Построение трехмерной модели амидазы R. rhodochrous. Работу

Работу выполнил А.Крайнов

Руководитель Г.Чилов
Общая харектеристика амидаз

Ациламид-фмидогидролазы (амидазы) относятся к классу ферментов, катализизирующих гидролиз амидов карбоновых кислот до свободных кослот и аммиака:

R-CONH(2)+H(2)O==R-COOH+NH(3)

Амидогидролазы вовлечены в азотистый обмен в организме и широко распространены в природе: они обнаружены как в про- так и в эукариотах. Эти ферменты часто встречаются у бактерий, относящихся к группе нокардио подобных актиномицетов (нокардий, родококков, артробактерий). К настоящему времени выделены и охарактеризованы амидазы из различных источников, существенно различающихся по спицефичности.Одни из них преимущественно гидролизуют амиды алифатических кислот(R. rhodochrous), другие - ароматических , третьи расщепляют амиды A- или W-аминокислот, некоторые амидазы стереоселективны. Несмотря на большое число публикаций, данных о пространственной организации белков пока нет. В связи с этим систематический сравнительный анализ структурно-функциональной организации амидаз практически не проводился.Среди бактериальных ферментов этого типа наиболее детально изучены амидазы из Brevibacterium sp. ,Rhodococcus rhodochrous и Pseudomonas aeruginosa. Нативные состоят из нескольких идентичных субъединиц и относятся, по всей видимости, к классу сульфгидроильных ферментов. Они проявляют два типа активности - амидо-гидролитическую(1) и амидотрансферазную(2):

R-CONH(2)+H(2)O==R-COOH+NH(3) (1)

R-CONH(2)+NH(2)OH==R-CONHOH=NH(3) (2)

Многие микроорганизмы используют нитриллы органических кислот как источники азота и углерода.

Субъединичный состав. Практически все изученные амидазы обладают четвертичной структурой и состоят из четного числа одинаковых субъединиц, однако размер субединиц и их количество изменяютсся в достаточно широком диапозоне. У Rhodococcus rhodochrous 4 субъединицы массой 42 кДа, подобные размеры имеет амидаза "широкого спектра действия" из Brevibacterium sp. (4*43 кДа).

рН-оптимум активности. Установлено, что амидаза высокоактивна в достаточно широком диапозоне рН - от 5 до 8. За пределами этих значений рН наблюдается резкое снижение активности. Так про рН около 3,7 и 8,5 фермент проявляет лишь 50% своей активности.

Температурный оптимум действия амидазы лежит в диапозоне 55-60 С. При 37 С фермент проявляет лишь 37% максимальной активности. Ометим, что несмотря на различный субъединичный состав и специфичность, практически все амидазы

наиболее активны при достаточно высоких температурах - около 55 С. Исключение составляет пептид-амидаза из Stenotrophomonas maltrophila, обладающая максимумом активности при 39-45 С.

Табл.1 аминокислотный состав R.rhodochrous и P.aeruginosa

Аминокислота	R.rhodochrous	P.aeruginosa
Cys	8	9
Met	14	15
Asp	32	34
Thr	21	13
Ser	15	16
Glu	26	41
Pro	20	17
Gly	31	34
Ala	34	32
Val	22	23
Ile	21	21
Leu	22	20
Tyr	15	17
Phe	12	9
Trp	10	6
His	11	7
Lys	18	15
Arg	17	19
Всего	349	346

субстрат	Активность%
Мочевина	0
Ацетамид	100,0
Акриламид	75,0
Метакриламид	6,7
Пропионамид	92,0
Хлорацетамид	12,1
Никотинамид	2,5
Бензамид	4,5

rhodochrous совершенно не расщепляет амиды альфа-аминокислот. Не гидролизуются также и w-амиды a-аминокислот. Даже небольшой по объему амид аминоуксусной кислоты не является субстратом для данного фермента. Очевидно. наличие протонированной в рабочем диапозоне рН(~7,5) NH(2) группы у а-углеродного атома препятствует связыванию субстрата ферментом и/или осуществлению каталитического цикла.

Реагент	Остаточная активность	Реагент	Остаточная активность
FeCl(3)	0	DTT	145,0
ZnSO(4)	27,5	PMSF	101,0
CuSO(4)	0	фенантролин	119,5
AgNO(3)	0	ЭДТА	126,3

Экспериментальная часть

Последовательности амдазы из P.aeruginosa(1k17) и NitFhit из С.elegans(1ems) были взяты из базы данных http\\srs.ebi.ac.uk\ в ent и FASTA формате. На сервере института Белозерского было сделано выравнивание с помощью программы AliBee. По результатам выравнивания - процент гомологии с амидазой из P.aeruginosa – 85,2 %(c NitFhit из C.elegans~30%). Построение трехмерной модели амидазы R.rhodochrous производилось на сервере http\\expasy.org\ с использованием амидазы из P.aeruginosa как темплата и NitFhit из C.elegans для дополнительной проверки. В результате запроса был поучен файл с 3-D моделями трех белками(result.pdb). Трехмерная модель амидазы из R.rhodochrous была сохранена в отдельном файле(m8-ami.pdb).

Результаты и их обсуждение.
Была получена трехмерная модель части амидазы из R.rhodochrous. Используя программу SPDBV было посчитано среднеквадратичное отклонение от амидазы из P.aeruginosa, которое составило 0,10 А . В активним центре обоих ферментов находятся одинаковые аминокислотные остатки Cys166, Glu59,

Рис.1 Каталитическая триада амидазы R.rhodochrous

Lys127 (рис.1,рис.2),составляющие каталитическую триаду, и Tyr192, Gln190, Cys166, отвечающие за
Рис.2 Каталитическая триада амидазы из P.aeruginosa

связывание с субстратом(рис.3). Этим объясняется сходство субстратной специфичности амидаз R.rhodochrous и P.aeruginosa (амиды алифатических кислот). В NitFhit из C.elegans выравнивание производилось по нитрилазному домену, каталитическую триаду которого составляют Cys169, Glu54 и Lys127.


Рис.3 Аминокислотные остатки, отвечающие за связывание с субстратом



Выводы.
1)С помощью программы Swiss-Model была построена третичная структура амидазы из R.rhodochrous, исходя из его первичной структуры и структур амидазы из P.aeruginosa и NitFhit из C.elegans.
2)Среднеквадратичное отклонение от известной структуры из P.aeruginosa составило 0,10 А для С-альфа атомов.
3)Структуры всех трех белков схожи, хотя процент гомологии с NitFhit из C.elegans всего около 30%.
4)На основании полученной структуры было показано, что в активных центрах амдаз из R.rhodochrous и P.aeruginosa находятся одинаковые аминокислотные остатки Cys166, Glu59, Lys134, Gln190, Tyr192, чем обясняется одинаковая субстратная специфичность.

Используемая литература

1)Биохимия(1999) т.64 Вып.4 с. 459-465.

2)Biochem.J.(2002)365,731-738

3)http\genomebiology.com\2001\2\1\reviews\0001.1

4)http\\brenda.uni-koeln.de\