Определение содержания абсцизовой и индолилуксусной кислот методом тфифа фиксация материала
жүктеу/скачать 92.82 Kb.
|
| 3. Проведение ТФИФА
Для проведения ТФИФА применяют полистироловые планшеты фирм «Linbro», «NUNC», «Енисей», которые могут различаться особенностью химической структуры твердой фазы и сорбционной емкостью. По данным С. Ю. Веселова (1998), это важно учитывать при использовании тестсистем в прямом ТФИФА, когда на планшете сорбируются антитела. При непрямом ТФИФА, в котором на планшете сенсибилизируется конъюгат ФГ-белок с высокой плотностью связывающих центров (например, 10 молекул гормона на 1 молекулу белка), сорбционная емкость планшетов указанных фирм является, как правило, достаточной. На рис. 6 показано расположение лунок на полистироловом планшете: 12 вертикальных рядов по 8 лунок в каждом. Всего 96 лунок объемом по 200 мкл, т. е. одновременно можно проводить иммуноанализ по определению фитогормонов в нескольких образцах. Один или два ряда лунок используют для построения калибровочной кривой Рис. 6. Расположение лунок на полистироловом планшете стандартного фитогормона. Крайние лунки желательно не использовать, так как они могут отличаться от других сорбционной способностью. 3.1. Сенсибилизация 3.1.1. Содержимое флакона или ампулы с конъюгатом ФГ-белок (ИУК-белок или АБК-белок) растворить в объеме бидистиллированной воды, указанном на этикетке флакона. 3.1.2. Приготовить рабочее разведение конъюгата на карбонатном буфере рН = 9,2 в указанном соотношении, например, 1:100 или 1:200. Возможно разведение конъюгата в карбонатном буферном растворе без предварительного растворения водой, о чем сообщается на этикетке набора. Внимание! Следите за рекомендациями по разведению. Рабочий раствор конъюгата ФГ-белок следует использовать только в день приготовления. Рассчитывается его необходимое количество в зависимости от числа исследуемых образцов и лунок планшета, используемых для иммуноанализа каждого опытного образца и калибровочной кривой стандартного гормона из расчета 200 мкл на 1 лунку. Иммуноанализ одного образца обычно проводится в 4—8 лунках. 3.1.3. Внести в лунки планшета по 200 мкл приготовленного раствора конъюгата ФГ-белок на карбонатном буфере. Планшет закрыть крышкой и выдержать 1,5—2 ч при температуре +37 °С в термостате или 16—20 ч при температуре +2...+4 °С в холодильнике для адсорбции (сенсибилизации) конъюгата ФГ-белок на твердой фазе планшета. 3.1.4. После завершения этапа адсорбции раствор конъюгата удалить из лунок встряхиванием перевернутого планшета и промыть лунки три раза раствором фосфатно-солевого буфера (рН = 7,2 ± 0,2), содержащего 0,05 % Твин 20 (раствор «ФТ»). При последнем промывании остатки промывной жидкости тщательно удалить из лунок многократным встряхиванием планшета. 3.2. Реакция с антителами 3.2.1. После промывания в лунки внести по 90 мкл фосфатно-солевого буферного раствора, содержащего 0,25—0,5 % альбумина (раствор «ФТБ»). 3.2.2. В шести или семи лунках первого и/или второго ряда планшета приготовить десятикратные разведения стандартного раствора гормона (ИУК или АБК) для построения калибровочной кривой. Для этого в первую или вторую лунку ряда внести 10 мкл исходного стандартного раствора гормона в концентрации 1 мг/мл. Перемешать и, сменив наконечник дозатора, взять из полученного раствора этой лунки 10 мкл и перенести в следующую лунку. Повторяя операцию, приготовить таким образом разведения стандартного раствора в пяти или шести лунках, в которых содержание гормона уменьшается от 10 мкг до 100 или 10 пг. В последние лунки ряда раствор гормона не вносить — это бесконкурентный вариант; оптическая плотность раствора в этих лунках после проведения имуноферментной реакции принимается за нулевую точку. 3.2.3. В другие рабочие лунки планшета (кроме лунок калибровочного ряда) внести по 10 мкл спиртового раствора экстрактов опытных образцов (4—8 лунок для каждого образца). Предварительно растворить сухие остатки растительных экстрактов, находящихся в «пальчиковых» пробирках, в 100 мкл 80%-го этанола, перемешивая содержимое осторожным поворотом пробирки. В лунки калибровочной кривой, содержащие стандартные растворы гормона, и в лунки бесконкурентного варианта внести по 10 мкл 80%-го этанола для выравнивания сорбционных условий во всех лунках. Стандартный раствор ИУК, используемый для построения калибровочной кривой, обязательно метилируется, как и сухие экстракты опытных образцов при определении в них данного гормона. В случае определения АБК метилирование стандартного раствора и экстрактов опытных образцов возможно, но не обязательно. 3.2.4. Содержимое флакона с антисывороткой к соответствующему гормону (к ИУК или АБК) растворить в бидистиллированной воде, как указано на этикетке флакона. Затем приготовить рабочее разведение антисыворотки на растворе «ФТБ» в указанном соотношении, предварительно рассчитав необходимый объем сыворотки 30 в соответствии с числом рабочих лунок на планшете (100 мкл сыворотки на 1 лунку). 3.2.5. Во все рабочие лунки, включая лунки калибровочного ряда и бесконкурентного варианта, внести по 100 мкл приготовленного раствора антисыворотки к гормону на «ФТБ». Планшет закрыть крышкой и выдержать в термостате при +37 °С 2 ч. При определении ИУК время выдерживания планшета в термостате может быть сокращено до 1—1,5 ч. 3.2.6. После термостатирования содержимое из лунок удалить встряхиванием перевернутого планшета. Промыть три раза раствором «ФТ», полностью заполняя лунки планшета промывным раствором. В конце промывания тщательно освободить лунки от остатков жидкости. жүктеу/скачать 92.82 Kb. Достарыңызбен бөлісу:
|