисмысловую комплементарность к множеству сайтам в 3'UTR гена lin-14. В 1993 году было найдено, что при уменьшении количества белка LIN-14 не происходит существенного изменения уровня мРНК lin-14. Это наблюдение привело к созданию модели действия РНК lin-4 на 3'UTR lin-14, которое приводило к подавлению трансляции гена lin-14 [10]. Эта негативная регуляция приводила к переходу из первой личиночной стадии ко второй личиночной стадии. У нематоды клетки на всех четырех личиночных стадиях (L1-L4) имеют разные характеристики и мутации в lin-4 нарушают временную регуляцию развития, что приводит к L1 специфичному делению на более поздних стадиях развития. А в нематодах дефектных по lin-14 проявляются противоположный эффект (L1стадия опускается и происходит ранний переход в L2 стадию) [10, 126].

Спустя семь лет Реинхарт с соавторами открыли вторую микроРНК let-7, которая тоже участвует в регуляции личиночного развития нематоды. Let-7 стимулиреут переход с поздней личиночной стадии на стадии взрослого организма [127]. Далее гомологи let-7 были найдены в геноме человека, Drosophila и 11 других билатеральных животных [128].

Обнаружение механизма действия коротких РНК исторически связано с другими исследованиями. Впервые механизм РНК интерференции наблюдали две группы ученых, которые хотели с помощью сверх синтеза халкон-синтазы придать петунии фиолетовый цвет. При введении гена экспрессия эндогенной и трангенной халкон-синтазы понизилась. Феномен назвали ко-супрессия генов [129]. Пародоксальные результаты начали получать на нематоде. В 1998 году Андрю Файер и Крейг Меллоу с соавторами обнаружили экзогенные двухцепочечные РНК, которые у C. elegans специфически выключали гены по механизму, названному РНК интерференция [130]. За это открытие в 2006 году им была вручена Нобелевская премия в области физиологии и медицины.

Позже были обнаружены многие новые микроРНК, их регуляторные мишени и функции. Было показано на дрозофиле, что в функции микроРНК входит регуляция клеточной пролиферации, клеточной смерти, метаболизма жиров [131, 132], на млекопитающих модуляция развития гемопоэтических предшественников [13], на растениях участие в регуляции развития листьев и цветов [12, 133].

1.2.2 Общая информация о микроРНК

МикроРНК – это малые не белок-кодирующие РНК, которые регулируют экспрессию генов на уровне трансляции мРНК [134]. МикроРНК, обычно состоящие из 16-27 нуклеотидов, входят в семейство малых РНК, которое включает малые ядерные РНК, участвующие в сплайсинге пре-мРНК (snRNA) [135], малые ядерные РНК, модифицирующие рибосомную РНК (snoRNA) [136], и короткие интерферирующие РНК (siRNA) [137], Piwi-взаимодействующие РНК (piRNA) [138].

Больше половины известных микроРНК расположены в межгенных участках или в участках с антисмысловой ориентацией к аннотированным генам [139]. Эти микроРНК локализованы на расстоянии от известных белок-кодирующих генов и у них есть свой независимый транскрипт [140] (рисунок 2).

Остальные микроРНК у животных расположены в интронах [141] . То есть они кодируются на той же стороне ДНК цепи, что и мРНК транскрибирующая белок. Большинство интронных микроРНК не имеют своего промотора и вырезаются из интронов, также как многие snoRNA [142]. Существует небольшая группа микроРНК, которая расположена в экзонах [143].

Такое расположение микроРНК в геноме обеспечивает удобный механизм координации экспрессии микроРНК и белков. Между интронной микроРНК и хозяйской мРНК может сохраняться взаимосвязь при наличии сайтов связывания микроРНК. Было подтверждено сохранение такой связи между miR-7 и мРНК hnRNP K гена, в интроне которого кодируется микроРНК [144].

Другие микроРНК класстеризованы в геноме и транскрибируются как мульти-цистронные первичные транскрипты [140]. МикроРНК из одного кластера могут образовать общий первичный транскрипт и ко-экспрессироваться.

Биогенез микроРНК начинается с синтеза первичного транскрипта (при-микроРНК), который содержит шпильку длиной 60-70 н [145]. МикроРНК могут быть транскрибированы РНК полимеразой II и III (RNA pol-II, pol-III). Обычно РНК полимераза II продуцирует мРНК и некоторые некодирующие РНК, такие как маленькая ядерная РНК (snoRNA), четыре малые ядерные РНК сплайсеосом (snRNA). РНК полимеразой III синтезируются некоторые короткие некодирующие РНК: тРНК, 5S рибосомальные РНК, U6 snRNA. Интронные и экзонные микроРНК транскрибируются вместе с хозяйской мРНК и большинство межгенных микроРНК с РНК-полимеразой II [146, 147].

При-микроРНК процессинг - один из важных этапов биогенеза микроРНК. После транскрипции следует процессинг при-микроРНК, который происходит в ядре. Процессинг при-микроРНК осуществляется у растений и животных за счет РНазы III типа [148, 149]. У животных фермент называется Drosha, у растений DLC1. По организации доменов РНазы III разделяются на 3 класса:

А) РНазы III первого класса есть в геномах бактерий и дрожжей. Каждый белок состоит из одного домена РНазы III (RIIID) и домена связывающего двухцепочечную РНК (dsRBD).

Б) Ферменты второго класса, такие как Drosha состоят из двух RIIID доменов и одного dsRBD домена. Гомологи гена Drosha присутствуют только в геноме животных. Этот большой белок (130-160 kDa) имеет длинный N-конец, функция которого не известна. N-конец содержит пролин и серин/аргинин богатые районы [149].

В) Третий класс РНазы III включает гомологи гена Dicer, который консервативный у Schizosaccharomyces pombe, растений и животных. DICER является белком с массой около 200 kDa и состоит из множества доменов. Кроме двух доменов RIIID и домена dsRBD белок на N-конце имеет DExH РНКгеликаза/АТФазный, DUF283 и PAZ домены. PAZ домен был найден у группы высоко консервативных белков, которые относятся к семейству AGO. Структура и биохимический анализ PAZ домена ago1 и ago2 дрозофилы предполагает, что PAZ домен связывается с 3’выступающим концом коротких РНК [150]. Функции остальных доменов белка DICER пока не известны. Белок DICER может связываться с некоторыми другими белками, но это взаимосвязь не требуется для реакции расщепления, потому что было показано, что очищенный белок DICER обладает ферментативной активностью [151, 152].


Drosha и Dicer относятся к РНазы III и характеризуются наличием двух тандемных доменов RNase III (RIIIDs) и одного домена связывающего с двухцепочечной РНК (dsRBD). Адаптировано с работы [153].
Рисунок 3 - Доменные структуры важных РНазы III
Доменный состав всех важных РНазы III представлен на рисунке 3. Человеческий белок Drosha выделяют во фракцию около 650 kDa, который является частью большого комплекса, называемого микропроцессор. Комплекс вырезает шпилечную структуру, называемую пре-микроРНК, которая имеет длину около 70 нуклеотид. Комплекс состоит из Drosha и DGCR8. В белке DGCR8 есть два dsRBD и один WW домены. Белок Drosha образует внутримолекулярный димер, оба домена обладают уникальной функцией. RIIIDa разрезает 3’цепь, а RIIIDb разрезает 5’цепь при-микроРНК, каждая независимо друг от друга. То есть белок Drosha должен быть правильно сориентирован по отношению к при-микроРНК. Предполагается, что DGCR8 участвует в правильной ориентировки при-микроРНК. По данным экспериментов, Drosha и DGCR8 являются ключевыми компонентами комплекса, но в состав должны входить еще другие неопределенные субъединицы. DGCR8 является типичным компонентам комплекса для млекопитающих, а Pasha для D. melanogaster и C. elegans [154, 155]

Мышиные стволовые клетки с мутацией по DGCR8 гену не продуцируют микроРНК и имеют дефекты в клеточном делении и дифференциации [156].

У простейших (metazoan) шпилька состоит из 33 нуклеотидов: терминальная петля и две фланкирующие одноцепочечные цепи (ssRNA). DGCR8 помогает ферменту Drosha от точки перехода одноцепочечной РНК в двуцепочечную шпильку разрезать на 11 нуклеотиде [157].

Drosha является ингибитором своего же кофактора, он может вырезать шпильку, которая образуется во втором экзоне мРНК гена DGCR8 [157].

После синтеза в ядре пре-микроРНК переносится в цитоплазму. Этот процесс осуществляется экспортином 5, который относится к семейству ядерных рецепторных транспортеров. Экспортин 5 узнает двухцепочечную РНК шпильку длиной 14 нуклеотид с коротким выступом на 3’конце. В начале этот белок был известен как переносчик тРНК, позже было найдено, что главная его функция перенос микроРНК [158].

Пре-микроРНК процессируется в зрелую микроРНК с помощью эндонуклеазы Dicer (рисунок 4) [159]. Некоторые организмы, такие как млекопитающие и нематоды имеют только один фермент, который контролирует биогенез микроРНК и siRNA, тогда как другие организмы имеет несколько ферментов. Например, у дрозофилы экспрессируются два разных фермента, а в геноме арабидопсиса их четыре. Организмы с множеством ферментов имеют строгую специализацию ферментов. Например, у дрозофилы Dicer-1 участвует в биогенезе микроРНК, а Dicer-2 в биогенезе siRNA [160, 161]. Биохимический, генетический и структурный анализ показали, что PAZ и RNase III домены играют ключевую роль в вырезании siRNA с конца двухцепочечной цепи. PAZ домен специфически связывается с концом РНК, у которого на 3’конце есть пара (2 нт) свободных нуклеотидов. После связывания с концом двухцепочечной РНК после двух спиралей субстрата Dicer находит свой центр разрезания. Этот центр находится между двумя димерами RNase III. Каждый домен разрезает одну цепь двухцепочечной шпильки. Процесс вырезания зрелой микроРНК аналогичен процессу вырезания пре-микроРНК из первичной последовательности [161, 162].

У человека были найдены два белка, которые связываются с белком Dicer: белок TRBP (TAR RNA-binding protein, также известный как TARBP2) и белок PACT. Функции этих белков на данный момент неизвестны [161].

На верхней части рисунка представлена доменная организация белка. Фермент Dicer разрезает двухцепочечную РНК (dsRNA) с помощью RNase III домена. Концы dsRNA ассоциированны с PAZ доменом. RNase III домен вырезает 20-30 нуклеотидный дуплекс из прекурсора. Адоптировано от [163].

После вырезания дуплекса зрелых микроРНК из пре-микроРНК, одна из цепей соединяется с белком из семейства аргонавт и образует RISC (RNA induced silencing complex) комплекс. Семейство белков аргонавт может быть разделено на три типа: Piwi белки связываются с piRNA, Ago белки могут быть ассоциированы с микроРНК и siRNA, третья группа белков была описана только у нематоды [164]. Во всех регуляторных процессах с участием РНК длиной 20-30 нуклеотидов принимают участие белки семейства аргонавт, которые имеют вес около 100 kDa. Зрелый дуплекс микроРНК связывается с компонентами RISC комплекса, после чего происходит раскручивание дуплекса и образование стабильной связи между одной цепью микроРНК и Ago белком. МикроРНК в RISC комплексе находит ген-мишень по принципу комплементарности пар Уотсон-Крика, тогда как вторая микроРНК из первичного дуплекса будет сброшена. Аргонавт белки имеют четыре домена: PAZ домен, PIWI домен уникальный для этих белков, N и Mid домены [165, 166]. На рисунке 5 представлено расположение доменов и структура типичного аргонавт белка.

На верхней части рисунка представлено каноническое расположение доменов, ниже представлена структура Ago белка Thermus thermophilus.

1.2.5 Предсказывание генов мишеней микроРНК

На данный момент существует ряд программ, которые предсказывают гены мишени микроРНК. Для животных предсказывать сайты микроРНК сложнее, чем для растений, потому что у большинства сайтов нет высокой комплементарности. У растений большинство сайтов микроРНК имеют почти полную комплементарность [168]. Сайты связывания микроРНК должны быть экспериментально подтверждены и должны иметь следующие критерии: 1. должна быть полная комплементарность между 3'-концом мРНК и восьмью нуклеотидами 5'конца микроРНК; 2. взаимодействие должно быть структурно и термодинамически стабильное; 3. сайт должен быть эволюционно консервативным среди позвоночных [169]. Несколько независимых групп ученых создали алгоритмы предсказывания сайтов микроРНК.

Центр Sanger miRBase (http: // www.mirbase.org/) - основная организация создавшая базу, которая имеет нуклеотидные последовательности микроРНК. Этот центр определяет номенклатуру для генов микроРНК и присваивает имена новым микроРНК для публикации в рецензируемых журналах. Онлайн база данных miRBase содержит все опубликованные последовательности микроРНК вместе с текстовой аннотацией и ссылками на первичный источник и другие базы данных [17].

Гены мишени для всех микроРНК из базы данных miRBase представлены в базе данных MicroCosm (http: // www.ebi.ac.uk/enright-srv/microcosm/htdocs/targets/v5/), в которой представлены предсказанные гены мишени для микроРНК нескольких видов организмов. Впервые сайт микроРНК был предсказан в 2003 году для дрозофилы, когда было обнаружено, что в гене Bantam кодируется микроРНК, которая негативно регулирует экспрессию гена Hid [14]. Hid был первым геном мишенью, который определили с помощью полно-геномного нуклеотид основанного биоинформатического анализа последовательности. Большое количество при-микроРНК были предсказаны компьютерными методами, то есть был проведен поиск последовательностей имеющих шпилечные структуры во вторичной структуре мРНК. Другие компьютерные алгоритмы были созданы для предсказания пре-микроРНК [170].

Но самое большое внимание ученых уделяется определению генов мишеней. Для предсказывания генов мишеней микроРНК разработано множество алгоритмов, наиболее популярные из них мы рассмотрим далее. Алгоритмы предсказывания могут быть разделены на три группы: основанные на комплементарности последовательностей, основанные на энергии взаимодействия, основанные на компьютерном изучении (machine learning-based) [171]. К первой группе алгоритмов можно отнести такие программы как: TargetScan, Pic Tar, miRanda. К программам, основанным на энергии гибридизации, относятся Diana-microT, RNAhybrid. К третьей группе - такие алгоритмы, как: NBmiRTar, miTarget и программа Zhang с соавторами [172].

Программа TargetScan (http: // www.TargetScan.org/) основана на термодинамическом взаимодействии микроРНК с мРНК мишенью. Программа находит сайты микроРНК в 3'UTR гена мишени, которые имеют полную комплементарность со 2 по 8 нуклеотид к 5'концу микроРНК. Сайт должен быть консервативным в нескольких геномах. Область микроРНК с 2 по 8 нуклеотид называется «seed» областью. По консервативности сайтов микроРНК в генах мишеней весь перечень микроРНК поделен на три группы: высоко консервативные, консервативные и низко консервативные. Высоко консервативные сайты должны сохраняться в геномах пяти организмов (человек, мышь, крыса, собака, курица). Поиск сайтов осуществляется по комплементарности в «seed» области. Сайты с мисматчами и Г-У парами в «seed» области отбрасываются. Алгоритм присваивает каждому сайту свой «score», который вычисляется на основе энергии гибридизации и консервативности сайта среди видов [15, 16]. Недостаток программы заключается в поиске сайтов комплементарных только в «seed» области и изучении консервативности сайтов в разных геномах тоже только в этой области.

Pic Tar (http: // pictar.mdc-berlin.de/) - одна из программ, которая широко используется для предсказывания сайтов микроРНК [173]. Это программа обеспечивает сравнение между различным видами, используя многократное выравнивание последовательности ортологичных 3'UTR последовательностей. Расчет параметров проводится для каждой последовательности разных видов отдельно. Программа ищет сохраненные сегменты 3'UTR содержащий комплементарный участок к первым 7-8 нуклеотидам 5'конца микроРНК. «score» рассчитывается по Hidden Markov Model (HMM) для каждого 3'UTR последовательности [174].

Используя вышеперечисленные две программы, которые ведут поиск сайтов в 3'UTR, было предсказано, что 60% всех 3'UTR генов человека регулируются по средствам консервативных у позвоночных микроРНК за счет семи комплементарных нуклеотидов между сайтами мишенями и 5'концами микроРНК [175].

Diana-microT (http://diana.pcbi.upenn.edu/cgi-bin/micro_t.cgi) позволяет вычислять сайты, имеющие полную комплементарность в «seed» области, но и сайты с высокой комплементарностью к 3'концу микроРНК и с мисматчами к 5'концу микроРНК [176, 177]. Используя динамическое программирование, вычисляется минимальная энергия связывания микроРНК с определенным 3'UTR мРНК и случайной последовательности, которая состоит из тех же нуклеотидов, что исследуемый 3'UTR. Г-У пара учитывается, как и уотсон-криковские комплементарные пары. Этот метод выдает 66 % достоверных сайтов, что гораздо выше, чем у большинства программ [178].

miRanda (http://www.micro-RNA.org/) - это программа, которая была создана для предсказания генов мишеней у D. melanogaster, но может использоваться для предсказывания микроРНК мишеней любых организмов [179]. Для каждой микроРНК программа подбирает гены мишени на основе трех свойств: комплементарность последовательности, используя локальный алгоритм выравнивания, свободную энергию гибридизации РНК-РНК дуплекса по программе Vienna RNA fold [180] и консервативность сайтов связывания в близкородственных геномах. miRanda может корректно определить девять из десяти сайтов микроРНК, программа выдает около 24% ложно-положительных сайтов. John с соавторами улучшили программу с помощью введения жесткого критерия для отбора сайтов микроРНК, который требовал полную комплементарность в «seed» области с допущением одного колебания [181].

RNAHybrid - это программа, в которой термодинамика является основой поиска сайтов связывания микроРНК [182]. Программа является классическим усовершенствованным алгоритмом предсказывания вторичной структуры РНК, например, таких как RNAfold [183] и Mfold [184]. RNAHybrid находит наиболее энергетически выгодные сайты для микроРНК, сканируя длинную последовательность РНК мишени. Метод был успешно протестирован на дрозофиле (D. melanogaster). Программа имеет низкий уровень предсказывания ложно-позитивных сайтов. Можно использовать он-лайн версию программы для поиска сайтов микроРНК, также доступна локальная версия программы, в которой можно задавать свои критерии отбора [185]. Как известно большинство программ предсказывают сайты только в 3’нетранслирующей области [186], а RNAHybrid предсказывает сайты локализованные во всех участках мРНК (5’UTR, CDS, 3’UTR) [185]. На данный момент в нескольких работах показано наличие сайтов микроРНК, которые располагаются в 5’UTR and CDS. В программе можно ограничить наличия Г:У пар в seed области. Также можно регулировать количество неспаренных нуклеотидов в сайте взаимодействия. RNAHybrid позволяет определить количество сайтов мишеней предсказанных для одной микроРНК и одного гена.

Рисунок 6 - Приблизительная вторичная структура трех основных видов сайтов мишеней [188]

1.2.6 Г:У пары и неспаренные нуклеотиды в сайтах взаимодействия микроРНК

Были экспериментально доказаны некоторые предсказанные сайты, в которых есть Г:У пары или неспаренные одиночные нуклеотиды [14, 169, 189 - 193]. В большинстве случаев эти мРНК-мишени имеют множество предсказанных сайтов, вклад в регуляцию каждого из этих сайтов не были изучены. In vitro экспериментах было показано функциональность сайтов с Г:У парами [194, 195].
Таблица 6 - Дополнить из статьи случаи с разной локализацией Г:У пар [196]

Сайты взаимодействия	Характеристика seed
мРНК 5’ A 3’ ACAGCAGAAUCA UAGUCUUCCG UGUUGUUUUAGU AUCAGAAGGU miR-7 3’ G 5’	10mer
мРНК 5’ GAA U 3’ ACAACAAAAUCACUAG UUCC UGUUGUUUUAGUGAUC AAGG микроРНК 3’ AG U 5’	4mer (2-5 нуклеотиды)
мРНК 5’ CAA GU 3’ ACAACAAAAUCACUA CUUC UGUUGUUUUAGUGAU GAAG микроРНК 3’ CA GU 5’	4mer (3-6 нуклеотиды )
мРНК 5’ GAA 3’ ACAACAAAAUCACUAG UUCCA UGUUGUUUUAGUGAUC AAGGU микроРНК 3’ AG 5’	5mer (1-5 нуклеотиды)
мРНК 5’ UUA GU 3’ ACAACAAAAUCACU UCUUC UGUUGUUUUAGUGA ACAAG микроРНК 3’ UC GU 5’	5mer (3-7 нуклеотиды)
мРНК 5’ AAA U 3’ AAACGGACGAAA CCCAUCG UUUGCCUGCUUU GGGUGGC микроРНК 3’ CA U 5’	7mer (2-8 нуклеотиды)

Brennecke с соавторами экспериментально протестировали функциональность сайтов с Г:У парами и неспаренными нуклеотидами [196]. В таблице 6 представлены разные варианты сайтов, эффективность которых была подтверждена в этой работе. Также они проверили эффективность сайтов с Г:У парами в “seed” области, но с наличием неспаренных нуклеотидов после “seed”области. Вероятно, поэтому структура была нестабильна и такие сайты не имеют эффективности. Также была показана эффективность сайтов с парными и одиночными неспаренными нуклеотидами в “seed” области при наличии комплементарного 3’конца микроРНК [196]. В большинстве программ сайты с Г:У парами в сайте взаимодействия и не спаренными нуклеотидами в “seed” области отбрасываются.

1.2.7 Методы верификации сайтов связывания микроРНК

Для экспериментального подтверждения взаимодействия микроРНК с мРНК используются такие методы как qRT-PCR, люцеферазный репортерный анализ, вестерн блот анализ [197]. Для оценки действия определенной микроРНК на генные сети проводят изменение экспрессии определенной микроРНК и затем проверяют экспрессию генов на уровне мРНК с помощью microarray анализа и изменения на уровне белка с помощью протеомного анализа. Для изменения экспрессии микроРНК обычно проводится увеличение или ингибирование экспрессии. Чтобы увеличить экспрессию микроРНК проводится трансфекция синтетических микроРНК прекурсоров или в клетки вводятся лентивирусные конструкции, которые стабильно экспрессируют определенную микроРНК [198]. Для ингибирования микроРНК налаживают экспрессию антисмысловых олигонуклеотидов, которые связываются со зрелой микроРНК мишенью [199].

Влияние эктопической экспрессии микроРНК на глобальную экспрессию генов изучается с помощью microarray анализа. Первое исследование с такой стратегией показало, что после трансфекции HeLa клеткам miR-1 и mir-124 были проингибированы более 100 генов в каждом случае [200]. Позднее такие же результаты были получены другими исследователями для других микроРНК [201]. В таких исследованиях методика секвенирования следующего поколения RNA-seq на данный момент не может заменить microarray анализ, хотя этот метод дает более точные результаты.

Для определения прямого связывания микроРНК с мРНК было создано несколько биохимических методов. Для этого можно провести выделение комплекса микроРНК с мРНК с помощью иммунопресипитации за счет компонентов комплекса RISC, аргонавт (AGO), TNRC6 белков [202, 203]. мРНК мишень осаждается вместе с комплексом RISC и затем проводится или microarray анализ, или секвенирование. Иммунопресипитация за счет белков AGO была проведена для определения генов мишеней для известных микроРНК miR-1 и mir-124. После выделения мРНК мишени был проведен microarray анализ [204].

Метод исследования мРНК мишеней при помощи высоко точного секвенирования называется HITS-CLIP (high-throughput sequencing of RNA isolated by crosslinking immunoprecipitation). Для увеличения устойчивости связи между микроРНК и мРНК в этой методике используется предварительная обработка ультрафиолетом 254 нм. Впервые это методика была использована для определения мРНК мишеней в мозгу мыши, а затем для нематоды за счет AGO-связывающих мРНК [205, 206]. Недостатком метода является низкая эффективность ультрафиолетового облучения. Альтернативным методам (photoactivatable-ribonucleoside-enhanced crosslinking and immunoprecipitation - PAR-CLIP) является применение фотоактивируемых рибонуклеозидов для увеличения связи между микроРНК и мРНК мишени [207]. Для этого используются такие нуклеозиды, как 4-тиоуридин, которые усиливают связь для Т и Ц нуклеотидов.

Другим биохимическим методам выделения мРНК мишени является использование биотинилированных микроРНК для выделения микроРНК-мРНК комплексов из клеточных лизатов с помощью стрептавидиновых антител. Этот метод был использован для определения сайтов связывания для микроРНК bantam и miR-124a на клеточных линиях дрозофилы и млекопитающих [208].

Vatolin с соавторами разработали методику определения мРНК мишеней на основе обратной транскрипции мРНК. То есть микроРНК использовали как праймеры для синтеза кДНК мРНК мишени. С помощью метода был подтвержден сайт связывания между lin-4 и lin-14 C. Elegans [209].

pSILAC (Stable isotope labelling with amino acids in cell culture) — метод количественной протеомики, в котором уровень белка измеряется за счет масс спектрометрии для образцов меченных разными изотопами. Этот протеомный метод позволяет регестрировать действие микроРНК на уровне белка. Yang с соавторами проверили действие miR-143 и выявили 93 белка, у которых наблюдалась понижение экспрессии после введения микроРНК. Люцеферазный репортерный анализ показал, что из 34 проверенных мРНК 10 являются мишенью для miR-143 [210].

Из приведенных данных видно, что на данный момент доступно множество методов подтверждения действия микроРНК. В базе данных TarBase на 2012 год насчитывается 65814 экспериментально проверенных сайтов. Базе данных TarBase 6.0 (http://www.microrna.gr/tarbase) объединяет экспериментальные данные, полученные с помощью всех перечисленных методов (репортерный анализ, qPCR, вестерн блот, Micro Array, протеомные (pSILAC), секвенирование (RNA-Seq, HITS-CLIP, PAR-CLIP), Degradome-Seq и другие (ELISA, RACE, иммуногистохимия)). Хотя основная масса данных основана на таких методах, как репортерный анализ, qPCR, вестерн блот, Micro Array [211].
1.2.8 Роль микроРНК в онкогенезе

Эндогенная микроРНК встречается в геноме у животных [212], растений [213], беспозвоночных [214] и вирусов [215]. Обнаружено, что микроРНК занимают приблизительно около 3% генома человека и регулируют примерно 60% всех генов [212]. Одна микроРНК может контролировать экспрессию более ста различных генов [11]. МикроРНК осуществляют регуляторную функцию в процессах развития, клеточной пролиферации и дифференцировки, апоптозе и т.д. [216].

Нарушение регуляции функционирования микроРНК может повлиять на канцерогенез, если микроРНК действуют на мРНК онкогенов и генов-онкосупрессоров. По профилю экспрессии микроРНК можно классифицировать опухоль. Впервые связь микроРНК с раком выявили Калин с соавторами, когда обнаружили, что гены miR-16 и miR-15, расположенные в ломком сайте на 13 хромосоме, делетированы в 65% случаев хронической лимфоцитарной лейкемии [217]. Гиперэкспрессия, понижение или полное подавление экспрессии специфичных микроРНК влияет на канцерогенез РТК [125].

Для описания проявления функции различных генов микроРНК и соответствующих микроРНК можно использовать термины, принятые в онкологии. Гены микроРНК, проявляющие свое действие как белок-кодирующие онкогены, можно называть тоже онкогенами. МикроРНК, проявляющие себя подобно белок-кодирующим генам-онкосупрессорам, можно называть соответственно генами-онкосупрессорами, то есть у первых экспрессия понижена в норме, а у вторых повышена. Такая терминология позволяет описывать функцию микроРНК независимо от локализации их генов в межгенных участках, в белок-кодирующих генах (в том числе в белок-кодирующих онкогенах и генах-онкосупрессорах), либо в других участках ДНК.

МикроРНК, работающие как онкогены, подавляют экспрессию белок-кодирующих генов-онкосупрессоров. Например, семейства miR17-92, miR-21, miR-155, miR-372, miR-373. В результате повышенной экспрессии гена mir-17-92 соответствующая микроРНК проявляет себя как онкоген. Она подавляет активность гена, белок которого должен обеспечить синтез белка-супрессора опухоли или белка, стимулирующего апоптоз опухолевых клеток [218]. МикроРНК, функционирующие как гены-онкосупрессоры, подавляют экспрессию кодирующих онкогенов. Например, let-7, miR-15a, miR-16-1, miR-143, miR-145 [219]. Из-за множественного действия микроРНК некоторые микроРНК действуют в некоторых случаях как онкогены, в других случаях как онкосупрессоры рака. Например, miR-21 и miR-24. В клеточной линии HeLa ингибирование экспрессии этих микроРНК приводит к усилению пролиферации, а в клеточной линии А549 ингибирование экспрессии miR-24 приводит к угнетению клеточного роста. Супрессия miR-21 в культуре глиобластомы активирует каспазы апоптоза, тогда как в гепатоме miR-21 ингибирует онкосупрессор PTEN [220]. МикроРНК, связанные с онкогенезом называют – oncomirs [221].

Синтез многих белков, участвующих в ключевых сигнальных путях развития РТК, таких как белки Wnt/β-катенин и фосфотидилинозитол-3-киназных путей, KRAS, p53 [222], регулируется посредствам микроРНК. Изучение этих микроРНК важно для лучшего понимания патогенеза РТК, определения маркеров для диагностики и для выявления новых терапевтических мишеней.

Wnt/β-катениновый путь играет центральную роль в начальной стадии развития рака толстой кишки. Инактивация гена APC - главное инициирующие событие при РТК в 60% случаях аденомы и карциномы толстой кишки и сопровождается стимуляцией Wnt пути посредством освобождения β-катенина [222]. Считается, что это основное событие в большинстве случаев трансформации нормального эпителия в раннюю аденому. В работе Ногеля с соавторами открыт новый путь регуляции APC при РТК. MiR-135a и miR135-b уменьшают транскрипцию APC in vitro. При аденоме и карциноме толстой кишки увеличивается экспрессия miR-135a и miR135-b in vivo, что коррелирует с уменьшением продукта гена APC [223].

Сигнальный путь рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) стимулирует прогрессию широкого спектра солидных форм рака и перспективен в качестве мишени для противораковой терапии. Активация EGFR и KRAS инициирует каскад эффекторов, которые стимулируют рост, выживание, ангиогенез и метастазы опухоли [224]. В 30-60% аденокарцином имеются мутации в гене KRAS [225]. Продукт этого гена - белок (21 kDa), расположенный на внутренней стороне плазматической мембраны, который участвует в передаче митогенных сигналов от рецептора внутрь клетки [226]. Предполагается, что мутации в этом гене способствуют переходу начальной аденомы в позднюю аденому или аденокарциному [227].

Онкоген KRAS является прямой мишенью для микроРНК семейства let-7 [228]. Когда в культуру DLD-1 раковых клеток, которые слабо экспрессируют микроРНК let-7, вводили прекурсор let-7a-1, рост опухоли значительно супрессировался с параллельным уменьшением белка KRAS, в то время как уровень мРНК KRAS оставался неизменным [229]. В регуляции синтеза KRAS при РТК участвует и miR-143. В клинических образцах опухоли уровень белка KRAS коррелирует с miR-143. Экспрессия KRAS in vitro значительно уменьшается во время обработки прекурсорами miR-143 [230]. Было обнаружено, что и miR-18a регулирует синтез KRAS, но не N- и HRAS уровни в клетках HT-29 аденокарциномы [231].

Другой сигнальный путь, связанный с рецептором эпидермального фактора роста и важный в развитии РТК - фосфотидилинозитол-3-киназный (PI-3-K) путь. Исследования, основанные на анализе профиля экспрессии микроРНК, обнаружили потерю экспрессии miR-126 в линиях рака толстой кишки, тогда как восстановление экспрессии miR-126 в эпителии толстой кишки приводит к значительному уменьшению роста опухоли [232]. Было доказано, что P85β регуляторная субъединица самой фосфотидилинозитол-3-киназы участвует в стабилизации и распространении PI-3-K сигнала посредством miR-126. Кроме того уменьшение P85β регулируется miR-126 и сопровождается значительным уменьшением фосфорилированного уровня белка онкогена АКТ в раковых клетках, приводящего к торможению PI-3-K пути. В опухоли отмечено уменьшение miR-126 вместе с увеличением р85β белка [232]. Другой важный регуляторный компонент PI-3-K пути - ген-онкосупрессор PTEN, экспрессия которого сильно угнетается miR-21, что было продемонстрировано на карциноме печени [233]. При РТК также показано нарушение регуляции miR-21 [234]. Итак, супрессия PTEN контролируется miR-21 и ассоциируется с усилением PI-3-K пути и прогрессией РТК.

Хорошо известный супрессорный ген ТР53 мутирован в 50-75% случаях РТК. ТР53 участвует в контроле ДНК репарации и регулирует митогенные онкогены через индукцию белков точек сверки клеточного цикла, апоптоза, клеточного старения [222]. Многочисленные исследования показали, что транскрипционный активатор ТР53 прямо или косвенно супрессирует экспрессию специфичных генов [235]. Было обнаружено, что ТР53 контролирует экспрессию микроРНК, которая позволяет косвенно регулировать транскрипцию гена мишени на посттранскрипционном уровне [236]. На линии опухолевых клеток толстой кишки HCT-116 показано, что семейство miR-34a-c является транскрипционной мишенью для TP53 [237]. Экспрессия miR-34a является достаточным условием для запуска апоптоза через TP53 зависимый и независимый пути. Ген микроРНК miR-34b/с эпигенетически выключен у 9 из 9 клеточных линий РТК и 101 из 111 первичных опухолей РТК [238].

Изучение экспрессии микроРНК может быть полезным для определения и предсказания причины развития рака. С использованием real-time PCR метода была идентифицирована экспрессия большой группы микроРНК для выявления отличия рака поджелудочной железы от нормальной железы и от доброкачественной опухоли [239]. Был определен профиль экспрессии более 200 микроРНК прекурсоров. Более ста прекурсоров микроРНК абберантно экспрессируются в опухолях поджелудочной железы, среди них микроРНК уже ассоциированные с раком в предшествующих работах: miR-155, miR-21, miR-221 и miR-222. MiR-376a и miR-301 были впервые ассоциированы с онкозаболеваниями. По панели экспрессии микроРНК были правильно определены 28 из 28 опухолей поджелудочной железы, 11 из 15 доброкачественных опухолей и 6 из 6 нормальных тканей поджелудочной железы [239]. Большинство дифференциально экспрессируемых микроРНК в опухолях поджелудочной железы показали повышенную экспрессию микроРНК. Высоко экспрессируемые микроРНК могут быть терапевтическими мишенями при использовании антисмысловых олигонуклеотидов, а также как маркеры для диагностики рака.

Обнаружено, что при РТК у 21 микроРНК уровень экспрессии повышен, а экспрессия одной мироРНК понижена. Было зарегистрировано нарушение экспрессии miR-17-5p, miR-20a, miR-21, miR-92, miR-106a, miR-155 [240].

В другой работе проанализировано 156 микроРНК и для 13 микроРНК были значительные изменения в экспрессии. Уровень экспрессии miR-31 коррелировал со стадией опухоли [241].

Еще одним применением микроРНК является противораковая терапия. Основная цель лекарств будущего поколения - индуцировать клеточную смерть исключительно опухолевых клеток. МикроРНК проявляют регуляторную роль в малигнизации и апоптозе, поэтому их можно использовать в модуляции чувствительности опухолей к терапии. Например, miR-145 проявляет проапоптозный эффект, который зависит от активации TP53. MiR-145 подавляет экспрессию альфа рецептора к эстрогену. Предлагается терапия с возобновлением экспрессии miR-145, которую можно использовать для опухолей с диким типом гена TP53 и с рецепторами к эстрогену [242].

MiR-15b и miR-16 проявляют модулирующую чувствительность к пяти из шести протестированных лекарств при раке желудка. Гиперэкспрессия обеих микроРНК наблюдается вместе с увеличением винкристин индуцированного апоптоза в клетках рака желудка. Обнаружено, что эти микроРНК регулируют уровень противоапоптозного белка BCL-2. Уменьшение экспрессии miR-15 и miR-16 вызывает устойчивость к лечению [243].

Показано, что глобальная репрессия микроРНК приводит к прогрессированию рака через быстрый рост опухоли и метастазирование. На модели KRAS индуцированного рака легких мыши установлено, что делеция гена белка DICER1, участвующего в биогенезе микроРНК, приводит к быстрой прогрессии опухоли. Восстановление нормального уровня экспрессии микроРНК может ингибировать рост опухоли [244].

В заключение необходимо отметить, что изучение функционирования микроРНК приведет к решению проблемы ранней молекулярной диагностики и будет способствовать разработке новых способов лечения рака.