Ооо «Лаборатория Изоген»
жүктеу/скачать 116.5 Kb.
|
- Бұл бет үшін навигация:
- 2. ПРИНЦИП ДЕЙСТВИЯ
- 3. АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
- 4. МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
- 5. ХАРАКТЕРИСТИКА НАБОРА
- 6. МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ
- 7а. УСКОРЕННАЯ ПРОБОПОДГОТОВКА
- 7б. УНИВЕРСАЛЬНАЯ ПРОБОПОДГОТОВКА
- 8. ПОСТАНОВКА PCR.
- 9. ПРОВЕДЕНИЕ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА
- 10. ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ АНАЛИЗА
ООО «Лаборатория Изоген» эту Инструкцию, даже если Вы использовали набор ранее. Информация могла измениться.
инфекционных заболеваний методом полимеразной цепной реакции И н с т р у к ц и я НАЗНАЧЕНИЕ1.1. Наборы реагентов GenePak™ DNA PCR test предназначены для обнаружения ДНК возбудителей инфекционных заболеваний в пробах человека и животных методом полимеразной цепной реакции (PCR). 1.2. Наборы реагентов GenePak™ DNA PCR test могут быть использованы в клинической лаборатории для обнаружения ДНК бактериальной, вирусной, грибковой или другой природы и оценки эффективности проводимой терапии. 1.3. Время проводимого анализа составляет не более 4 ч. 1.4. Наборы рассчитаны на проведение 100 реакций, из них 10 положительных и 10 отрицательных контрольных образцов.
2.2. Наборы реагентов GenePak™ DNA PCR test представляют собой лиофилизованные сухие реакционные смеси, готовые для амплификации выделенной ДНК.
с бромистым этидием под УФ светом с длиной волны 310 нм. По нали- чию специфического фрагмента амплификации определенного размера судят о присутствии ДНК возбудителя в анализируемом материале. Реги- страцию результатов можно проводить визуально, с помощью фотогра- фиирования или сканирования видеосистемой.
3.2. При использовании в качестве исходного материала отрицательного контрольного образца после проведения электрофореза на агарозном геле полоса желтого цвета должна отсутствовать. 3.3. Чувствительность реакции составляет около 10 копий матрицы ДНК в 10 мкл реакционной смеси. 4. МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ4.1. Все компоненты набора в используемых концентрациях являются нетоксичными. 4.2. При работе с набором и с анализируемыми образцами человека следует надевать одноразовые резиновые перчатки, так как анализируемые пробы человека являются потенциально инфицированным материалом, способным длительное время сохранять и передавать ВИЧ, вирус гепатита В, С или другой возбудитель вирусной или другой инфекции. 4.3. При работе с включенным трансиллюминатором необходимо пользоваться защитным экраном или специальной защитной маской, так как ультрафиолетовый свет вызывает ожоги лица и слизистой глаз. 4.4. Запрещается снимать крышку с электрофоретической камеры, если она подключена к источнику питания, так как высокое напряжение опасно для жизни.
4.11. Химическая посуда и оборудование, которые используются при работе с набором реагентов, должны быть соответствующим образом маркированы и должны храниться отдельно. 5. ХАРАКТЕРИСТИКА НАБОРА
5.3. Комплект реактивов для Магнитной пробоподготовки: Lysis reagent (Лизирующий реагент), готов к применению -1 фла- кон, 30 мл, Saline buffer (Cолевой буфер) - 10-кратный, 1 флакон, 10 мл. Magnetic (Суспензия сорбента), готов к применению – 2 пробирки по 1 мл, ЕxtraGeneтм (ЭкстраГенTM, суспензия смеси ионообменников), - 1 флакон, 10 мл;
5.4. Комплект реактивов для постановки PCR:
5.5. Комплект реактивов для детекции ДНК, включающий:
6. МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ6.1. Программируемый термостат (амплификатор);
от комнатной до 100+20 С; 6.3. Микроцентрифуга, развивающая ускорение до 10000 об/мин; 6.4. Вортекс; 6.5. Электрофоретическая камера; 6.6. Источник постоянного тока; 6.7. УФ-трансиллюминатор; 6.8. Холодильник бытовой; 6.9. Пипетки автоматические одноканальные с переменным объемом; 6.10. Плитка электрическая или СВЧ-печь; 6.11. Водоструйный или аналогичный насос; 6.12. Микропробирки (1,5 мл); 6.13. Наконечники для пипеток (от 10 до 200 мкл); 6.14. Наконечники для пипеток (от 200 до 1000 мкл); 6.15. Колба коническая (500 мл); 6.16. Цилиндр мерный (1000 мл); 6.17. Перчатки резиновые медицинские; 6.18. Спирт этиловый 96%; 6.19. Вода бидистиллированная и дистиллированная. 7а. УСКОРЕННАЯ ПРОБОПОДГОТОВКАПробоподготовка Ускоренная рекомендуется использовать в случае проб с малым содержанием биологического материала (слюна, моча, слеза, смыв из носоглотки, соскоб слизистой и т.д.). Для отбора пробы соскоба слизистой, мазка или смыва от слизистой используется стерильный физраствор объемом 0,5-1,0 мл и одноразовые специальные щеточки или зонды. Плазма, сыворотка крови, спинномозговая жидкость и моча используются без разбавления физраствором. Моча для анализа должна быть прозрачной без солевого осадка. В случае появления помутнения мочу рекомендуется термостатировать при 370С 15-20 мин. Пробы, готовые к обработке, не должны содержать мукуса (слизи). Для обработки проб мокроты, богатых мукусом, рекомендуется использовать специальный Муколитический реагент. При наличии большого количества биологического материала в пробе (соскоб слизистой и т.д.), следует перенести в чистый эппендорф 100-500 мкл надосадка, полученного после оседания грубого осадка, и использовать в Ускоренной пробоподготовке. 7а.1 Подготовка рабочего ЭнзиМикса™. В пробирку с ЭнзиМиксом™ добавить весь объем (100 мкл) Растворителя ЭнзиМикса™ и перемешать до полного растворения сухого содержимого, энегично встряхивая и смывая со стенок пробирки. Полное растворение может продлиться до 15 мин. Далее готовый ЭнзиМикс™ хранить при -200С в течение года. 7а.2. Подготовка рабочего ЭкстраГенаTM. В пробирку с 1 мл ЭкстраГе- натм добавить 10 мкл EnzyMixTM, перемешать и перенести в холодильник до использования. Готовый рабочий ЭкстраГентм можно хранить при 2-80С в течение недели. При необходимости можно приготовить аналогичным образом рабочий ЭкстраГентм нужного объема, соблюдая объемные соот- ношения компонентов. 7а.3. Центрифугировать анализируемые пробы (суспензия биологического мате- рала в физрастворе объемом до 1 мл) 2 мин при 10 000 об/мин для сбора клеточного материала. 7а.4. Осторожно, не задевая еле заметный осадок, удалить суперна- тант, используя водоструйный насос. 7а.5. Добавить к осадку от 50 до 200 мкл готового ЭкстраГенатм, в зависимости от объема полученного осадка, и суспендировать осадок на вортексе. Внимание! ЭкстраГентм следует отбирать от общего объема при
7а.6. Инкубировать пробирки при 560С 30 мин, а затем 10 мин при 1000С. 7а.7. Центрифугировать пробирки 10-15 сек при 10000 об/мин. для сбора конденсата и осаждения несолюбилизированного дебриса. Для поста- новки реакции использовать 10 мкл. прозрачного, без гранул ЭксраГе-
бирку происходит ингибирование реакции и приводит к появлению ложноот- рицательных результатов.
делении чистой ДНК из биологических жидкостей и тканей, богатых ДНК (крови, гомогената ткани, клеточной суспензии, соскоба слизистой и т.д.). 7б.1. Приготовление рабочего раствора Солевого буфера. Содержимое флако- на с Солевым буфером, 10 мл, перенести в мерный цилиндр, довести биди стиллированной водой до метки 100 мл, затем 96% этанолом до метки 300 мл и перемешать. Полученный раствор следует хранить в герметично закрытой посуде при температуре 2-80С в течение одного года. 7б.2. В 1,5 мл пробирку добавить 100 мкл. пробы (кровь, плазма, сыворотка, со- скоб слизистой в физрастворе, моча и др.), добавить 300 мкл Лизирующего реагента и перемешать, переворачивая пробирку. 8. ПОСТАНОВКА PCR.8.1. Достать нужное количество бесцветных пробирок МастерМикса для анализа проб, одну пробирку синего цвета (-) контроля для амплификации отрицательного контроля и одну пробирку красного цвета (+) контроля для амплификации положительного контроля. Промаркировать соответствующим образом отобранные пробирки.
8.3. Добавить в бесцветные пробирки МастерМикса по 10 мкл готовой для анализа ДНК проб (см. Пробоподготовку 7а.7 или 7б.16).
Внимание: 1. Для предотвращения контаминации следует строго соблюдать последовательность внесения образцов: сначала в анализируемые пробы, затем в (-) контроль и в конце в (+) контроль. Обязательно менять наконечник. 2. При работе с анализируемыми пробами рекомендуется использовать специальные наконечники с антиаэрзоль ными фильтрами.
Таблица 1
8.7. После окончания амплификации все пробирки перенести в комнату для проведения детекции ДНК. 9. ПРОВЕДЕНИЕ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА9.1. Приготовление рабочего раствора буфера для электрофореза (ТВЕ). В мерную колбу (цилиндр) на 1000 мл внести содержимое флакона с бу- фером для электрофореза (ТВЕ), довести до метки дистиллированной во- дой и перемешать до полного растворения порошка. ТВЕ буфер использу- ется также и для приготовления агарозного геля. Готовый ТВЕ буфер может храниться при комнатной температуре в течение 2 месяцев. 9.2. Приготовление агарозного геля. В коническую колбу на 500 мл внести содержимое флакона с агарозой, добавить 200 мл готового ТВЕ буфера и поместить колбу на электрическую ппитку. Довести содержимое колбы до кипения и после того, как агароза полностью расплавится, колбу с агарозой снять с плитки. Готовая агароза должна быть прозрачной и не должна содержать нерасплавленных частиц. * Примечание: Для быстрого приготовления агарозы можно исполь- зовать микроволновую печь (2 мин при “высокой мощности”). 9.3. Подготовка электрофоретической камеры к заливке агарозного геля. Установить крышку с ванночкой на камеру, а платформу для заливки геля поместить в ванночку. Установить гребенку на платформу. 9.4. Расплавленную агарозу охладить приблизительно до 500С в теплой воде или на столе при комнатной температуре. Затем в колбу с готовой агарозой внести 15 мкл этидиума бромида и осторожно перемешать содержимое колбы равномерными вращательными движениями. 9.5. Агарозу налить на платформу. Толщина слоя агарозы должна быть около 4 мм. 9.6. После застывания агарозы (примерно через 20-25 мин) осторожно, чтобы не порвать карманы, вынуть гребенку, а платформу с застывшим агарозным гелем перенести из ванночки в электрофоретическую камеру. 9.7. Добавить ТВЕ буфер в электрофоретическую камеру так, чтобы буфер покрывал агарозный гель слоем приблизительно 2-3 мм. 9.8. Отобрать 10 мкл продукта амплификации из-под Масла и добавить в соответствующую лунку агарозного геля, осторожно, чтобы предотвратить перетекание из одного кармана в другой. 9.9. Установить крышку на камеру, подключить электрофоретическую камеру к источнику питания и установить на источнике питания напряжение 100-200 В (не более 15 В/см). 9.10. Через 20 - 30 мин (примерно 0,5 см прогона синей краски) электрофоре- тическую камеру отключить от источника питания, отсоединить провода от камеры, снять крышку с электрофоретической камеры. 9.11. Вынуть платформу с агарозным гелем из электрофоретической камe- ры, дать жидкости стечь с геля и осторожно промыть агарозный гель водой. Внимание! При работе с арагозным гелем и бромистым этидием следует обязательно надевать резиновые перчатки! 9.12. Осторожно перенести гель на экран УФ трансиллюминатора. 9.13. Надеть защитную маску или установить защитный экран, включить трансиллюминатор и проанализировать полученные результаты
10.2. В пробирке маркированной (-) специфическая полоса ДНК определенного размера должна отсутствовать, а полоса внутреннего контроля размером 100 пн должна быть видна. 10.3. В пробирке маркированной для анализируемых проб наличие полосы строго на уровне полосы положительного контрольного образца свидетельствует о положительной реакции образца на возбудитель. Полоса внутреннего контроля размером 100 пн также должна быть видна. 10.4. Результаты анализа должны быть отменены: а) в случае наличия полосы в отрицательном контрольном образце на уровне полосы положительного контроля (результат контаминации), б) при отсутствии полосы внутреннего контроля размером 100 пн в в анализируемых пробах и контролях (свидетельство наличия ингибирования PCR или же потерь ДНК при пробоподготовке). 10.5. Наличие слабых полос выше или ниже полосы положительного контрольного образца может быть результатом неспецифической амплификации, которые не должны быть приняты во внимание.
11.1. Все компоненты наборов реагентов GenePak™ PCR test можно транспортировать при температуре окружающей среды, от -20до +300С. 11.1. Все компоненты наборов реагентов можно хранить при температуре 2-250С в течение 1 года со дня выпуска. 11.2. Готовый рабочий раствор протеолитического комплекса EnzyMix™ следует хранить при -200С в течение 1 года со дня разведения. 11.3. Готовый рабочий раствор Солевого буфера следует хранить в герметично закрытой посуде при 2-80 С 1 год со дня разведения. 11.4. Готовый рабочий раствор TBE буфера для электрофореза можно хранить при комнатной температуре в течение двух месяцев. 11.5. Для получения воспроизводимых результатов необходимо строгое соблюдение объемов добавляемых PCR Растворителя и исследуемой ДНК.
Для справок тел/факс: (095) 132 67 95, e.mail: shaikhaev@vigg.ru Шайхаев Гаджи Омарович
в зависимости от типа используемого апмплификатора, рекомендуется оптимизировать температуру отжига в пределах 20С от базового 580С. Только для исследовательского применения
жүктеу/скачать 116.5 Kb. Достарыңызбен бөлісу:
| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||