ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ

Жумалин А.Х, Куйбагаров М.А.

В качестве объекта исследований был выбран хлорамфеникол (левомицетин) – антибиотик широкого спектра действия часто применяемый в сельском хозяйстве. В отличие от многих препаратов хлорамфеникол медленно выводится из организма животных, сравнительно долго сохраняет свою активность при хранении продуктов и оказывает негативное действие на кроветворную систему. Гигиенические требования к качеству и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов не допускают присутствия хлорамфеникола в мясе, молоке и яйцах. Низкие концентрации антибиотика можно обнаружить только с помощью высокочувствительных современных методов. В современной мировой практике для этой цели широко используются методы на основе иммуноферментного анализа (ИФА) [1, 2, 3]. Одним из основных реагентов при этом являются специфические антитела. При этом получение иммуноглобулинов к антибиотикам (как и к другим гаптенам) остается трудновыполнимой задачей, поскольку в чистом виде они не вызывают иммунного ответа.

В связи с этим, целью данной работы было получение штаммов гибридом продуцентов МКА специфичных хлорамфениколу.

В качестве высокомолекулярных белков-носителей использовали бычий сывороточный альбумин (БСА) с молекулярной массой 66 кД (Sigma), овальбумин (ОВА) с молекулярной массой 45 кД (Sigma). Также в качестве носителя был использован латекс (Latex beads, carboxylate-modified polystyrene, 0.9 μm mean particle, Sigma). В качестве сшивающего агента использовали 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride (EDC) (Sigma). Для конъюгации использовали «Левомицетин – КМП» (хлорамфеникол) ОАО «Киевмедпрепарат», Украина.

Синтез конъюгатов хлорамфеникола (ХАФ) с БСА и ОВА проводили с использованием препарата 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride (EDC). Очистку конъюгатов от не связавшихся реагентов проводили на колонке (15х1,5 см) с сефадексом G-25. Элюирование проводили с помощью Tris-HCl буфера (рН-7,5).

Для синтеза конъюгата хлорамфеникола с латексом (1% суспензия) также использовали EDC с конечной концентрацией 1 мг/мл.

Иммунизацию мышей линии Balb/c проводили конъюгатом латекс-ХАФ внутрибрюшинно в дозе 0,1 мл 4 раза в течение 14 суток. Через 7 суток проводили реиммунизацию. Взятие крови у иммунизированных мышей проводили через 3 дня после последней иммунизации и исследовали в непрямом варианте ИФА. Для этого ячейки 96-луночного планшета для иммунологических реакций сенсибилизировали конъюгатами БСА-ХАФ и ОВА-ХАФ на фосфатно-солевом растворе (ФСР) рН 7,2 в концентрации (30 мкг/мл), при 4ºС в течение ночи. После этого вносили антителосодержащую жидкость, инкубировали при 37ºС в течение 60 минут. Результаты ИФА учитывали с помощью спектрофотометра с вертикальным потоком света (ASYS Expert 96) при длине волны 450 нм.

Гибридизацию клеток миеломы Х₆₃Ag 8.653 и иммунных спленоцитов проводили по методу [4]. Клетки после гибридизации высевали в ячейки 96–луночного планшета (Nunc, Дания) с «питающим слоем» перитонеальных клеток и инкубировали при 37ºС в атмосфере с 5% СО₂. В качестве селективной среды использовали RPMI-1640, содержащую гипоксантин, аминоптерин, тимидин (ГАТ) (Sigma). По истечении 14 суток проводили контроль роста слившихся клеток путем просмотра культур под инвертированным микроскопом.

Определение изотипов МКА проводили в ИФА с использованием набора специфических антисывороток к различным классам мышиных иммуноглобулинов ISO2 (Sigma).

В результате тестирования сывороток крови иммунных мышей было определено, что конъюгат латекс-ХАФ активно стимулирует иммунную систему животных, титры антител при этом составляли 1:3200-1:6400. От линейных мышей были выделены иммунные спленоциты и использованы для гибридизации с миеломными клетками.

Тестирование культуральной жидкости клонов проводили в непрямом варианте ИФА. В качестве антигенов для сенсибилизации лунок планшета были использованы как конъюгаты хлорамфеникола с белковыми носителями (ХАФ-БСА, ХАФ-ОВА) так и чистые препараты носителей (БСА, ОВА). Тестирование показало наличие в культуральной жидкости 3-х гибридом (2D9, 3B11, 4B8) антител, специфичных эпитопам хлорамфеникола. При повторном тестировании стабильность и специфичность сохранили антитела гибридомы 3B11. При дальнейшем тестировании антител установили их высокую активность по отношению к хлорамфениколу в составе белкового конъюгата и отсутствие реакции с белками-носителями.

Гибридомы штамма 3B11 были подвергнуты клонированию методом лимитирующих разведений. В результате клонирования для дальнейшей работы были отобраны субклоны с наибольшей активностью в ИФА (3B11F8, 3B11C6, 3B11G7). Титр антител культуральной жидкости субклонов, при которых еще обнаруживалось связывание антител в ИФА, был в диапазоне 1:64-1:128. Определение изотипа показало, что полученные МКА относятся к классу IgM. Продуктивность штаммов in vitro составила 60-125 мкг/мл.

Таким образом, в результате проведенной работы были получены штаммы гибридом, продуцирующие моноклональные антитела специфичные антигенным эпитопам антибиотика хлорамфеникола. Результаты исследований могут быть использованы при разработке экспресс-методов определения остаточных количеств хлорамфеникола в продуктах животного происхождения.
Список использованной литературы:

1. 
   Ke LI, Liqiang LIU, ChuanLai XU, XiaoGang CHU. Rapid Determination of Chloramphenicol Residues in Aquaculture Tissues by Immunochromatographic /Assay analytical sciences. November 2007, vol. 23, P.1281.
   
2. 
   Mookda Pattarawarapan, Sawitree Nangola, Chatchai Tayapiwatana. Establishment of Competitive ELISA for Detection of Chloramphenicol /Chiang Mai J. Sci. 2006; 33(1) : 85-94.
   
3. 
   Ковалев И.Е., Полевая О.Ю. Биохимические основы иммунитета к низкомолекулярным соединениям. М 1985.
   
4. 
   Oi V., Herzenberg L. Immunoglobulin – producing hybrid cell lines.//Selected methods in cellular immunology.//Ed. By. Mishell B and Shiigi. – San Francisco, 1980, P. 351-352.
   

Исхакова Д. Я.

e-mail: dina.iskhakova@mail.ru

Научный руководитель – к.б.н, доцент, Турпанова Р. М.
Культура клеток растений – область биологии, тесно связанная с практикой. Почти каждый открытый здесь научный факт находит свое отражение в прикладных исследованиях. В отличие от клеток животных практически любая растительная клетка способна в определенных условиях и на соответствующих питательных средах регенерировать полноценные растения (свойство тотипотентности растительных клеток). Решающую роль во вторичном образовании органов (корней или почек) из недифференцированных тканей in vitro играет соотношение фитогормонов (ауксинов и цитокининов) и их концентраций в питательной среде. Изучение процесса экспериментального морфогенеза на всех уровнях организации – от отдельной клетки до верхушки побега – привело к созданию технологии клонального микроразмножения растений, которая уже в большинстве стран, таких как США, Италия, Великобритания, Голландия, Новая Зеландия, Франция перешла на коммерческий уровень [1].

Метод микроклонального размножения играет важную роль для ускоренного клонирования плодовых, ягодных, клубнеплодных, декоративных видов растений и древесных пород. Впервые этот метод применил французский исследователь Ж. Морель в 1960 г. для размножения орхидей (Cymbidium). Из исходного экспланта ему удалось в течение года получить около четырех миллионов новых растений, свободных от вирусной инфекции [ 2].

По своей сути микроклональное размножение аналогично вегетативному типу размножения растений с той лишь разницей, что оно протекает в пробирке в условиях in vitro, где из клеток изолированных тканей в итоге можно получить достаточно большое количество новых растений. Обязательным условием микроклонального размножения является идентичность полученного растительного материала исходному материнскому растению. Еще недавно этот способ рассматривали как возможность ускоренного клонирования вегетативно размножающихся видов растений, а также как вспомогательный метод освобождения растений от вирусов. Однако результаты некоторых исследований показали, что значение этого метода существенно возрастает для клоновой селекции растений (экспериментальный мутагенез и расхимеривание), криосохранения ценного исходного материала, а также ряда других. Способность к образованию больших количеств (несколько миллионов и более) соматических зародышей в условиях in vitro используется для разработки технологии массового и непрерывного получения "искусственных семян". Более того, метод клонального микроразмножения может быть с успехом использован для создания синтетических сортов. К настоящему времени число видов, которые можно клонировать «в пробирке», уже составляет около одной тысячи [3].
Преимуществами данного метода по сравнению с традиционными являются:

· значительно более высокие коэффициенты размножения (можно получить до 100 000-1 000 000 мериклонов в год, тогда как при обычном размножении – 5-100 растений за тот же срок;

· миниатюризация процесса, приводящая к экономии площадей, занятых маточными и размножающимися растениями;

· оздоровление растений от грибных и бактериальных патогенов, вирусов, микоплазменных, вироидных и нематодных инфекций;

· возможность размножения и укоренения растений, размножение которых затруднено обычными способами [4].

Хотя этот метод микроклонального размножения растений является довольно трудоемким и затратным, в ряде случаев на его основе уже стало возможным создавать экономически рентабельные биотехнологии.

В 2011 г. нами совместно с лабораторией генетики и репродукции лесных культур в «Институте общей генетики и цитологии» КН МОН РК в городе Алматы, были начаты первые эксперименты в этом направлении. В качестве объекта для микроклонального размножение in vitro нами была выбрана осина триплоидная (Populus tremula L.).

Осина является одной из уникальных быстрорастущих пород, устойчивых к сердцевинной гнили. Стволы отличаются полнодревеснотью и прямизной, хорошо очищаются от сучьев [5].

Интерес к рабо­те с осиной (Populus tremula L.) вызван главным образом необходимостью сохра­нения ее генофонда, быстрыми сроками поспевания и труд­ностью размножения черенками. Для осины примене­ние клонального микроразмножения является наиболее перспективным способом, так как семена данной породы быстро теряют всхожесть. Введение в культуру осины и ее последующее размножение необходимо с целью получения достаточ­ного количества посадочного материала, который главным образом может использоваться для создания энергетических плантаций, в многочисленных хозяйственных отраслях и для оздоровления лесов, т.е. иметь большое экологическое значение [6].

В экспериментах был использован основной метод клонального микроразмножения растений – это активация развития уже существующих в растении меристем и метод адвентивного побегообразования в первичной и пересадочной каллусной ткани.

В опыте активации развития уже существующих в растении меристем в качестве эксплантов в культуру были введены черенки, содержащие по 2-3 почки. Для нарезки черенков использовали однолетние побеги. Для стерилизации нарезанные черенки помещали в марлевые мешочки и в ламинар-боксе погружали в 0,1%-й раствор сулемы (двухлористая ртуть) на 10 минут. После этого черенки промывали в 3-5 объемах стерильной дистиллированной воды и слегка подсушивали. Затем готовили черенки для введения в культуру. В качестве базовой среды использовали питательную среду Мурасиге-Скуга с разным содержанием регуляторов роста. Процент регенерации триплоидной осины составил 95%. Во всех исследуемых пробирках из апикальных меристем почек формировались побеги, которые в течение одного месяца культивирования достигали высоты 3 см.

Полученные микропобеги в дальнейшем использовали в исследованиях по микроразмножению. Сформировавшиеся микропобеги на первичном экспланте, расчеренковывали и рассаживали в большее количество колб. Из одного микропобега получали 5-9 черенков аккуратно с помощью длинного узкого пинцета помещали в питательную среду МS, содержащую 2ip (1 мг/л) и ИУК (0,5 мг/л). Колбы ставили в световую комнату. Образовавшиеся в колбах пучки побегов делили, извлекали пинцетом побег необходимой длины. Удаляли скальпелем с него листочки и расчеренковывали его, таким образом, чтобы на каждом черенке была хотя бы одна пазушная почка и переносили на свежую питательную среду МS, содержащую 2ip (0,05мг/л) и ИУК (0,01 мг/л). После 3-х пассажей, добавляя в питательную среду ИМК в концентрации 1 мг/л, побеги укореняли in vitro. Укоренение микропобегов – трудоемкий и ответственный этап клонального микроразмножения. На этом этапе мы использовали среду Мурасига и Скуга. В качестве стимулятора корнеобразования использовали ИМК (β-индолил-3-масляную кислоту). Посаженные на среду для укоренения микрочеренки через 1-1,5 месяца превратились в окорененные растеньица. Растения считались полностью сформированными и готовыми к адаптированию к почвенным условиям, когда каждое из них полностью образовывало 4-5 листа и достаточно разросшиеся корни.

Во второй серии экспериментов изучали способность к каллусообразованию эксплантов осины триплоидной на среде Мурасиге и Скугу, содержащие инозит (100 мг/л), тиамин (5 мг/л), пиридоксин (5 мг/л), никотиновую кислоту (1 мг/л), БАП (2 мг/л), ИУК (0,5 мг/л), сахарозу (3%), и агар 0,7%. Визуально появление каллуса отмечали на 20-й день с начала культивирования.

Полученную каллусную ткань субкультивировали каждые 1,5 месяца. В процессе пересадки учитывали интенсивность роста каллусной ткани. Морфогенез в каллусной ткани был отмечен на 45 сутки от момента культивирования. За это время формировалась каллусная ткань плотного типа, в которой отмечалось появление меристематических очагов, из которых в дальнейшем развивались растения-регенеранты.

Растения-регенеранты выращивали в световой комнате в течение 30 суток при 23⁰С, 24-часовом фотопериоде (круглосуточное освещение) и интенсивности освещения 3000 люкс.

В настоящее время мы проводим исследования по реинтродукции этого вида в природные местообитания. Этот этап технологии, связанный с возвращением растений в соответствующую среду обитания, пока до конца не разработан.

Таким образом, размножение ценной здоровой осины как быстрорастущей породы, является задачей первостепенной важности. В связи с этим несомненный интерес представляет поиск в естественных условиях быстрорастущих (гигантских), устойчивых к сердцевинной гнили форм осины.

Принимая во внимание возрастающий интерес и спрос в Республике Казахстан на новые виды декоративных растений и развитием внутреннего и внешнего озеленения площадей городов и поселков, а также необходимостью уменьшения импорта посадочного материала низкого качества, способствующих распространению патогенных организмов, оказывающих отрицательное влияние на экологическую ситуацию региона становится актуальной проблема массового размножения древесных культур.

2. Куликов П.В., Филиппов Е.Г. О методах размножения орхидных умеренной зоны в культуре in vitro // Бюл. Главного ботан. сада. М.: Наука, 1998. С. 125-131.

3. Бутенко Р.Г. Клеточные технологии в сельскохозяйственной науке и практике // Основы сельскохозяйственной биотехнологии. М., 1990. С. 154-235.

4.ШевелухаB.C., Калашникова Е.А. и др. Лабораторно-практические ранятияпо сельскохозяйственной биотехнологии. Методические указания. - 2- изд.-е. Москва, изд.-во МСХА, 2004

5.Катаева Н. В., Бутенко Р. Г. Клональноемикроразмножение растений. — М., 1983

6. Родин А.Р., Калашникова Е.А. Использование методов клеточной и генной инженерии для получения посадочного материала древесных пород. Учебное пособие. М.: МГУЛ, 1993.

УДК 637.001:577.18

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ АНТИБИОТИКОВ В ПРОДУКТАХ ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ

Нурланова А.А.

Научный руководитель: к.м.н. Мукашева Г.К.

Антибиотики тетрациклинового ряда могут попадать в продукты питания в результате неправильного использования их в качестве лечебных средств. Наличие в молоке стрептомицина, пенициллина и др. обусловлено чаще всего использованием для лечения маститов коров препаратов длительного действия на масляной основе. Присутствие немедицинских антибиотиков (гризина и пр.) отмечено при включении в корма в экспериментальных условиях в превышенных количествах этих препаратов. [3]

Экспериментально установленные уровни неблагоприятного действия антибиотиков на организм позволили обосновать величины максимально допустимого суточного поступления их в организм человека с продуктами питания и сделать вывод, что при санитарном контроле продуктов питания остаточные количества антибиотиков в них не должны допускаться при использовании предлагаемых ниже утвержденных методов исследования в пределах их чувствительности (для хлортетрациклина, пенициллина - 0,01, стрептомицина - 0,5, гризина и цинкбацитрина - 0,1 и 0,002 ЕД на г/мл продукта).[1]

Творог, сметану, яйца, содержащие остаточные количества антибиотиков тетрациклинового ряда, пенициллина, следует направлять на изготовление хлебобулочных и кондитерских изделий с расчетом, чтобы соотношение "загрязненных продуктов" с другими компонентами изделий было не меньшим, чем 1:4 (при содержании остаточных количеств антибиотиков до 0,05 ЕД/г), 1:10 и 1:100 - при содержании остаточных количеств антибиотиков до 0,1 ЕД/г и до 1,0 ЕД/г и более, соответственно.[5]

Мясо и субпродукты, содержащие остаточные количества антибиотиков, не следует в необработанном виде реализовывать населению. Такое мясо должно направляться на изготовление мясных, мясо - растительных консервов, за исключением консервов для детского питания, концентратов I и II блюд, вареных и варено - копченых колбас при условии обязательной подсортировки к мясу или компонентам блюд, не содержащих остаточных количеств антибиотиков.[4] каждом конкретном случае вопрос о реализации использовании мяса с наличием остаточных количеств антибиотиков решается представителями Государственного санитарного и ветеринарного надзора с условием, что при подсортировке кратность соотношения "загрязненных" и незагрязненных продуктов должна зависеть от выявленной концентрации антибиотика, с тем, чтобы в конечном итоге содержание остаточного количества антибиотика было ниже уровня чувствительности утвержденных методов исследования. Например, в образцах мышечной ткани от говяжьей туши выявлено содержание хлортетрациклина на уровне 0,2 ЕД/г. Следовательно, чтобы содержание антибиотика в продукте снизилось до менее 0,01 ЕД/г, мясо от этой туши должно быть направлено на приготовление колбас при условии введения в фарш в размере не более 5% к общей массе продукта. [7]

В совхоз должно быть направлено предписание о нарушении инструкций по применению антибиотиков в ветеринарии или при откорме животных, а к руководителю хозяйства приняты административные меры. При реализации продуктов питания, содержащих остаточные количества стрептомицина, гризина, цинкбацитрацина, должен использоваться такой же подход подсортировки к незагрязненному антибиотиками сырью с учетом выявленной концентрации антибиотика и соответствующей кратностью разведения.[8]

Обеспечить полную безопасность продуктов, содержащих остаточные количества антибиотиков, для потребителей может только четкая организация проведения гигиенических мероприятий, строгий контроль за применением антибиотиков в животноводстве и ветеринарии и выявление их в продуктах питания животного происхождения с помощью чувствительных методов. целях систематического контроля в стране за загрязнением продуктов животноводства антибиотиками предлагаются данные "Методические указания по определению остаточных количеств антибиотиков в продуктах животноводства". Наиболее широкое применение как в научных исследованиях, так и в практических учреждениях, нашли микробиологические методы, позволяющие определять минимальные концентрации антибиотиков в исследуемом материале. Они основаны на непосредственном биологическом действии антибиотиков на чувствительные штаммы микроорганизмов и поэтому наиболее специфичны и объективны. Ниже рекомендуются методы определения некоторых антибиотиков:

а) тетрациклиновой группы - в молоке, молочных продуктах, яйцах, мясе, мясных продуктах, в т.ч. мясе и субпродуктах птицы;

б) стрептомицина - в молоке и молочных продуктах, яйцах;

в) пенициллина - в молоке и молочных продуктах;

г) гризина - в мясе;

д) цинкбацитрацина - в мясе.[3]

Содержание антибиотиков выявляют микробиологическим методом диффузии в агар по величине торможения роста следующих тест - культур, внесенных в питательные среды: для тетрациклиновых антибиотиков - Bac. cereus АТСС 1177 (чувствительность - 0,01 ЕД/г/мл);

для стрепомицина - Bac. mycoidis 537 (чувст. 0,5 ЕД/г/мл);

-для пинициллина - S. lutea АТСС 9341 (чувст. 0,01 ЕД/г/мл);

-для гризина - Bac. cubtilis АТСС 6633 (чувст. 0,5 ЕД/г/мл);

-для цинкбацитрацина - M. flavus АТСС 10240 (чувст. 0,02 ЕД/г/мл).[4]

Молоко рекомендуется исследовать на присутствие остаточных количеств антибиотиков в том случае, когда при предварительном исследовании в нем обнаружены ингибирующие вещества и исключено наличие химических веществ.

Базовым принципом для количественного определения антибиотиков тетрациклиновой группы в пищевых продуктах является твердофазный конкурентный иммуноферментный анализ на полистироловых планшетах. Метод основан на конкуренции свободного антибиотика из исследуемых образцов и антибиотика, предварительно адсорбированного на твердой фазе (лунке планшета) в составе белкового конъюгата, за центры связывания специфичных к тетрациклинам антител во вносимом растворе. [1] После отделения не связавшихся реагентов количество антител, прореагировавших с иммобилизованным антигеном, определяют помощью вторичных антивидовых антител, меченных пероксидазой хрена. Количество связавшегося с антителами конъюгата вторичных антител определяют с помощью субстрат-хромогенной смеси.[6] При этом количество определяемого антибиотика, содержащегося в исследуемом образце, обратно пропорционально регистрируемой оптической плотности продукта ферментативной реакци.