Определение содержания абсцизовой и индолилуксусной кислот методом тфифа фиксация материала
Определение количества гормона в образце
жүктеу/скачать 92.82 Kb.
|
- Бұл бет үшін навигация:
- 4. Приготовление растворов
| 3.5. Определение количества гормона в образце
3.5.1. Построить калибровочную кривую зависимости оптической плотности растворов от десятичного логарифма концентрации стандартного гормона в лунках. Калибровочная кривая имеет сигмоидную форму (рис. 7). Линейная область кривой совпадает с диапазоном наиболее точных измерений, где ошибка определения минимальна, поскольку в этой области большей разнице в оптической плотности соответствует меньшее отклонение в содержании гормона, чем в нелинейных областях. Чем выше угол наклона линейной области, тем выше точность измерений. Параметры Рис. 7. Зависимость параметров концентрационной кривой от разведения сыворотки или конъюгата ФГ-белок: 1 — высокая концентрация иммунореагента; 2 — разведение иммунореагента в два раза концентрационной кривой зависят от разведения сыворотки, конъюгата ФГ-белок, метилирования гормона (особенно ИУК). Уменьшение концентрации сыворотки приводит к сдвигу верхнего предела линейной области в сторону меньших концентраций гормона. Нижний предел линейной области также сдвигается, но в меньшей степени. В результате увеличивается наклон линейной области (если концентрация конъюгата ФГ-белок является лимитирующей) и, следовательно, точность измерений, но уменьшается диапазон концентраций в линейной области. Такое же изменение параметров концентрационной кривой происходит при уменьшении концентрации конъюгата ФГ-белок, который сорбируется на полистироле. Хотя при снижении концентрации иммунореагентов увеличивается чувствительность реакции, тем не менее снижение концентрации имеет свои пределы, так как при очень сильном разведении иммунореагентов уменьшается наклон линейного участка, кривая становится пологой и снижается точность определений. 3.5.2. Определить количество гормона в лунках, куда были внесены экстракты растительных образцов. На калибровочной кривой отметить значение оптической плотности раствора в лунке опытного образца и провести вертикальную линию до пересечения с осью абсцисс (см. рис. 7). Точка пересечения попадет в какой-то интервал концентраций, например, от 1 до 10 нг. Если разбить этот интервал на 10 равных частей, то точка пересечения будет указывать какую-то часть этого интервала (от 0,1 до 0,9). Так как на оси абсцисс увеличение концентрации гормона показано в логарифмической шкале, то для определения истинной концентрации вводятся коэффициенты (табл. 1). Например, при оптической плотности 0,14 (см. рис. 7, кривая 2) точка пересечения с осью абсцисс попадает на 0,5-ю часть интервала концентраций от 1 до 10 нг. При линейном масштабе это соответствовало бы концентрации 6 нг. Фактическая концентрация определяется умножением минимального значения концентрации этого интервала (в данном случае 1 нг) на коэффициент, соответствующий 0,5 части интервала — 3,1 (см. табл. 1), т. е. концентрация гормона в лунке опытного образца равна 3,1 нг. Таблица 1 Коэффициенты для определения содержания гормона при логарифмической шкале концентрационной кривой 3.5.3. Рассчитать среднее значение из нескольких определений содержания гормона в лунке и на 1 г сухого веса растительной ткани по формуле: X = C·V1 / M·V2 , где Х — концентрация гормона на 1 г сухого веса; С — содержание гормона в лунке, определяемое по калибровочной кривой; V1 — объем 80%-го этанола, в котором растворяется сухой экстракт образца (как правило, 100 мкл, но может быть изменен); V2 — объем спиртового экстракта, вносимого в лунку — 10 мкл; M — сухая масса навески растительного материала, взятой для иммуноанализа. 35 Если V1 = 100 мкл и V2 = 10 мкл (как дано в методике), то концентрация гормона на 1 г сухого веса рассчитывается по формуле: X = 10 · C /M 4. Приготовление растворов 4.1. Карбонатный буфер, рН = 9,2 ± 0,2: Na2 CO3 — 3,2 г; Na HCO3 — 5,1 г. Растворить в воде и довести раствор до 1 л. 4.2. Фосфатно-солевой буферный раствор с Твин 20 («ФТ»), рН = 7,2 ± 0,2: раствор А: Na2 HPO4 · 12H2 O — 71,6 г, довести до 1 л; раствор Б: NаН2 РO4 — 27,6 г, довести до 1 л; буферный раствор: 36 мл раствор А + 14 мл раствор Б + + 8,7 NaCl + 0,5 мл Твин 20, довести до 1 л. 4.3. Раствор «ФТБ»: 100 мл раствор «ФТ» + 0,25 г альбумин. 4.4. Субстратный буферный раствор для цветной реакции, приготовить непосредственно перед употреблением: 25 мл субстратный буфер (рН = 5,1 ± 0,1) + 10 мг ортофенилендиамин + 10 мкл 30%-й перекиси водорода. Субстратный буфер, рН = 5,1 ± 0,1: раствор А: Na2 HPO4 — 2,1 г на 100 мл воды; раствор Б: лимонная кислота — 7,7 г на 100 мл воды; буфер: 90 мл раствор А + 10 мл раствор Б. 4.5. Стандартный раствор ИУК или АБК. Взять навеску 1 мг препарата ИУК или АБК на кальке и вместе с ней навеску перенести в мерную «пальчиковую» пробирку. Добавить 2—3 капли 80%-го этанола, растворить навеску и довести раствор до 1 мл водой. Хранить в морозильной камере. жүктеу/скачать 92.82 Kb. Достарыңызбен бөлісу:
|