ПӘннің ОҚУ-Әдістемелік кешені өсімдіктер биотехнологиясы 6М0607 00

Тозаншамен салыстырғанда үрык калтасы морфология және физиология жағынан едәуір күрделі күрылым. Соңцыктан аналык гаметофиттен гаплоидтык өсімдіктердің шығуында өз ерекшеліктері бар. Гаплоидтык өсімдіктер аналык гаметофиттін іп ұііго аномальды дамуының нәтижесінде пайда болады. Онын екі жолы бар: эмбриоидогенез және каллустағы органогенез. Айта кету жөн, эмбриоидогенез жолы каллусогенезден гөрі тиімдірек.Түйін мен түкым бүршігінде пайда болған әлдекандай жағдайдын аркасында үрык қапшығында генетикалык белгіленген даму жолы бүзылады. Сонын нәтижесінде кейбір клеткалар лифференцировканын түйығынан шығып, жанадан дамып, аяғында апомиксистік үрыкты түзеді. Бүл үрыктардын күидылығы, олар тек аналық белгілерін сактап түкым куалайды. Табиғи апомиксис және іп уііго жағдайында үрыктанбаған түйіндер мен түкым бүршіктерін өсіргенде, жоғарыда атаған процестері шамасы үксас отеді.

Гаплоидтык эмбриоидтар мен каллустар үрык капшығынын жалғыз немесе бірнеше клеткаларынан тузілуі мүмкін. Үрык капшығының клеткаларынан эмбриоидтардын пайда болуы арпада, күріште, бидайда, жүгеріде, кант кызылшасында, темекіде, іенеяда корсетілген.

Арпанын үрыктанбаған түйіндерін осіріп, гаплоидтык осімдіктерін алған Сан Ноум мынаны байкады. Эмбриоидтар үрык каишыгынын кез келген клеткаларынан түзілген: I) жүмыртка-клеткадан; 2) жүмырткаклеткасы мен антиподтардан; 3)жүмырт-каклеткасы мен бір синергидтен; 4) жүмырткаклеткасы мен екі синергидадан; 5) бір немесе екі синергидтен; 6) синергидтар мен ан і иподтардан. Онын болжауынша арпада гаплоидтык эмбриоидтар кобінесе антиподтардан, ал каллустар -синергидтардан түзіледі.

Күріштін үрыктанбаған түйіндерін осіргенде, гаплоидтык эмбриоидтар мен каллустар синергидалардан пайда болған. Темекінін үрыктанбаған түкым бүршіктерін осіргенде, гаплоидтык эмбриоидтар жүмырткаклеткадан шыккан, ал әленде (скерда) антиподтардан шыккан. Үрык капшығынын клеткаларынын делифференциялануын бастап, баска даму жолына ауысуын гуғызатын себептері мен факторлары әлі белгісіз.

Әсіргеи түйіндер мен түкым бүршіктердін цитологиялыкжәне пигоіенетикалықзерттеуін откізгенде, үрыккапшығьш коршаған сомалык клеткаларынын да пролиферациясы отетіндігі аныкталған. Нуцеллус пен интегументтерден диплоидтык және полиплоидтык осімдіктер пайда болған. Цитрустар мен манго осімдіктерінде нуцеллустан үрыктын түзілуі табиғатта жиі кездеседі. Лимоннын бірнеше түрлерінде және жүзімде нуцеллусты іп уііго өсіргенде, полиэмбриония күбылысы орын алған, яғни бір түқымда бірнеше урыктын дамуы. Және де жузімнін үрыктанбаған түкым бүршігін өсіргенде, эмбриоидтар гек нуцеллустан шыккан. Сонымен бірге лимон мен мангонын өсіп шыккан өскіндері вирустан таза болған. Сірә, жүзімнін де буішай өскіндері вируссыз болуы керек, бүл өте манызды жағдай. Өсімдіктер физиологиясы, генетикасы және биоинженерия ипститутында С.Мүкамбетжанов бидайдьш урыктанбаған т\ йіндерін өсіріп, олардьщ өсуі мен морфогенезін зерттеген. Ол корееткендей, морфогенез процесі каллусогенез, органогенез және эмбриоидогенез негізінде жүрген. Осы процестердің жолдары схсма түрінде жинактап корытылған (32-сурет). Бидайдын іп уііго жагдайыида жүретін апомиксис процесі аналык гаметофит клеткаларының спорофитгік жолына ауысуы аркасында өтеді. Сонымен үрык капшығы клеткалары мен оны коршаған улпаларда мынадай морфогендік процестер өтеді: 1) гиногеиез (жумырткаклеткасынан), 2) апогаметия (синергид-тар мсн антиподтардан); 3) адвентивтік эмбриония (нуцеллуспен интегумент клеткаларынан түзіледі).

Сөйтіп, үрыктанбаған түйіндері мен түкым бүршіктерін осіргенде, каллустардын сомалык диплоидтык клеткаларынан тузілуі әбден мүмкін. Бүны ескеріп, үрык капшығын өзін тікелей бөліп алып өсіру жаксы болар еді, бірак оны закымдамай бөліп шығару өте киын. Әзірше механикалык немесе ферментативтік жолмен оны бөліп алу жаксы нәтиже берген жок, себебі онын тіршілікке икемділігі төмендеп кетеді. Мүмкін үрык капшығын коршап түрған сомалык үлпалар оньщ тіршілікке бейімділігін арттырады, тіпті онда өтетін гаплоидтык эмбриоидогенез бен каллусогенезге жаксы әсер ететін шығар.

Сондыктан кейде аналык белгілері бар гашіоидтык өсімдіктерді гиногенез жолынан тыс, псевдогамия нәтижесінде алу тиімді түседі. Бүл гаплоидтык партеногенездін ерекше бір түрі. Ол арпанын Н.ЬиІЪозит түрінін тозаңымен тозаңдандыру кезінде орын алады. Арпанын жабайы түрінін хромосомалары жойылуы аркасында регенерант өсімдік шын мәнісінде жүмырткаклетка-сынан дамиды, яғни барлык аналык белгілеріне ие болады. Жүмырткаклеткасы ионизация туғызатын сәулелермен өңдеген сон партеногенез жолымен дамуы мүмкін.Аналык гаметофиттің іп үііго жағдайында дамуына әсер ететін факторларГаплоидтык өсімдіктер шығу процесіне бірсыпыра ішкі (донорлык өсімдіктің генотипі, үрык капшығынын даму кезені) және сырткы (коректік ортаның күрамы, өсіру жағдайлары) факторлар шектеу әсерін тигізеді. Күріштін әр түрлі сорттарында гаплоидтардын пайда болу жиілігі 1-ден 12 %-ке дейін болған. Герберада 19 сорттын ішінде тек біреуі ғана морфогенезге кабілеті жоғары каллусты түзген. Аналык гаметофитті өсіргенде гаплоид-тык өсімдіктердін түзілуі генотипке байланыстығы жүгеріде, темекіде, сәлбенде т.б. турлерінде көрсетілген. С. Мүкамбетжанов бидайдын 26 генотипін зерттеп, морфогенезге жоғары кабілетті болған біреуін-ак тапты, ол Саратовская 29 еді.

Сонымен, үрыктанбаған түйіндер мен түкым бүршіктерін өсіргенде, тозанкаптарды өсірген сиякты донорлык өсімдікгін генотипіне мән беру кажет. Өйткені бір сортка іріктеп алынған жағдайлар екіншісіне жарамауы мүмкін.

Үрыктанбаған түйіндер мен түкым буршіктерін өсіргенде тағы бір елеулі фактор - олардын даму кезеңдері. Айта кету керек, аналык гаметофиттің даму кезеңін аныктау аталык гаметофиттен едәуір киын. Үрык капшыктың даму кезеңін дұрыс аньщтау үшін түракты парафинделген препараттарды дайыңцау кажет, ал оларды алу өте күрделі және үзакка созылатын жүмыс. Сондыктан үрык капшығынын даму кезеңін әдетте жанама жолмен аныктайды. Атап айтканда, микроспоранын даму кезеңіне немесе өсімдіктін фенологиялык даму кезеніне карап. Морфогенез процестері үрык капшығында әр түрлі даму кезендерінде басталуы мүмкін.

Гаплоидтык өсімдіктерді осы әдіспен алу үшін коректік ортанын маңызы зор. Көбінесе Мурасиге-Скугтын, Миллердің, Ничтің, №6 орталары колданылады. Әсіресе фитогормондардың түрі мен мөлшері үлкен роль аткарады. Кейбір өсімдіктер үшін ауксиндер мен цитокининдер керек болса, баскаларына тек кана ауксиндер кажет. Мысалы, күріштін үрыктанбаған түйіндерін өсіргенде, гаплоидтык өсімдіктерді эмбриоидогенез аркылы шығаруға НСК-ның манызы болған. Күріштін баска түрінде 2,4-Д-ны кинетинге ауыстыру аркасында жаксы нәтиже алынған.

Фитогормондардың жоғары концентрациялары көбінесе түйіннін сомалык үлпаларынан каллустын шығуына себеп болған. Бидайдың үрыктанбаған түйіндерін өсіргенде, эмбриоидогенез өту ушін ең тиімдісі 2,4-Д мен кинетин (6-10 мг/л) косылған Мурасиге мен Скугтын ортасы болған.

Сондай-ак витаминдер, казеин гидролизаты, кокос сүті, ашыткы экстракты т.с.с. жағымды әсер етеді. Бірак олардын мөлшері тәжірибе аркылы іріктеліп алынады. Сонымен бірге көмірсулардын (глюкоза, фруктоза, сахароза) манызы зор. Астык түкымдастарынын көбі сахарозаның жоғары концентрациясын талап етеді, мысалы, бидай - 8-14 %, арпа - 3-10 %. Бірак онын мөлшері тым жоғары болып кетсе, ол зиянын тигізуі мүмкін.

Сөйтіп, түйіндер мен түкым бүршіктерін өсіргенде, коректік ортанын компоненттерінін түрі мен мөлшері, әсіресе биологиялык активтігі бар заттар, әрбір өсімдік түрі, тіпті сорты үшін де эмпирикалык жолмен нактылы іріктеледі.

Әдетінше түйіндер мен түкым бүршіктерін катты ортада 23-28°С температурада, жарыкта немесе караңғьща өсіреді, бірак тәжірибе көрсеткеңдей, күріштін, мактанын, бидайдың аналык гаметофиттерін сүйык ортада өсіру тиімдірек.

сонымен, аналык гаметофиттерден гаплоидтык өсімдіктерді алу өте күрделі, көп өзара тығыз байланыскан факторларға тәуелді процесс. Бірак бүл факторлардын морфогенезге әсері туралы накты білім жеткіліксіз, демек көп жағдайларды тек тәжірибе аркылы іріктеп алуға болады. Соған карамай, казір бірталай манызды ауыл шаруашылык дакылдарынын гиногаплоидтары алынған (арла, бидай, жүгері, күріш, кант кызылшасы, макта, картоп, темекі, күнбағар т.б.)

Корыта келе айта кету кажет, бүл әдіс аналык гаметофит-тін даму зандылыктарын эксперименттік зерттеу үшін өте колайлы.

7.4. Гаплоидтардын селекциядағы манызы

Гаплоидтык клеткалар мен протопластар клеткалардын бөлінуі мен дифференциялануын, сомалык клеткалардың генетикасын және популяциялардың генетикасын зерттеу үшін ынғайлы эксперименттік модель. Гаплоидтык өсімдіктер практикалык селекция мен теориялык зерттеулерде колданылатын өте күнды генетикалык материал. 33-суретте гаплоидтарды колдану мүмкіндіктері көрсетілген.

Гаплоидтарды пайдаланып, яғни хромосомалар санын екі есе арттырып, гомозиготаларды жылдам алуға болады. Гаплоидтык өсімдіктерді колхицинмен өндесе, хромосомалары мүлде үксас гомозиготалык дигаплоидтык организм пайда болады. Гаплоидтар үрыксыз болады, себебі гомологиялык хромосомалары болмағандыктан мейоз процесі бүзылып, аномальдык хромосомалар жиынтығы бар гаметалар түзіледі. Хромосомалар екі еселену аркылы гаплоидтык өсімдік гомозиготалык диплоидтык үрыкты өсімдікке айналады.

Ғ, өсімдіктердін тозанкаптарын алып, екі еселенген гаплоидтарды шығарып, кажетті белгілері бар рекомбинанттык генотиптерді селекция процесінін ен бастапкы кезенінде-ак аз популяция ішінен сүрыптап алуға болады. Гомозиготалык линияларды өзара будандастырып, гетерозистык жоғары енімді үрпак алынады. Гомозиготалык өсімдіктерді түкым аркылы көбейткенде, үрығында белгілері ажырамайды, сондыктан бүл экономика жағынан тиімді келеді.

10. Клеткалык инженерия

Клеткалык инженерия - клеткаларды өсіру, оларды будандастыру және кайта күрастыру аркылы клетканын мүлдем жана типін жасау әдістерінін негізінде калыптаскан биотехнологиянын саласы. Клеткаларды жасанды жолдармен будандастырғанда, сомалык (жыныстык емес) клеткаларды бір-біріне косканда будан геном түзіледі. Будандастырудын бүл тәсілінін мәні мынада: аталык және аналык клеткалар ретінде жыныстык клеткалар (гаметалар) емес өсімдіктін дене (сомалык) клеткалары косылады. Олардың алдын ала протопластарын бөліп алады, белгілі жағдайда олар бір-бірімен күйылысады. Пайда болған сомалык будан клеткадан кейін регенерация аркылы будан өсімдіктер өсіп шығады.

Протопластарды косу аркылы будандастыруды әр турлі атайды: сомалык будандастыру, парасексуальды будаңдастыру, жыныстык емес будандастыру. Сонда да, көбінесе бірінші термин колданылады, ал пайда болған будан сомалык будан деп аталады.

Протопласт бөтен ДНК-ны кабылдай алатын өте ыңғайлы 8.1. Протопластарды бөліп алу Протошіаст деген ферменттердін әсерімен немесе механикалык әдістермен қабығы тугел жойылған өсімдік клеткасы. Ағылшын ғалымы Э. Кокинг 1960-шы жылдардың басында клетканын ішіңдегі протопласты закымдамай тірі күйінде бөліп алу әдісін жете зерттеп дайындады. Ол томат тамырларынын үштарын, зен саныраукулактар өсірген ортасына бөліп шығарған гидролиздік ферменттерімен өңцеп, протопластарды ферменттік әдісімен бөліп алды. Әдетте тірі клеткада протопласт клетканың кабырғасына орталык вакуольдін тургор, яғни кернеулік қысымымен тығыз жанасып түрады. Клетка кабығы аркылы плазмалеммамен коршалған цитоплазмалык жінішке жіпшелер өтеді, солар аркылы коршілес клеткалардын протопластары біріне-бірі жалғасып жатады. Сондыктан клетка кабығын ферментпен еріткен кезде, протопластарға зиян келтірмей клеткаларда плазмолизді жүргізеді. Осмотик ретінде сахароза, маннит, сорбит колданылады. Осы заттардың гипертониялык ерітінділері әсерінен вакуоль сусызданып жиырылып, протопласт көлемі кішірейіп, сонынан кабыктан алшактайды (37-сурет). Кейде клетка сопак болғанда протопласт плазмолиз кезінде екі бөлініп кетуі мүмкін. Сондай ядросы жок субпротопласт цитопласт деп аталады.

ерітіндісіне осмостык зат косылады. Осы әдіспен әр түрлі өсімдіктердің ұлпаларынан протопластар алынады.

Казіргі уакытта протопластарды бөліп алу үшін ферменттердін коспасын пайдаланады. Бүл коспанын күрамында ферменттердің үш түрі боладын пектиназалар, целлюлазалар және гемицеллюла-залар. Олар клетка кабығының негізгі компоненттерін ьщыратады. Бүл ферменттерді кейбір бактериялар мен санырауқүлактар өздерін өсірген сүйык ортаға бөліп шығарады, сонымен катар оларды үлудың аскорыту сөлінен бөліп алады. Казіргі уакытта пектиназалык және целлюлазалык әсері бар бірталай стандарттык ферменттер бар. Олардың фирмалык аттары әр түрлі, атап айтканда мыналар:

- целлюлазалар: Опогика К.-10, Сеішіузіп, Огізеіазе;

- гемицеллюлазалар: Кһогуте НР150, Нетісеішіазе;

- пектиназалар: Масегохуте К-10, Масегазе, Ресііпоі АС, Ресіоііазе Ү23, Ресііпазе, РАТЕ;

- ЗС целлокандин мен ксиланаза (бүлар целлюлоза-пектин комплексіне әсер етеді).

Ферменттік ерітінділерді арнайы сүзгіден өткізу аркылы залалсыздандырады. Клетка түрлерінде күрылымы мен күрамы жағынан айырмашылыктары болғандыктан, колданылатын ферменттердің комбинациялары мен мөлшерінің ара катынасы бірдей болмайды. Әрбір үлпа үшін ферменттердің күрамы, концентрациясы мен ара катынасы және өңцеу уакыты бөлек іріктеліп алынады. Бөлініп алынған протопластар ферменттік ерітіндіде мейлінше аз уакыт болуы керек, одан кейін үкыпты түрде жуылуы кажет.

Протопластарды бөлу кезінде осмостык стабилизатор маңызды кызмет аткарады. Протопластар бүтін болу үшін ферменттік ерітінділер изотониялык немесе гипертониялык күйде болу керек. Кейде материалды алдын ала плазмолиздык ертіндісінде біраз үстайды. Осмостык зат ретінде көбінесе канттар (глюкоза, сахароза, сорбит, маннит) пайдаланылады, кейде СаС1₂, Ма₂НР0₄, КСІ түздардын ерітіңдісі 0,3-0,8 М концентрацияда колданылады. Осмостык заттын дәл концентрациясы өсімдіктін нактылы түріне және онын физиологиялык күйіне байланысты жеке іріктеліп алынады. Көбінесе ферменттер кейін протопластарды өсіруге колданылатын коректік ортада ерітіліп дайындалады. Ферменттік I ерітіндінін рН көрсеткішін бір деңгейде (5,4-6,2) үстау үшін буфер косады.Протопластарды бөлу кезінде аэрациянын маңызы зор. Сондыктан ортаны араластыратын жабдыктар колданылады немесе ферменттік ерітінді тубіне ғана күйылған Петри табакшасында бөліп шығарады. Протопластарды ала көлеңкеде немесе каранғыда бөліп алады. Ферменттік ерітіндіде инкубация уакыты ферменттердін үйлесуіне, рН және температураға байланысты, 1-2 сағаттан 15-16 сағатка дейін барады. Әрбір нактылы үлпа үшін ең тиімді температурамен өндеу уакытын жеке іріктеп алу кажет. Температура әр денгейде болады, мысалы бидайға 14°С болса, томатка ен колайлысы 27°С. Протопластар бөлініп алынған сон, олар үлпанын калдыктары мен ферменттерден тазалануы керек. Ол үшін оларды центрифугалайды немесе сүзіп алады. Инкубациялык коспаны тесіктері 50-100 мкм електен сүзеді, одан кейін протопласт суспензиясын центрифугалайды. Центрифугалау тәртібі осмостык затка байланысты. Егер ферменттік ерітіндісі 0,4-0,5 М сахарозада дайындалса, 100-200 § 2-3 мин бойы центрифугалайды. Протопластар үстіне калкып шығады, оларды Пастер пипеткасымен сорып алып, екі рет түздың ерітіндісінде шаяды. Тығыздығы төмен баска осмостык заттарды (маннит, сорбит) колданған кезде, протопластар центрифугалау кезінде түнба болып шөгеді. Оларды екі ретжуады. Одан кейін протопластарды түздын ерітіндісінде немесе 0,4 М маннит, сорбит, глюкоза ерітіндісіне немесе өсіретін коректік ортаға салып, суспензиясын алады. 8.2. Тіршілікке кабілетті протопластарды алу Протопластарды нәтижелі бөліп алу көптеген факторларға байланысты. Олар атап айтканда: үлпанын шығу тегі (жапырак, тукымжарнак, тамыр, тозаң түйірі, каллус үлпасы, суспензиядағы клеткалар), өсімдіктің түрі мен сорты, өсімдіктін физиологиялык күйі, ферменттердін күрамы, олардын сапасы, ортанын рН және осмостык заттын түрі.

Протопластардын тіршілікке икемділігін, яғни олардын метаболиттік активтігін аныктайтын арнайы әдіс бар. Ол протоиластардын флуоресцеиндиацетатпен (ФДА) боялуы. ФДА- бүл флуоресценциясы жок косылыс, протопластар мембранасы аркылы женіл өтеді, тірі протопластардын ішінде эстеразалардын әсерімен ыдырайды. Сонын нәтижесінде флуоресцеин босайды, оны протопластардын бүтін мембраналары ұстап калады. Соидыктаи метаболиттік активтігі бар (тіршілікке кабілетті) нротоплаетар ультракүлгін сәулесінде көзге көрінеді, себебі іипсрінлс жинакталған флуоресцеин ультракүлгін сәулесімен коідырыдып, жасыл сәулені тарата бастайды.

Нротопластар суспензиясынын сапасы тіршілікке икемді иротопластардын санымен (процент мөлшерінде) белгіленеді. Протопластардын саны Фукс-Розенталь камерасында есептеледі. Протопластардын тығыздығы (суспензияньщ 1 мл-дегі саны) сусиеизияның манызды сипаттамасы. Егер үлпанын немесе осірілген клеткалардың ылғалды массасының 1 граммынан ІхІО⁵ теп Iх 1 ()*' дейін тіршілікке икемді протопластар шыкса, онда протонластар жаксы бөлініп алынды деп есептеледі.

Жогарыда айтып кеткендей, протопластардың бөлініп алынатын мөлшері және олардын өміршеңцігі өсімдіктін түріне, жасына және физиологиялык күйіне, яғни генетикалык және эиигенетикалык ерекшеліктеріне байланысты. Протопластарды коп молиіерле түракты алып отыру үшін өсімдіктерді белгілі бір жагдайда осіру керек және олардың ен колайлы өсу кезенін, нактылы бір мүшесін аныктап тандап алу кажет.

Іп уііго оскен клеткалар мен үлпалардан протопластарды бөліп алулып. мыпадай өз артыкшылыктары бар: стерильдік, іп уісго жагдайыпда өсуге бейімділік. Бірак клетка кабыкшасынын химнялык күрамынын күрделі болып өзгеруі және онын калындауы ферменттік гидролизді киындатады. Бүтін протопластардың бөлініп алынуы өсірген клеткалардын ішінде меристемалык юіеткаларынын сан жағынан үлесіне сай болады, ал ол үтііігі суспензиядағы клеткаларды жиі-жиі (әрбір 2-3 тоулігііідс) жаңа коректік ортаға көшіріп отыру керек. Суспензияда өсірген клеткалардан протопластарды алу үшін ен колайлы мезгіл, ол клеткалардың өсу кезенінін логарифмдік фазасынын сонында. Осы мезгілде клетка кабыкшалары фермепттердін әсерімен онай ыдырап, өміршең протопластарды береді. Протопластардың тіршілікке икемділігі оларды бөліп алу жагламлары мен тәсілдеріне байланысты. ІСлетканың плазмолиз кезінде сусыздандырылуы және кабығының бүзылуы оны шок күйіне (күйзеліске) душар етеді. Бүл жағдайда цитоплазманың вакуольденуі артады, көптеген липид тамшылары пайда болады, полисомалардың саны азаяды, ядро мен хлоропластар коюланады.

Фермент препаратының сапасы протопластардың бөліп алынған санына, мөлшеріне ғана емес, олардын кейбір касиеттеріне де әсер етеді. Пектиндер мен целлюлозаларды гидролиздейтін саудалык фермент препараттарына коспа ретінде протеазалар, липазалар, нуклеазалар және баска ферменттер, фенолдык косылыстар, түздар кіреді. Олар плазмалемманын касиеттерін өзгертуі мүмкін. Осы токсикалык заттардан күтылу үшін және протопластардын шығуын арттыру үшін ферменттерді тазалауға болады. Бірак айта кететін мәселе, өте жаксы тазартылған ферменттер протопластарды көп мөлшерде алуға тиімсіз келеді. Кейде ферменттер ерітіндісіне корғаушы заттар (протекторлар) косылады, мысалы декстраннын немесе калий сульфатының 0,5 % ерітінділері. Олар протеиндермен әрекеттесіп, ферменттердін зиянды әсерін төмендетеді.

Пнкубациялык ортада иондардың, әсіресе кальций мен магнийдің болуы, плазмалемманын түрактылығын арттырып, окшауланған протопластардың сапасынжаксартады. Окшауланған протопластар механикалык және осмостык стреске өте сезімтал болады. Олар тек ішіне сіңіп кіре алмайтын осмостык заттың гипертониялык ерітіндісінде өздерінің осмостык түрактылығын сактай алады.

Ферменттік ерітіндісінен жуылып тазартылып алынған тіршілікке икемді протопластар шок күйінен шығып, біртіндеп өзінің ішкі жүйесіндегі бүзылған күрылымдарын жөніне келтіріп (репарация), кабығын кайта күруға (регенерация) дайындалады. Толык жарамды изотониялык коректік ортада (протопласт пен ортанын осмостык кысымы тепе-тең) асептикалык жағдайда протопластар үзак мезгіл тіршілікке икемді болып, бөлінуге кабілетін сактайды.

8.3. Протопластарды іп уііго өсіру

Протопластарды іп уііго түрлі тәсілдермен осіруге болады. Өсіру тәсілі тәжірибенін максатына байланысты. Алдымен протопластарды коректік ортада шайкап жуып ферменттерден тазартады. Сонан сон олардың 1 мл ортадағы санын есептеп алады. Жасайтын тәжірибеге сәйкес олардын тығыздығын керек көрсеткішке жеткізеді. Ол үшін протопластарды әр түрлі көлемі бар ортаға салады. Мысалы, протопластардын тығыздығын асыру үшін оларды аз көлемді ортаға салады. Ал, керісінше, протопластардың тығыздығын азайту үшін оларды коректік орта мол күйылған ыдыска көшіреді. Сөйтіп, протопластардын 1 мл ортадағы санын октын-октын есептеу аркылы олардын тығыздығын істейтін тәжірибеге сайма-сай келтіреді.

Протопластарды сүйык ортада өсіргенде клеткаларды өсірген сиякты олардың тығыздығы жоғары болуы керек. Көбінесе бүл көрсеткіш Імл 10⁴ - 10⁵ клетка болады. Егер коректік орта сүйыкталып, протопластар саны бүдан аз болса, онда олар жөнді өсе алмайды. Өте сүйык суспензияда протопластардын ішіндегі тіршілікке кажетті кейбір метаболиттер плазмалемма аркылы ортаға шығъш кететін көрінеді. Сондыктан протопластардын тіршіліктік кабілеті едәуір кемиді. Осының дәлелі ретінде мынадай мысал келтіруге болады. Әдетте ісік үлпалардан алынған Ъ клеткаларды суспензияда өсіргенде коректік ортаға ауксин мен ^^ цитокинин гормондарьш коспайды. Өйткені бүл гормондар 4 осындай ісік клеткаларынын өздерінде түзіледі. Сүйык ортада ^> өсіргенде клетка кабығы ол гормондардын клетканын ішінен сыртына шығуын бөгейді де, ондай эндогендік метаболиттерді клетканьщ өзі пайдалана алады. Ал ісік клеткалардан бөліп , алынған протопластарды суспензияда өсіру үшін коректік ортаға міндетті түрде экзогендік ауксин мен цитокининді косу керек. Себебі, жоғарыда айтылғандай, олардын өз эндогендік гормондары клетканың кабығы болмағандыктан плазмалеммадан шығып кетеді.Протопластардың өсуіне жаксы жағдай жасау үшін «коректік кабат» әдісін пайдаланады немесе байытылған ортаны колданады, о болмаса олар өсіп жаткан ортанын көлемін минимумға дейін _у азайтады. «Астынғы коректік кабат» ретінде рентген немесе гамма-сәулелері әсер еткен протопластар мен клеткалар пайдаланылады. , Сол әсерден ондай клеткалар бөліну кабілетінен айырылады, бірак баска клеткалардың өсуіне жағдай туғызады. Осы әдістін тағы бір түрі, ол нашар өсетін протопластарды жаксы өсетін протопластармен бірге өсіру. Байытылған орталар өсімдіктердін шамалы түрлері үшін ғана оң әсерін тигізеді.

Протопластарды өсірудің кен таралған әдісі, оларды жоғары ылғалдылыкта көлемі 20-40 мкл тамшыларда өсіру. Петри табакшасының какпағында немесе түбіндегі кішкене тамшыларға протопластар автоматтык пипеткамен салынады. Протопластарды өсіру үшін бүл әдістің тиімділігі - материалдар мен уакытты үнемдеп, коректік ортанын мындаған варианттарын тексеруге мүмкіншілік береді. Бірак бүл әдістін де кемшілігі бар, ол протопластардын тамшынын ортасына жыйылуы.

1978 жылы украин ғалымы Ю.Ю. Глеба жеке протопластарды коректік ортанын көлемі 1 мкл дейін микротамшыларда өсіру әдісін жете зерттеп дайындады және өзінің зерттеу жүмысында осы әдісті нәтижелі колдаңды. Осыңдай көлемдегі микротамшьгда бір клетка болса, онда клетка көлемі мен коректік орта көлемінін ара катынасы әдеттегі өсіргендей тығыздығы 1 миллилитрде 10³ клеткасы бар суспензиямен бірдей болады. Протопластарды алдын ала 1-3 күн тығыздығы жоғары (10⁴-10⁵ клетка) суспензияда өсірсе, кейін сондай суспензиядан алынған жеке протопластарды микротамшыда өсірудің тиімділігі арта түседі. Протопластарды суспензия ретінде сүйык ортада ғана емес, біраз коюланған ортада да өсіруге болады. Ол үшін ыдыска күйылған коюланған ортанын бетіне жүка кабат етіп кана протопластарды салады. Бүл әдіс бойынша, сүйык ортамен көлемі тең коюланған ортада протопластардын концентрациясын екі есе көп етіп өсіруге болады.

Протопластарды агары бар катты ортада да өсіруге болады. Ол ушін протопластар суспензиясын 1,2 % агары баржылы (45°С) көлемі бірдей ортамен араластырады. Орта суып каткан сон оньщ ішіндегі протопластар бір-бірінен алыстау болып бекітіліп орналасып калады. Осы агарда орныктыру әдісі протопластардын әрқайсысынын өсуін жеке бакылап отыруға мүмкіндік береді. Агар орнына агароза колданылса, клеткалардың бөлінуін арттыруға болады екен. Агароза агардың күрамына кіреді, шамасы агар екі полисахаридтін - агароза мен агаропектин - коспасы. Бүл тәсіл, әсіресе өсу каркыны бәсен немесе өспей калған протопластарға колайлы.

Клетка кабығы кайта пайда болып, клетканын алғашкы бөлінуі үшін коректік заттар орташа мөлшерде кажет болады. Ортанын концентрациясы жоғары болса, протопластардың күй-жағдайы тіпті нашарлауы мүмкін. Ал екі-үш рет бөлінгеннен соң клеткалар коректік заттардын жетіспеушілігінін зардабын шеге бастайды. Егер осы кезде орта байытылмаса, бөлінуі тежеліп, клеткалар тіпті күрып кетуі де мүмкін. Өсіру кезінде коректік ортаны байытудын екі жолы бар: жоғары концентрациялы койылтылған ортаны тамшылап косып отыру және катты коректік кабатты колдану.

Бірінші жолдың кемшілігі, концентрациясы жоғары ортаны коскан сайын инфекциялану кауіпі туады. Ал екінші жолы одан тәуірірек, себебі күрамы бай коректік орта ыдыска алдын ала күйылады. Ол қаткан сон үстіне протопластар салынады. Сөйтіп алғашкы күндері протопластар коректік заттар азырак ортада өседі, ал кейінірек каркынды бөлініп келе жаткан клеткаларға астынғы катты кабаттан диффузия аркылы кажетті заттар келіп жатады.

Протопластарды да клеткалар мен үлпаларды өсіретін белгілі коректік орталарда өсіреді. Протопластарды өсіретін коректік ортанын негізгі айырмашылығы - кальцийдін концентрациясы 2-4 есе артык және 0,4-0,8 М осмостык заттардын косылуы. Протопластарды өсіру үшін кеңінен колданылатын коректік орталар: өзгертілген Мурасиге-Скуг ортасы (көбінесе ол Нагата және Такебе ортасы деп аталады); Гамборгтын В₅ ортасы және Као мен Михайлюктің ортасы (бүл витаминдермен, амин кышкылдарымен және канттармен, кейде фитогормондардын күрделі күрамымен байытылған Гамборгтын В₅ ортасы). Бүнда канттар (ксилоза, рибоза, целлобиоза, манноза, рамноза) осмотик ретінде ғана емес, клетка кабығынын тез пайда болуына да әсер етеді.

Өсімдіктердін әр түрлерінен бөлініп алынған протопластардын өсуіне колайлы көптеген коректік орталар жете зерттеліп үсынылды. Коректік орталарды іріктеп алу көбінесе тәжірибеге негізделген. Онын ең лайыкты күрамы өсімдіктің түрі түрмак, тіпті жеке сорт үшін де тандалады. Нактылы әрбір өсімдіктен алынған протопластардың коректік ортаға реакциясын зерттеу ушін оларды «аспа тамшылар» әдісімен өсіріп, бірнеше факторлары белгілі схема бойынша әр түрлі комбинацияда күралған коректік орталарында өсіреді. Мысалы, коректік ортанын екі факторынын уш концентрациясының әсерін зерттеу ушін 9 ортанын 9 варианты дайындалады (яғни 9 тамшы), олар диаметрі 5 см Петри табакшасында үш-үштен тор ретінде орналасады. Бүл тәжірибеде ең азы 5 табакша колданылатын болғандыктан, косымша факторлардын, мысалы жарык пен температуранын әсерінде зерттеуге әбден болады. Протопластарды өсіргендегі температура өсімдіктің түріне байланысты 15°С-тан 30°С-ка дейін болады. Әдетте протопластар температураға өте сезімтал. Жарыктың каркыны 0-ден 2000 люкске дейін болады.