ПӘннің ОҚУ-Әдістемелік кешені өсімдіктер биотехнологиясы 5В070100



жүктеу 1.94 Mb.
бет1/10
Дата17.06.2016
өлшемі1.94 Mb.
  1   2   3   4   5   6   7   8   9   10

ҚАЗАҚСТАН РЕСПУБЛИКАСЫНЫҢ БІЛІМ ЖӘНЕ ҒЫЛЫМ МИНИСТРЛІГІ

СЕМЕЙ қаласының ШӘКӘРІМ атындағы МЕМЛЕКЕТТІК УНИВЕРСИТЕТІ



3 деңгейлі СМЖ құжат

ПОӘК

042-18-22.1.113/02-2014

ПОӘК

Пәннің оқу-әдістемелік материалы



№2 басылым 11.09.2014




ПӘННІҢ ОҚУ-ӘДІСТЕМЕЛІК КЕШЕНІ
Өсімдіктер биотехнологиясы
5В070100«Биотехнология» мамандығы үшін
ОҚУ-ӘДІСТЕМЕЛІК МАТЕРИАЛДАР

Семей


2015

МАЗМҰНЫ:


1 Глоссарий
2 Дәрістер

3 Тәжірибелік сабақтар

4 Курс жұмысы (жоба)

5 Суденттің өздік жұмысы



  1. ГЛОССАРИЙ



  1. ДӘРІСТЕР


Дәріс 1. Кіріспе. Өсімдіктер биотехнологиясы ғылымы. Мақсаты мен міндеттері. Өсімдіктер биотехнологиясы ғылымының басқа ғылымдармен байланысы. Өсімдік жасушаларын өсірудің қысқаша тарихы. Терминдер.

Биотехнология - ғыльш мен өндірістің жата саласы. Биотехно-логия уғымыньщ дәл мәнісі - биологаялык технология немесе «биология + технология». Баскаша айтканда, биотехнология дегеніміз, биологиялык объектілер мен биологиялык процестердін негізінде тубегейлі жана технологиялар күру, сол аркылы адамға кажетті өнімдерді алу.Осы айтылған кандай объектілер, процестер, өнімдер? Биоло-гиялык объектілерге сан алуан организмдер, олардын әр турлі мушелері мен улпалары, әсіресе клеткалары және протопластары, солардын курамындағы органоидтар, хромосомалар, тіпті жекеленген геңдер де жатады. Ал, биологиялык процестерге келер болсак, олардын тіршілік үшін ен маныздылары - өніп-өсу, даму, көбею, зат пен энергия алмасу, информация кабылдау, сактау, пайдалану және стрестік, колайсыз факторларға бейімделу больш табылады. Биотехнологиялык жолмен алынатын өнімдерге көптеген дәрі-дәрмектер, белоктар мен ферменттік препаратар, кулпырған табиғи бояулар, хош иісті заттар, витаминдёр және тағы баска да биологиялык активті косындылар кіреді.Биотехнологиялык әдістердің көмегімен селекция процесін жургізуде ежелден колданылып келе жатқан тәсілдерді (будандастыру, мутагенез, сурыптау т.б.) едәуір женілдетуге, тездетуге болады. Бүл бір дейік. Екіншіден, керемет зор нәтижелерге кол жеткізетін мүмкіндіктер тууына жол ашылды. Булар биоинженерия (клеткалык инженерия, гендік инженерия) лринциптері негізінде бурьшды-сонды дуниеде болмаған, туп-тукияннан калыптаскан касиеттерді тіпті киялға симастай етіп өзгертіп, жана организмдерді конструкциялау, «жасап шығару». Өсімдік клеткаларын өсірудің кыскаша тарихы Өсімдік клеткаларын өсіру деген термин сонғы кезде кен мағыналы үғымға айналып кетті. Бүл үғым барлык іп уігхо жағдайында өсірілетін объектілерді, атап айтканда, клеткалар мен протопластарды, улпаларды, жеке мүшелерді, үрыктарды және бүтін регенерант өсімдіктерді камтиды. Іп уітго деген термин клеткалар жасанды ортада асептикалык жағдайда өсірілетінін белгілейді. Іп \іүо деген термин тіршілік әрекетіне тән процестерді организмде өтетінін көрсетеді. Регенерант өсімдік деген термин іп уііго жағдайында пайда болған бутін өсімдікті белгілейді. Өсімдіктен бөлініп алынған клеткаларды, үлпаларды, мүшелерді жасанды коректік ортада тек кана залалсыздандырылған (асептикалык) жағдайда өсіруге болады. Өсімдіктің бөлігін, оны эксплант деп атайды, коректік ортасы бар Петри табакшасына, немесе пробиркаға, колбаға салады. Біраз уакыт өткен сон, экспланттың күрамындағы кейбір клеткалар бөліне бастайды. Сонын нәтижесінде жана клеткалар саны көбейеді, үлғая келіп каллус ұлнасы пайда болады. Каллус деген үлпанын ерекше түрі, клеткалардын ретсіз бөліну нәтижесінде пайда болады. Каллустын бөлшектерін октын-октын жана коректік ортаға көшіріп отырса, ол шексіз үзак уакыт осе береді.Істелетін тәжірибенін максатына карай: 1) тек каллустын озін ғана озгеріссіз сол үлпа түрінде осіруге болады; 2) немесе морфоге-нез процестері отуіне керекті жағдай туғызып, сол каллустан бутін регенерант осімдікті ондіріп шығаруға болады. Ол үшін лайыкты коректік орта мен ерекше осіру жағдайын іріктеп табу кажет.Теория түрғысынан алып карағанда, кай осімдіктін кандай да болса клеткасынын нақтылы бір жағдайда осіп, дамуы аркылы бүтін осімдікке айналуына кабілеті бар. Бүл тотипотенттік касиет дел аталады (1-сурет). Тотинотенттік касиет - жасанды жағдайда (іп уііго) клетканың өзіне тән генетикалык информациясын толығымен жүзеге асыруы, сонын аркасыңца дифференциялану процесін және түтас организмнін дамуын (регенерацияны) камтамасыз етуі. Табиғи жағдайда (іп уіуо) осімдіктер мен жануарлардың үрыктанған жүмыртка клеткалары ғана әмбебап тотипотенттілікке кабілетті болады. Ал, жалпы, сомалык клетка-ларды алар болсак, тотипотенттік тек осімдік клеткаларына тән касиет, кобінесе іп ұііго жағдайында байкалады. Жануарлар клеткаларында мүндай кабілет мүлдем болмайды. ХІХ-шы ғасырдың аяғында осімдіктердің бөлпіектері мен жеке - дара мүшелерін алғашкы осіре бастаған неміс ғалымдары еді. Мысалы, К. Рехингер және X. Фехтинг бүршіктерді, тамырлар мен сабактардың кесінділерін дымкыл күмда осіруге тырысты. Кейбір тәжірибелерде клеткалар бөліну аркылы каллустар пайда болған. Бірак каллустардын коректенуі камтамасыз етілмеген сон олар әрі карай есе алмаған, кейін шіріп кеткен. Дегенмен, бүл тәжірибелерді сәтсіз деп есептеуге болмас. Керісінше, ғылымның дамуы үшін олардын маңызы оте зор. Басты нәтиже - «клетканы организмнен тыс осіру» деген ой-киял туды. Бүл киял кейінгі зерттеушілер үшін үшкыр арманға, нактылы максатка айналды, мындаған тәжірибелерге түрткі болды.Клеткаларды осірудің негіздерін бірінші болып 1902 жылы анык кисынға келтірген Г. Габерландт еді. Ол біркатар жабык түкымды өсімдіктердін жапырағынан боліп алынған паренхима клеткаларымен тәжірибе ісТеді. Коректік орта ретінде органика-лык. заттар (сахароза, аспарагин, пептон) косылған минералды түздардан түратын Кноп ерітіндісін пайдаланды. Г. Габерландт өсімдіктін әрбір тірі клеткасы тотипотентті болады деген гипотезаны үсынды. Оны дәлелдеу үшін жеке клеткадан ұлпа өсіріп,*бдан осімдік шығаруға тырыста. Дегенмен өзінін даналык болжамын тәжірибе аркылы дәлелдей алмады. Өйткені ол жұмыс істеген объектілер тәжірибе жасауға жарамсыз еді. Атап айтканда, активті бөліну касиетінен айырылған және эмбриональды әсу жағдайын жоғалткан маманданған кәрі клеткаларды алып еді. Сөйтіп, Ф. Уайт пен Р. Готренің жана әдістін калыптасуына коскан улестері орасан зор. Осы кезден бастап бұл әдіс өсімдіктердін экспериментальды биологиясынын жана бағыты ретінде каркынды дами бастады. Одан бері көптеген коректік орталардын курамы жете зерттеліп дайындалды, макроэлементтер мен микроэлементтердін, витаминдердін және өсімдіктерден алынған өсу процесінін стимуляторларының (мысалы, кокос жанғағынын, каштанның, жугерінің пісіп жетілмеген эндоспермдері, ашыткы гидролизаты т.с.с.) манызы зерттелді. Әсіресе бөліну процесіне кокос жаңғағынын пісіп жетілмеген эндоспермі - суті тиімді болды. Осындай курделі органикалык коспаларсыз клеткалар бөлінбеген. Бұл тәжірибелер «клеткалардын бөлінуін реттейтін заттар» бар болуы ыктимал деген ой салды.

Американдык ғалым Ф. Скуг кұрамында минералды тұздар, көмірсулар, витаминдер бар коректік ортада темекі сабағынын кесінділерінін осуін зерттеді. Ол коректік ортанын күрамына табиғи косынды кокос сүтінін орнына экзогендік фитогормон-дарды енгізді. Онын істеген тәжірибелерінде кейде каллус пайда болуы, ал кейбір жағдайда бүршіктердін калыптасуы байкалды. Коректік ортаға ауксин косылғанда каллус түзілген де, бүршік-тердін пайда болуы және осуі тежелген. Ал адениңді косканда, керісінше, бүршіктер пайда болған, яғни аденин ауксинның тежеуші әсерін бәсеңдетеді. Зерттеушілерге бүл тәжірибелер кокос сүтіндегі өсу факторынын күрамында пуриндік заттардың болуы мүмкін деген ой салады. Себебі аденин нуклеин кышкылдарынын күрамына кіретін пуриндік негіз. Сондыктан олар ен алдымен нуклеин кышкылдарының әсерін талдауға кіріседі. Сонда сельдь балығынын спермасынан болініп алынған ДНҚ коректік ортаға косылса, ол темекі клеткаларынын тез бөлінуіне әсер ететіні аныкталды. Мүндай нәтижені үзак сакталған ескі ДНҚ препараты көрсетті. Шамасы, өсу факторы ДНҚ молекуласынын ыдырау кезінде пайда болғаны.

Ф. Скуг әріптестерімен бірге ашыткыдан физиологиялык \ активті зат боліп алды. Ол зат ауксиннін катысымен темекі саба-ғының езекті паренхимасы клеткаларының тез бөлінуінін, каллус үлпасынын тузілуін және онда бүршіктердін дамуын камтамасыз. Клетка болінуін үдететін осы затты олар кинетиндеп атады. К{інетин озінін химиялык күрылысы жағынан аденинге оте жакын, ол да пуриндік негіз болып есептеледі. Осылар сиякты физиологиялык әрекетшіл заттар тобына цитокиниңдер деген ат 5ерілді- Осы ғылыми жаналыкты ашу аркасында Т. Мурасиге мен Ф- Скуг 1962 жылы өздерінің атакты коректік ортасын дайындады. Бүл орта осімдіктердің көп түрлерінін алуан үлпаларын және мүшелерін осіруге колайлы болып шыкты, казіргі уакытта кен колданылады.

Осы зерттеулер нәтижесіңде есімдіктердің клеткаларының осуі мен дамуы үшін ауксин мен цитокининнің манызы зор екендігі көрсетілді және осімдік клеткасы физиологиясынын бүл бағыты тез дами бастады. Сойтіп, клеткалары іп уігго жағдайында өсірілетін өсімдіктердін түрлерінін саны кебейе берді. Дегенмен, кандай да болмасын өсімдік түрін іп уііго өсіре бастағанда, оның өзі түрмак, тіпті сол бір өсімдіктін әрбір мүшелері мен үлпалары әр түрлі коректік ортаны кажет ететіндігін ескеру керек. Сондыктан, тәжірибе аркылы күрамы іріктеліп алынған коректік орталардын саны әте кеп және бүл жүмыс одан әрі жалғасып келе жатыр.

Өсімдіктер клеткаларын өсіру әдістерін толык жетілдіру бағытында кол жеткен күнды жетістіктердің бірі - жеке клеткаларды өсіру болды. Соның негізінде клеткалык суспензияны алу және өсіру әдістері мүкият зерттелуде. Клеткалар суспензиясы - бүл жеке клеткаларды немесе клеткалардың кішігірім топтарын сүйык ортада арнаулы аппараттарды колдана отырып, олардын аэрациясын және араластыруын камтамасыз етіп өсіру. Осындай әдіспен әсірілген жалғыз клеткадан түтас өсімдікті өндіріп шығаруға мумкіндік туды. Яғни, өсімдік клеткасынын тотшютенттік касиеті туралы Г. Габерландтын айтылған ойы, осы әдіске суйене отырып 1960-шы жылдары ғана жүзеге асты. Әсіресе, 1958 жылы сәбіздін бір клеткасынан бутін өсімдік өсіріп шьіғарған Ф.Стюардтын әріптестерімен бірге откізген тәжірибелерін ерекше айтып, ескеру керек. Клеткаларды өсіру әдісінің келесі елеулі кезеңі, ағылшын Ғалымы Э. Кокинг жүмыстарымен байланысты. Ол 1961 жылы томат тамыр клеткаларынын кабыкшаларын бірінші болып Ферментативті гидролизбен ыдыратып, протопластарды болді.
Дәріс 2. Өсімдік жасушаларын жасанды қоректік ортада өсіру әдістері. Қоректік орталар. Каллус алу. Каллусты өсіру. Жасушаларды сұйық қоректік орталарда өсіру

Өсімдіктен эксплантты бөліп алуды және оны коректік ортаға отырғызуды ламинар боксінде өткізеді. Бүл бокстің ішіне фильтрден өткізіліп, микроорганизмдерден тазартылған ауа беріліп тұрады. Әр түрлі тәсілмен залалсыздандырылған және дистилденген суда бірнеше мәрте жуылған объектілерден керекті улпалар бөлініп алынады. Оларды стерильденген катты немесе сүйык ортаға отырғызады. Стерильдеу үшін автоклавты колда-нады. Сөйтіп, өсімдіктердің әр түрлі үлпалары мен мүшелерін өсіруге болады. Олардьі ойдағыдай осіру үшін ең алдымен колайлы коректік орта керек/ Өсімдіктің әрбір түрі, тіпті сол бір түрінің кез келген мүшелері мен үлпалары жаксы өсу үшін белгілі коректік ортаны талап етеді. Онын үстіне, каллус пайда болу үшін, онын осуі үшін және каллуста морфогенез процесінің жүруіне түрткі жасау үшін коректік ортанын күрамы әр жолы взгеше болуы керек) Соған байланысты, әр ғалым озі зерттейтін объектісіне колайлы коректік ортаны мүкият талдап дайындауға тьірысады. Сондыктан, әр түрлі максатка бейімделген коректік °рта рецептерінін саны жылдан жылға көбеюде. Коректік орталар Коректік ортанын күрамына минералды түздар, көмірсулар, Ватаминдер, фитогормоңдар, амин кышкылдары кіреді. Клеткалар 111 ^ітго жағдайында комірсутегіне мүктаж, себебі олар гетеротрофты коректенеді. Көмірсутегі ретінде сахароза немесе глюкоза косылады.



X Барлык коректік орталардың негізі болатын минералды тұздардын коспасы. Ол клеткаларды макро- және микроэлемент-термен камтамасыз етеді./Азот коректік ортаға нитрат немесе аммоний түрінде косылады, фосфор - фосфат түрінде, күкірт - , сульфат түрінде, темір - хелат немесе әр түрлі түздар түрінде ко-сылады. Сонымен катар, коректік орта күрамына калий, кальций, магний иондары, бірсыпыра элементтер: В, Мп, 3, 2п, Си, Мо, Со кіреді.

Көптеген орталардың күрамында витаминдер бар. Олардың ішінде ен маңыздылары В тобына жатады: В,-тиамин, В2-рибофлавин, В6- пиридоксин. Көп клеткалар сонымен катар нйкотин, фолий, пантетон кышкылдарын, мезо-инозитты кажет етеді. Клеткалардың өзінде витаминдер түзіледі, бірак аз мөлшерде. Сондыктан*|коректік ортаға косылған витаминдер метаболизм реакцияларынын тежелмей өтуіне ыкпалын тигізіп, клеткалардын өсуіне әсер етеді.( Барлык физиологиялык процестерді реттейтін фитогормондар , болғандыктан, олар коректік ортаның маңызды компоненттері. I Клеткаларға бөліну және дифференциялану үшін әсіресе ауксин мен цитокинин кажетГТек кана ісік клеткалары мен «калып-таскан» үлпалар гормондары жок ортада өсе алады. «Калыптаскан» каллус клеткалары гормондарды кажет етпейді, блар гормондарға прототрофты келеді, себебі өздерін-өздері камтамасыз ете алады. (Алғашкы каллусты шығару үшін және оны өсіру үшін мына ауксиндер пайдаланылады; |}-индолилсірке кышкылы (ИСК),



р-нафтилсірке кышкылы (НСК), 2,4-дихлорфеноксисірке і кышкылы (2,4-Д). Ауксиннщ табиғи түрі ИСК клеткаларда онай тотыксызданады. Сондыктан оны ортаға көп мөлшерде косады, немесе көбінесе жасанды түрлерінде (НСҚ, 2,4-Д) косадьц Алғаш-кы каллус алу үшін әдетте ауксинның концентрациясьгжоғары болу кажет. Кейін каллусты өсіру ушін ортадағы ауксин мөлшерін төмендетеді. Кинетин (6-фурфуриламинопурин) клеткалардын бөлінуіне өте кажет, міндетті түрде коректік ортаға кіретін компо-нент болып есептеледі. Сондай-ак, активтілігі жоғары цитокинин-1 дер катарына БАП (6-бензиламинопурин) жатады. БАП кен I пайдаланылады, көптеген коректік ортанын күрамына кіреді.Қоректік ортаны тандау өсімдіктін түріне және эксперименттің максатына байланысты. Әдебиетте керек информация табылмаған күнде, тәжірибені әдетінше кен колданылатын, атап айтканда Мурасиге мен Скугтың, Шенк-Хильдебрандтын, Гамборгтын В5, Уайттың, Хеллердің, Линсмайер-Скугтын коректік орталарын пайдаланады. Одан кейін гормондар мен органикалык косым-шалардын концентрациясын іріктеп ала бастайды. Бірінші кестеде атап кеткен коректік орталардын күрамы келтірілген. Бүл орталар даражарнакты және косжарнакты өсімдіктердің әр алуан түрлерін іп уігго жағдайында өсіруге жарамды больш табылды. Казіргі уакытта кейбір фирмалар Мурасиге - Скугтың, Уайт, Хеллер орталарын (ішінде фитогормондар, сахароза және агардан баскалардъш бәрі бар) күрғак үнтак түрінде шығарады. Дегенмен, мұндай дайын орталар тек коректік ортанын күрамы өзгер-тілмейтін тәжірибелерде пайдаланылады. Әдетінше, ғалымдар жана объектімен жүмыс істей бастағанда, олар стандартты коректік орталардын күрамын өзгертеді. Әсіресе органикалык компоненттердің жиынтығы мен концентрациясы жиі өзгертіледі; Қоректік ортанын күрамы өсімдікке үйлесімді болу ушін, оны іріктегенде математикалык жоспарлау әдісін колдану орынды. Математикалык жоспарлау әдісі бір мезгілде ортадағы көп факторлардың әсерін зерттеуге мумкіншілік береді. Аталған әдіс әрбір жеке фактордын әсерін сан түрғысынан аныктаумен катар, бірнеше факторлар арасындағы әрекеттестіктің барын белгілеп, онын ыкпалын бағалауға мүмкіншілік береді. Сөйтіп, математикалык жоспарлау әдісі коректік ортаның кайсы компоненттері клеткаларға жаксы әсер ететінін және сол факторлардын ең колайлы ара катысын белгілеп береді. Клеткаларды өсіруге кажетті жағдайлар.Өеімдіктің клеткалары, үлпалары, мүшелері өсуіне коректік ортадан баска да жағдайлар әсер етеді.Өкінішке орай, олардын іп уііго жағдайында өсетін клеткаларға тигізетін ыкпалы аз тсксерілген, бүл түрғыда арнайы зерттеулер кажет болып түр. Қопшілік макүлдаған түсінік бойынша, клеткаларды өсіру үшін 25±2°С шамасында температура кажет. Бірак бүл дағдылы болып ксткеи көжарастың себебі - нактылы деректердінжетіспеушілігі. Мысалы, темекі клеткаларына ен колайлы температура 32°С, адыраспан клеткаларына 30°С, шырмауык гүлдін суспензиясына 3()г32с'С. Температура негізгіжәне косымша метаболизмнін про-цсстеріпе әсер етеді. Сірә, зерттеу жүмысынын максатына карай, орбір осімлікке колайлы температура әдейі істелген тәжірибелер ікпижесіне суйеніп тандалып алынуы керек. Бірак мүндай тә-жірибелерді откізуге көп енбек және үзакуакыт керек. Сондыктан, (сртіеушілер клеткаларды кобінесе 25°С температурада осіре берсді.Кілеткалардын осуіне әсер ететін сырткы факторлардын бірі -жарьік. Жалпы, іп уііго өсірілетін өсімдік клеткаларында жасыл мент хлорофилл түзілмейді. Сондыктан олар әдеттегідей'һототрофтык (автотрофтык) жолмен емес, гетеротрофты коректенеді. Дегенмен, кейбір жағдайларда клеткалар өзіне тән табиғигһототрофты коректене алады. Әзірше осындай күбылыс осімдікрдіН 16 түрінде ғана байкалған. Баска каллустардын түсі акшыл,кейде сарғыш келеді, Хлорофилл түзетін кабілеті жок болғанльіктан ондай клеткалар каранғыда немесе ала коленкеде осіріледі.Дүндай хлорофилі жок үлпаларға жарык сәулелері оз ыкпалын,шамасы, фитохром аркылы тигізеді. Клеткаларда косымша заттар тузілуіне жарыктын сапасы (спектрлік күрамы), каркындылығы және фотопериодтын әсер ететіндігі дәлелденген^-Сондыктан,клеткалык технологияны жасаудағы басты максаттын бірі -клеткаларды осіру үшін кажетті жарыктын сапасы менкаркындылығын аныктау.Клеткалардын осуіне аэрацияның әсері зор. Аэрация болмаса, жалпы алғанда, суспензиянын өсуі мүмкін емес. Алайда газ компоненттерінің (оттегі, азот, коміртегі диоксиді) клеткаларға тигізетін әсері жете зерттелмеген. Клеткаларды осіргенде коректік ортанын осмос кысымын да ескеру керек. Жоғары осмос кысымы коректік заттарды клеткалардын сініруін киындатады. Ортаның осмос кысымын калыпты күйде сактау, әсіресе протопластарды бөліп алғанда және оларды осіргенде өте манызды. Осмос қысы-мын реттейтін заттын (полиэтиленгликоль, сорбит т.с.с.) концен-трациясы осімдіктердін түріне және физиологиялык күйіне байланысты жеке іріктеліп алынады.

Каллусты алу және оны өсіру

Клеткалардын ретсіз бөлінуі нәтижесінде пайда болған үлпаны ^аллус деп атайды. Клеткалардын бөліну аркылы көбейіп өсуін пролиферация дейді. Каллус - үлпаның ерекше түрі, бүтін өсімдіктің закымданған жері (жарасы) біте бастаған кезде түзілетін "ілеуленген бүлтык. Ол закым болған жерді әр түрлі инфекциядан КоРҒайды. Каллус үлпасында коректік заттар жиналып, арнаулы °рғаныш кабат пайда болады немесе жойылған мүше кайта пайда °ЛаДы, яғни регенерация процесі өтеді. каллусты алуға көбінесе өскіндердің үлпалары мен жағдаиында маманданған (дифференцияланған), бөлшу кабшеті мүшелерін пайдаланады. Каллустың түзілуі алынған экспланттын тежелгенклеткаларкаитаданбөлщебастаиды,яғңимеристемалы| физиологиялык полярлығына да байланысты болады. Мысалы, күише оралады. Мамандыш белпленген дифференцияланғаіі эксллант ретінде алынған сабак кесінділерінде каллус тезірек онын клеткаларда пролиферация (бөлшу аркылы көбею) кабшетінЛ төмен, тамырға караған базаль жағында түзіледі. Соны ескере каита паида болуы дедифференциялану процесі деп аталады. АлЯ отырып, бүндай эксплантты аударып, бас жағын коректік ортаға дифференциялану деген даму процесшде біртекті меристемалыЯ кір, ізіп ОТырғызады. Сонда коректік ортанын бетінде эксплантты клеткаларданморфологияльщкүрыльшыжәнеаткаратынкьізмеЯ базаль жағы орналасады да каллустын пайда болуына женілдік (функциясы) әр түрлі маманданған клеткалардын түзілуьі пы.

Мысалы, дифференциялану нәтижесінде меристемадан пайді каллустарды Петри табакшаларында, пробиркаларда, колба-болған маманданған клеткалар (мезофилл, эпидермис т.с.с.) со4| флакондарда өсіреді үш.төрт апта өскен сон калЛуСТЫ

шығарып алып, майда кесектерге бөліп, жана коректік ортаға 2 4 Кдеткаларды сүйык коректік ортада өсіру көшіреді. Мұны пассаж деп атайды. Өйткені, ескі коректік ортанын нәрі азаяды, каллустын ішкі жағындағы клеткалардың сұйык ортада өсірілетін клеткаларды клеткалар суспензиясы коректенуі және ауамен камтамасыз етілуі нашарлайды. Сұйык орта ішінде клеткалар батпай, жүзген күйде кошіріп отырғызатын коректік ортанын күрамы, колданады. Мысальі, «үлпа-ене», «бағушы» деген тәсіл. Жаксы барлык клеткаларға біркелкі әсер ететін жағдай туғызу өсіп жаткан каллустын ыкпал етуін екінші бір каллусты осіру суСГіеНзиялык өсіру әдісімен жүзеге асырылады. Бүл әдістін тағы үшш пайдаланады. Ол үшін нашар өскен, немесе өсу кабшеті пайдалы жері -клеткалар өздері беліп шығаратын зиянды мүлдем төмен каллусты жаксы өсетін каллустын үстіне салады метаболиттерден онай арылады және де әр түрлі факторлардыңда, олардың екі арасына коректік ортаға алдын ала малынып бүл ютеткалардың зат алмасу мен осу процестеріне тигізетін әсерін

алынған сүзгіш кағазды кояды. Кейде бір ьщыстың ішінде әр бакылап отьіру женілденеді. Суспензияда өсетін клеткалар түрлі өсімдіктердің клеткаларын катар өсіреді. Анда-санда биохимия және молекулалык биология түрғысынан зерттеулер үлпаларды бір-біріне теледі. Сейтіп, каркынды оскен каллустан ЖүРгізуге колайлы келеді. Суспензиядан оз ерекшеліктері бар

бөлініп шығатын активті әлдекандай заттар баска каллустын ТүРакты клеткалык популяция алуға болады. өсуіне жағымды ыкпалын тигізеді.;

Сонымен, барлык өсімдіктердің жасанды коректік ортада Клеткалар суспензиясын алу өсірілетін клеткалары, кебінесе каллус клеткалары болып келеді.ЖоғаРыда сипатталған айла-әрекеттер есімдіктін кез келген, Әдетте, клеткалар суспензиясын алу үшін каллус үлпасы кандай да болмасын тірі клеткасын үзак мерзім осіруге пайдаланылады. Кейде эксплантгын өзін сүйык ортаға салып өсіру мүмкіншілік береді. Каллус клеткаларында морфогенездінәртүрлі арКЫлы да клеткалык суспензия алуға болады мысалы,

процестеРі өтуі мүмкін. Олардың сомалык эмбриогенез немесе тозаңкаптардан. Өсу кезінде экспланттын сыртында түзілген органогенез жолдарымен даму кабілеті бар. Ол үшін коректік I каллус клеткалары узіліп түсіп сүйык ортаға шығады да, олардан ортанын күрамын озгертіп, каллус үлпасын белгілі бір даму суспензия пайда болады. Бірак бүл үзак және тиімсіз процесс.. Соның аркасында жеке-дара клеткадан Каллустан жеке клеткаларды ферменттік мацерациямен ьщыратып бүтін регенерант осімдік өндіріп шығаруға болады. Бүлі һөлш алуға да болады. Тек кана, мүндай жағдайда клеткалар регенерация процесі өсімдік клеткасының бірегей касиетш зақымдануы мүмкін сондыктан, үзак уакыт тіршілік етеді. Борпылдак каллусты өсіргенде коректік ортаға А Косады, ал цитокининнің мелшерін азайтады немесе оны

тіпті коспайды. Тағы бір шарт - коректік ортада кальций ионы I болмауы ксрек, себебі ол кальций пектинатынын түзілуіне әсер ] етеді. Кальций пектинаты клеткаларды өзара байланыстырып 1 түратын негізгі зат. Одан кұтылу үшін каллуска пектиназа I ферментімен әсер ету керек.

Борпылдак каллусты сүйык ортада жиі шайкап, араластырғандаі ол жеке клеткаларға ыдырайды және кішігірім клеткалықі агрегаттарға бөліне бастайды. Бөлінбей калған тығыз каллустыңі калдыктарын және ірі агрегаттарды 1 -2 кабат дәке немесе нейлон I аркылы сүзіп алып тастайды. Немесе суспензияны бірнеше минуті козғалтпай койып, оны түндырып, устіңгі жағында батпай калғані жеке клеткалар мен майда клетка топтарын бөлек күйып алады. Суспензиянын үстінгі жағындағы женіл фракциясын жаңа ортаға жиі-жиі көшіріп өсірсе, жеке клеткалардың саны көбейеді. Оған коректік ортанын күрамы, аэрация және араластыру әдістері де әсер етеді. Бірак канша күш салғанмен, тек біркелкі жеке клеткалардан түратын суспензияны алу мүмкін емес. Ең жаксы деген суспензияда жеке клеткалар үлесі 50-60%-тен аспайды, калғаны 2-10 клеткадан түратын, тіпті одан да көп клеткалар топтасқан агрегаттар болады. Өте ірі агрегаттардын сырткы кабатындағы клеткалары мен ішкі жағында орналаскан клеткаларының коректену және аэрация жағдайлары өзгеше болатындығын ескерген жөн.

Жеке клеткалары көп, яғни жаксы дисперленген суспензияны алу максатьшен көбінесе коректік ортаның күрамын бакылауға I тырысады. Бар мәліметтер бойынша, ауксиндер клеткалардын I бір бірімен жабыспауына, жеке-дара болуына (диссоциация- I лануына) дүрыс әсер етеді, ал цитикининдер, керісінше, ол ! процесті тежейді. Демек, клеткалардын созылып өсуіне колайлы і және олардын бөлінуін тежейтін жағдайлар суспензиядағы клеткалар топтарыньщ барынша бөлшектеніп, майдалануына мүмкіндік туғызады. Коректік ортадағы көмірсулар клетканын сырткы кабығындағы полисахаридтердін күрамын өзгерту аркылы клеткааралык байланыстарға әсер етуі мүмкін. Мысалы, коректік ортаға галактоза, рафиноза немесе сахароза косылғаңца раушангүл суспензиясындағы клеткалар онай топтасып, өте ірі агрегаттар 1 күрған. Клетка кабығындағы целлюлозаны ыдырататын I ферменттер (целлюлаза, мацерозим) осмотикпен бірге косылып әсер еткенде суспензиядағы клеткалардын диссоциациялануы арта түееді. Мүлде жеке клеткалардан түратын суспензияны өсіру каншама тартымды да, кызығарлыктай болса да, бүл максатка жету биология түрғысынан алып карағанда өсімдік клеткалары үшін тіпті мүмкін емес. Себебі, тек жеке клеткалардан түратын суспензия алу үшін клеткалар бөліне сала бір-бірінен тез ажырап кетуі кажет. Бірак бүл өсімдік клеткасына тән касиет емес, сондыктан оны жасанды жағдайда іске асыру киынға соғады. $Каксы суспензияда морфология жағынан біркелкі, шағын көлемді «леткалар үсак агрегаттарға бірігіп топтасады (шамамен Ю клеткалы топтар). Каркынды өсуді камтамасыз ету үшін суспензияда клеткалардын тығыздығы бір миллилитр ортада 105-ІО6 клетка болуы кажет.

Сүйык ортада өскен клеткаларды, алғашкы каллуска карағанда, жиірек жана коректік ортаға көшіреді. Жана коректік ортаға көшіретін суспензиянын бөлігін инокулюм деп атайды. Оны стерильденген пипеткалармен, шприцтермен немесе, жоғарыда айтылғандай, суспензияны түндырып, онын үстінгі жағындағы батпай калған клеткаларды іркіп күйып алады.

  1   2   3   4   5   6   7   8   9   10


©dereksiz.org 2016
әкімшілігінің қараңыз

    Басты бет