Практикум «основы электронной микроскопии для биологов»



жүктеу 0.55 Mb.
бет1/3
Дата01.07.2016
өлшемі0.55 Mb.
  1   2   3


МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РФ

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «НОВОСИБИРСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

Факультет естественных наук


ПРАКТИКУМ

«ОСНОВЫ ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ

ДЛЯ БИОЛОГОВ»
Подготовка клеточных культур к электронно-микроскопическому исследованию


Методическое пособие

Д.А. Максимова, Н.В. Губанова, К.В. Корчагина, Л.В. Шестопалова







Новосибирск

2012

ББК


УДК [615.281, 577.2:616-006, 578.1]

Д


Подготовка клеточных культур к электронно-микроскопическому исследованию: методическое пособие / Новосиб. гос. ун-т. Новосибирск, 2011. 17с.

(Практикум «Основы электронной микроскопии для биологов»)


Методическое пособие к разделу практикума "Основы электронной микроскопии для биологов" содержит главы с описанием особенностей работы с культурами клеток, способов их заражения инфекционным агентом, а также методов подготовки клеточных культур к электронно-микроскопическому исследованию. Предназначено для студентов, аспирантов и научных работников, выполняющих исследования, связанные с изучением воздействия вирусов на клетки млекопитающих in vitro с помощью трансмиссионного электронного микроскопа.

Методическое пособие разработано в рамках реализации Программы развития НИУ НГУ при поддержке грантов ФЦП (Гос. контракт № 16.740.11.0179), АВЦП (№ 2.1.1/ 9888) и Министерства образования и науки (договор №11.G34.31.0034).

© Новосибирский государственный университет, 2012
Содержание


ВВЕДЕНИЕ 4

1. ОСОБЕННОСТИ РАБОТЫ С КУЛЬТУРОЙ КЛЕТОК 5

1.1. Преимущества метода 5

1.2. Работа в культуральной лаборатории 6

1.2.1. Подготовка бокса к работе 7


  1. 1.2.2. Стерилизация 8

1.3. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ КЛЕТОЧНЫХ ЛИНИЙ 10

  1. 1.3.2. Приготовление ростовой FD среды для культивирования линий опухолевых клеток человека и линий эмбриональных фибробластов человека 13

  2. 1.3.3. Пересев клеток с помощью трипсина 14

  3. 1.3.4. Контроль за культурой клеток 16

  4. 1.3.5. Подсчет клеток в камере Горяева 17

  5. 1.3.6. Замораживание культивируемых клеточных линий в жидком азоте 18

  6. 1.3.7. Размораживание клеточных линий 20

1.4. Методические подходы к исследованию влияния вирусов на клеточные культуры 27

  1. 1.4.1. Предосторожности при работе с зараженными вирусами клетками 27

  2. 1.4.2. Заражение клеточных линий вирусом 29

  3. 1.4.3. Окрашивание трипановым синим 29

2.1. Способы идентификации вирусных антигенов методами электронной микроскопии 30

  1. 2.1.1. Подготовка сеточек для электронно-микроскопического исследования суспензий 31

  2. 2.1.2. Прямое электронно-микроскопическое исследование вирусов в суспензиях 35

  3. 2.1.3. Иммуноэлектронная микроскопия 36

  4. 2.1.4. Электронно-микроскопическое изучение тонких срезов клеточных культур 37

2.2. Подготовка опухолевых клеточных линий, зараженных ВБН, для электронномикроскопического анализа 47



ВВЕДЕНИЕ


Тканевые и клеточные культуры давно нашли применение для решения различных вопросов биологии и медицины. Однако лишь успехи в области вирусологии, достигнутые с помощью тканевых культур, явились мощным стимулом их развития до современного уровня. Использование культур клеток для решения целого ряда актуальных задач, стоящих перед медициной и биологией, основано на сохранении жизнеспособности клеток, выделенных из живого организма, возможности выращивать клетки, ткани, небольшие органы (или их части) животного, включая человека, или растения вне организма.

Одним из преимуществ клеточной культуры перед другими объектами исследования является возможность продолжительного наблюдения за жизнедеятельностью клеток, за состоянием отдельных клеточных органелл, за процессами, идущими в клетках, фиксировать состояние культуры с учетом количественных и качественных параметров.

Кроме того, использование данного методического подхода делает возможным решение целого ряда прикладных задач, связанных с диагностикой и производством препаратов для профилактики вирусных инфекций. Также он помогает решить ряд теоретически проблем, связанных с изучением особенностей взаимодействия "вирус-клетка", что делает перспективным использование клеточных культур в выявлении вирусов, обладающих онколитической активностью, способных подавлять неопластические процессы в организме млекопитающих и человека.

Для этих целей необходимы комплексные исследования с применением вирусологических, молекулярно-биологических и микроскопических методов, включая электронную микроскопию.

В связи с этим задачей данного методического пособия явилось ознакомление заинтересованной аудитории с основами культуральной работы и способами подготовки клеточных культур, использованным в эксперименте, к электронно-микроскопическому исследованию.

1. ОСОБЕННОСТИ РАБОТЫ С КУЛЬТУРОЙ КЛЕТОК

1.1. Преимущества метода


Прежде чем принять решение использовать клеточные культуры в качестве объекта или средства исследования, необходимо убедиться, что те преимущества, которые исследователь при этом получает, перекроют сопряжённые с данным методом трудности.

К преимуществам метода можно отнести следующее:



  • Главное преимущество культивируемых клеток - это возможность прижизненного наблюдения клеток с помощью микроскопа.

  • Существенно, что при работе с культурами клеток в эксперименте используются здоровые клетки, и они сохраняют жизнеспособность в течение всего эксперимента. При опытах на целом животном состояние почек, например, можно оценить лишь в конце эксперимента, и к тому же обычно лишь качественно.

  • Культуры клеток представляют собой генетически однородную популяцию клеток, растущих в постоянных условиях. Более того, исследователь может изменять эти условия в определённых пределах, что позволяет ему оценивать влияние на рост клеток самых различных факторов - рН, температуры, концентрации аминокислот, витаминов и др. Рост может быть оценен в течение короткого периода времени либо по увеличению числа или размеров клеток, либо по включению радиоактивных предшественников в клеточную ДНК.

  • Существенные результаты могут быть получены при использовании очень небольшого числа клеток. Эксперименты, требующие для выяснения того или иного вопроса использования 100 крыс или 1000 человек, могут быть с равной статистической достоверностью поставлены на 100 культурах на покровных стёклах. Т. о. одна клетка может заменить целую клинику больных. Это является важным преимуществом, когда дело касается человека, и, кроме того, снимает многие этические проблемы, возникающие при необходимости использовать для эксперимента большую группу животных.

  • Поскольку клетки в культуре легко доступны для различных биохимических манипуляций, то при работе с ними радиоактивные предшественники, яды, гормоны и др. могут быть введены в заданной концентрации и в течение заданного периода. Количество этих соединений может быть на порядок меньше, чем при экспериментах на целом животном. Исчезает также опасность того, что исследуемое соединение метаболизируется печенью, запасается мышцами или экскретируется почками. При использовании клеточных культур, как правило, бывает нетрудно установить, что при определённой концентрации добавленное в культуру вещество находится в контакте с клетками в течение данного периода времени. Это обеспечивает получение реальных значений скорости включения или метаболизма исследуемых соединений.

Помимо перечисленных выше преимуществ, клеточные культуры обладают рядом важных свойств, наличие которых является необходимым условием для решения многих поставленных перед исследователем задач. К ним можно отнести:

    1. Однородность клеток, происходящих чаще всего от одной родительской пары клеток, и обладающих определенными и относительно постоянными свойствами и характеристиками.

    2. Отсутствие структурной организации, гистотипическая целостность и связанные с ней биохимические признаки.

    3. Размножение клеток с большим выходом биомассы.

    4. Отсутствие дифференцированности.

    5. Возможность клонирования, селекции, получения чистых клеточных линий, изучения или видоизменения свойств клеток и закрепление этих свойств.

    6. Возможность получения количественного результата.
  1   2   3


©dereksiz.org 2016
әкімшілігінің қараңыз

    Басты бет