Практикум «основы электронной микроскопии для биологов»
Работа в культуральной лаборатории
жүктеу/скачать 7.03 Mb.
|
- Бұл бет үшін навигация:
- 1.2.1. Подготовка бокса к работе
- 1.2.2. Стерилизация
- 1.3. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ КЛЕТОЧНЫХ ЛИНИЙ
- 1.3.3. Пересев клеток с помощью трипсина
- 1.3.4. Контроль за культурой клеток
- 1.3.5. Подсчет клеток в камере Горяева
- 1.3.6. Замораживание культивируемых клеточных линий в жидком азоте
- 1.3.7. Размораживание клеточных линий
1.2. Работа в культуральной лабораторииКак правило, лаборатория, где проводят работы с культурами клеток, состоит минимум из 3-х помещений. Это бокс, где ведутся стерильные работы; комната для приготовления питательных сред, хранения химикатов, оборудования и т.д.; автоклавная. Но в настоящее время современные модели автоклавов стали более надежными и безопасными в использовании, с ними могут работать и необученные специально люди, а отдельных комнат не требуется. 1.2.1. Подготовка бокса к работеРазличные манипуляции с культурами клеток проводят в специальном помещении - стерильном боксе. Полы и стены этого помещения должны быть моющимися (в идеале - кафельными) и не содержать материалов, накапливающих пыль. Влажную уборку проводят с использованием дезинфицирующих агентов. Для надежности стерилизации перед началом работы помещение лаборатории и внутреннее пространство ламинара облучают УФ-лучами. При длительном воздействии УФО лучи вызывают гибель всех бактерий. Бактерии погибают очень быстро, а споры грибов значительно медленнее. Поэтому в боксах устанавливают бактерицидные лампы БУФ-15 или БУФ-30, которые включаются на 30 минут за 1 час до работы. Кроме того, рекомендуется проводить профилактическое облучение боксов в течение 2 часов. Непосредственно перед работой необходимо протереть внутренние поверхности ламинара этиловым спиртом, разложить в нем необходимые инструменты и материалы: спирт в закрытой посуде, спиртовку (горелку), спички, пинцет, серологические пипетки, резиновую спринцовку и культуральную посуду. Все операции, связанные с разливом питательных сред, пересевом клеточных культур проводят в ламинарах. Ламинарный бокс (ламинар) - приспособление для работы в стерильных условиях (рис. 1). 
Рис. 1. Ламинарный бокс 2-го класса защиты. Асептические условия в ламинаре создаются с помощью отсекающего потока воздуха. Ток воздуха, проходя через хепа-фильтры ламинара, движется к исследователю, что позволяет освобождать внутреннее пространство ламинара от спор микроорганизмов. При работе с культурами животных клеток требования к стерильности более жесткие по сравнению с растительными культурами, поскольку вероятность контаминации выше. Не рекомендуется в одних и тех же боксах вести работы с микробиологическими объектами и культурами клеток. Микроорганизмы более устойчивы к внешним факторам, и простерилизовать после работы с ними помещение гораздо труднее. Все изложенное выше касается работ с непатогенным материалом. Уровни защиты при работе с патогенным материалом иные, и они требуют обеспечения большей безопасности.
Посуду выдерживают в автоклаве (рис. 2, б) под давлением в течение 20-40 минут при температуре 100-130°С. Продолжительность автоклавирования зависит от его режима: при давлении 0.5 атмосферы - 20-40 минут, при 1 атм. - 15 минут.  
а б
Рис. 2. Оборудование для стерилизации инструментов. а: автоклав Euroklav 23 V-S (Евроклав); б: - универсальный сушильный шкаф Memmert серии UNB. При сухом способе стерилизации посуду, завернутую в плотную бумагу, стерилизуют в сушильном шкафу при температуре 140°С в течение 2 часов, при температуре 180°С - 30 минут. При более высоких температурах ватные пробки буреют, а бумага становится ломкой. Стерилизация инструментов. Инструменты (скальпели, пинцеты, иглы и т.д.) стерилизуют в сушильном шкафу. Шприцы и ножницы удобнее кипятить. Металлические предметы нельзя автоклавировать: под воздействием пара они ржавеют и тупятся. Непосредственно перед работой и в процессе её инструменты помещают в стакан со спиртом и обжигают в пламени спиртовки. Стерильный инструмент используют только для одноразовой манипуляции! Перед повторным употреблением его снова окунают в спирт и обжигают. При работе все операции следует проводить в непосредственной близости от зажженной горелки, чтобы обеспечить максимальную защиту растворов от заражения. Стерилизация материалов. Вату, марлю, ватные пробки, фильтровальную бумагу, халаты, косынки стерилизуют в автоклаве под давлением 2 атм. в течение 25-30 мин. Холодная стерилизация. Органические жидкости, не выносящие нагревания, освобождаются от бактерий при пропускании через стерильные мелкопористые бактериальные фильтры с диаметром пор 0.45 мкм. 1.3. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ КЛЕТОЧНЫХ ЛИНИЙ
Для клеточных линий млекопитающих, а особенно для человеческих клеточных линий диапазон оптимального существования очень узок. Это касается и температурных условий, и состава питательных сред (необходимо строго выдерживать pH, молярность и т.д.), и газового состава. Пожалуй, наименее требовательны они к освещению. Для культивирования данных линий клеток всегда используют готовые фабричные питательные среды, а для длительного поддержания линии нужен СО2 инкубатор (рис. 3), так как при выращивании клеток в посуде типа чашек Петри и пластиковых планшетов клеткам необходим СО2 (5%). 1.3.1. Виды культур клеток Перенесение клеток целостного организма в условия жизни in vitro прекращает существование их как одного из многочисленных структурных элементов ткани или органа, в состав которых они ранее входили. При этом клетки выходят из-под контроля нейро-гуморальных факторов и приобретают ряд особенностей, зависящих как от самого факта отторжения клеток от этих тканей, так и от конкретных условий их существования in vitro. Живущие вне организма клетки или ткани характеризуются целым комплексом метаболических, морфологических и генетических черт, резко отличных от свойств клеток органов и тканей in vivo. В зависимости от методики первичной эксплантации ткани и техники ее культивирования различают несколько видов переживающих и растущих культур тканей и клеток. Наибольшее распространение имеют однослойные, а также суспензионные культуры растущих клеток. Именно они составляют основу современной лабораторной и производственной вирусологической практики. Различают два основных вида однослойных клеточных культур: первичные и перевиваемые. Термином «первичная» обозначают клеточную культуру, полученную непосредственно из тканей человека или животных в эмбриональном или постнатальном периоде. Срок жизни таких культур ограничен. По прошествии определенного времени в них возникают явления неспецифической дегенерации, что выражается в грануляции и вакуолизации цитоплазмы, округлении клеток, утрате связи между клетками и твердым субстратом, на котором они выращивались. Периодическая смена среды, изменение состава последней и другие процедуры могут лишь несколько увеличить сроки жизни первичной клеточной культуры, но не могут предотвратить ее конечной деструкции и гибели. По всей вероятности, этот процесс связан с естественным угасанием метаболической активности клеток, выведенных из-под контроля нейро-гуморальных факторов, действующих в целостном организме. Лишь отдельные клетки или группы клеток популяции на фоне дегенерации большей части клеточного пласта могут сохранить способность к росту и размножению. Эти клетки, обнаружив потенцию бесконечного размножения in vitro, при многократных перевивках дают начало перевиваемым культурам клеток. Различают линии и штаммы перевиваемых клеток. Первым термином обозначают перевиваемые клетки, характеризующиеся потенциальным бессмертием и, как правило, гетероплоидным кариотипом вторым термином — полуперевиваемые клетки с диплоидным набором хромосом и ограниченной продолжительностью жизни in vitro. Появление и тех, и других клеток связано с процессом отбора в клеточной популяции первичных культур, являющихся, таким образом, источником всех линий и штаммов перевиваемых клеток. Основное преимущество линий перевиваемых клеток, по сравнению с любой первичной культурой, состоит в потенции неограниченного размножения вне организма и относительной автономности сближающей их с бактериями и одноклеточными простейшими. Способность перевиваемых клеток к бесконечному размножению in vitro знаменует собой качественный скачок, в результате которого клетки приобретают способность к автономному существованию, подобно микроорганизмам, выращиваемым на искусственных питательных средах. Совокупность изменений, приводящих к появлению у клеток таких особенностей, называют трансформацией, а клетки перевиваемых тканевых культур — трансформированными. Усовершенствование техники культивирования клеток значительно расширило возможности получения перевиваемых клеточных линий из самых разнообразных тканей животных и человека. При этом не был обнаружен возрастной предел, выше которого ткани утрачивали бы способность адаптации к неограниченному росту in vitro, т.е. к трансформации. Другим источником перевиваемых клеточных линий являются злокачественные новообразования. В этом случае трансформация клеток происходит in vivo в результате развития патологического процесса, этиология которого во многом остается еще невыясненной. Не все злокачественные новообразования способны давать начало перевиваемым клеточным культурам. Так, например, безуспешными были попытки получить перевиваемые клетки из раковых опухолей желудка и молочных желез человека. С трудом удается адаптировать к жизни in vitro клетки плоскоклеточного рака кожи и слизистых. С другой стороны, сравнительно легко выводятся линии из тканей сарком и злокачественных опухолей нервной системы. Особую категорию клеточных культур составляют полуперевиваемые штаммы, имеющие диплоидный набор хромосом. Они выгодно сочетают в себе черты первичных и перевиваемых клеток. 
Рис. 3. CO2 инкубатор CCL-170 CelCulture. 1.3.2. Приготовление ростовой FD среды для культивирования линий опухолевых клеток человека и линий эмбриональных фибробластов человекаФибробласты и линии опухолевых клеток успешно культивируют на разных средах, но рекомендуется использовать следующий состав питательной среды:
Готовую среду и её компоненты рекомендуется хранить при температуре +4°С. 1.3.3. Пересев клеток с помощью трипсинаПеред началом работы необходимо проверить наличие всей необходимой посуды и инструментов на столе ламинара. Обработать резиновые пробки всех сосудов с растворами горящей ватой, смоченной в 70° или 96° спирте (рис. 4). Удаляют питательную среду из культурального матраса и промывают растущую культуру клеток с помощью серологической пипетки и прикрепленной к ней груши (рис. 6, а) или автоматической микропипетки (рис. 6, б) 2-3 мл фосфатного буфера(DPBS), затем его сливают и добавляют 1-2 мл подогретого 0,05% раствора трипсина (или смеси версен-трипсин). Р Когда клетки занимают все пространство культурального матраса (это видно невооруженным глазом или при помощи бинокуляра) (рис. 5), их пересевают. Пересевы производят для получения количества клеток, достаточного для цитогенетического или биохимического исследования, а также для криоконсервации. Р  ис. 5. Формирование монослоя клеток  
а б
Рис. 6. Использование серологической (а) и автоматической (б) пипеток для промывки и трипсинизации культуры клеток. Ход трипсинизации контролируют, просматривая культуры под микроскопом до появления первых признаков округления и всплытия клеток. Также о процессе трипсинизации можно судить по степени прозрачности раствора трипсина. Открепляясь от поверхности культуральной посуды, клетки выходят в раствор. При этом наблюдается его замутнение. Затем быстро нейтрализуют трипсин 2-4 мл FD среды (действие трипсина прекращается, когда объем нейтрализующей FD среды в 2 раза больше объема трипсина). Аккуратно ресуспендируют клетки пипеткой. Полученную суспензию клеток переносят в центрифужную пробирку и центрифугируют 5 минут при 1000 об/мин, далее сливают супернатант и ресуспендируют клетки в ростовой среде и высевают на новые культуральные матрасы (рис. 7). Матрас с пересаженными растущими клетками просматривают ежесуточно под микроскопом. Когда образуется монослой клеток, производят второй пересев (обычно через 3-6 суток). 1.3.4. Контроль за культурой клетокЕжедневный просмотр культуральных матрасов необходим для оценки цвета среды и её прозрачности. Резкое изменение цвета и появление мути может свидетельствовать о бактериальном или грибковом заражении. Если цвет индикатора среды не изменяется после пересева или сдвигается в сторону малинового, это может  
Рис. 7. Работа с трипсинизированной культурой клеток. а - перенос клеток в центрифужную пробирку; б - посев клеток на новые культуральные матрасы. быть связано с отсутствием размножения клеток, с недостаточным количеством для данного объема или гибелью. При помощи инвертированного микроскопа оценивается морфология клеток и монослоя в целом. В нормальных условиях фибробласты - веретенообразные вытянутые клетки с прозрачной цитоплазмой. Отсутствие рисунка на субстрате (фибробласты обладают ориентированным ростом), появление зернистости в цитоплазме, пустые места в слое клеток, распластанность клеток свидетельствует об их дегенерации в результате токсических или иных вредных воздействий.
Шлифованное покровное стекло притирают к предметному стеклу гемоцитометра до появления колец Ньютона, так, чтобы покрыть заштрихованные области. Это приводит к образованию камеры с фиксированным объемом, т.к. края предметного стекла подняты над заштрихованной поверхностью ровно на 0,1 мм. Каждая заштрихованная область состоит из 9 больших квадратов размером 1х1, т. е. объем, ограниченный каждым большим квадратом, оказывается равным 1мм х 1мм х 0,1 мм = 0,1 мм3. Р Отбирают часть клеточной суспензии пастеровской пипеткой и заполняют счетную камеру гемоцитометра, используя капиллярное всасывание, не переполняя каналы камер. Подсчитывают количество клеток в четырех больших квадратах в углах каждой из двух заштрихованных областей. Считают клетки, касающиеся правой и верхней ограничивающих линий, но не клетки, касающиеся левой и нижней ограничивающих линий. Поскольку объем большого квадрата составляет 0,1 мм3, то, умножив усредненное значение числа клеток в одном квадрате на 104, получают количество клеток в 1 мл суспензии. 1.3.6. Замораживание культивируемых клеточных линий в жидком азотеДля того, чтобы сохранить линию клеток для дальнейших исследований и экспериментов, ее можно заморозить. При замораживании клеток сначала их подвергают дезагрегации 1-2 мл раствора 0,05% трипсина. Полученную суспензию клеток центрифугируют 5 минут при 1000 об/мин, отбирают супернатант. Полученный осадок клеток ресуспензируют в смеси, содержащей 10 % ДМСО, 40 % ростовой среды FD, 50 % FВS. После чего быстро переносят полученную смесь в криоампулы. Ампулы с клетками помещают на сутки в кельвинатор на -70 ºС в специальных боксах для медленного замораживания (рис. 9, а). Важно минимизировать а б Рис. 9. Лабораторные низкотемпературные морозильные камеры DFU (-40…-86 С) (а) и сосуды Дьюара с хранилищем для биоматериалов (б). время контакта клеток с ДМСО при комнатной температуре. Для этого используют FВS и ростовую среду для фибробластов, охлажденные до +4ºС. Всю процедуру замораживания проводят максимально быстро. Через сутки ампулы переносят в жидкий азот в сосуд Дьюара (рис. 9, б), который позволяет длительное время хранить культуры в замороженном состоянии. На каждой ампуле следует написать дату заморозки, номер пассажа, название клеточной линии и количество замороженных клеток. Также следует записать в рабочий журнал количество замороженных ампул (с информацией об их содержимом) и место в сосуде Дьюара с азотом, куда поместили данные ампулы. 1.3.7. Размораживание клеточных линийДля быстрой разморозки клеток криоампулы с клетками помещают в стакан с теплой водой (37ºС) или греют в руках до полного оттаивания. Затем переносят суспензию клеток в центрифужную пробирку с 5 мл среды FD, чтобы нейтрализовать действие ДМСО. Центрифугируют 5 минут при 1000 об/мин, сливают супернатант, ресуспендируют клетки в ростовой среде и высевают на новые культуральные матрасы или чашки Петри. Получение клеточных культур. Приготовление первичных клеточных культур. Первичной - называется культура, полученная из ткани и выращиваемая in vitro до начала субкультивирования, то есть до первого посева. Первичная культура лишена многих клеток, присутствующих в исходной ткани, поскольку не все клетки способны прикрепляться к субстрату и выжить in vitro. В процессе культивирования клеток происходит относительное обеднение культуры неделящимися или медленно делящимися клетками. На первом этапе получения первичной культуры проводят стерильное удаление фрагмента ткани, органа животного и его механическую или ферментативную дезагрегацию. Ткань измельчается до кусочков объемом до 1 - 3 мм, кусочки ткани отмываются от эритроцитов раствором Хенкса с антибиотиками. Для дезагрегации ткани используют трипсин (0,25% неочищенный или 0,01 - 0,05% очищенный) или коллагеназу (200 - 2000 ед/мл, неочищенная) и другие протеолитические ферменты. Такой способ получения культуры обеспечивает высокий выход клеток. Первичные культуры могут быть также получены от кусочков ткани, объемом 1 мм, которые прикрепляются к поверхности субстрата благодаря собственной адгезивности или наличию насечек на чашке, или с помощью сгустка плазмы. В этих случаях будет происходить рост клеток из фрагментов. Клетки, мигрирующие из эксплантатов могут использоваться для пассирования. Фрагменты ткани (эксплантаты) переносятся на новые чашки, мигрирующие клетки могут удаляться пересевом, смесью версена и трипсина, а остающиеся эксплантаты будут образовывать новые выросты. Известны такие первичные культуры, как культура фибробластов куриного эмбриона, культура клеток почки теленка, лейкоциты.
Как уже отмечалось выше, одним из методов получения перевиваемых клеточных линий является отбор клеток с повышенной активностью роста и размножения из популяции первичных культур. Отбор можно осуществить при регулярной смене среды, омывающей монослой первично трипсинизированной клеточной культуры. Для этого отбирают матрасы с хорошо сформированным клеточным монослоем (сами матрасы должны иметь ровное дно и не должны иметь на стенках царапин и матовых пятен). Приготовленную для систематической смены ростовую среду разливают по небольшим сосудам (чтобы исключить бактериальное загрязнение) и хранят при t - 4°. Смену среды производят регулярно, не реже 1 раза в неделю. В течение первых 3 недель заменяют по 20 - 30% объема ростовой среды, в течение следующих 3 - 4 недель - 50 - 60%, позднее проводят полную смену среды. Свежую среду непосредственно перед работой подогревают до t - 37°. По мере смены сред клетки меняют свою морфологию. Часть клеток округляется и отпадает от стекла. Большинство клеток стягивается к центру, и монослой приобретает звездчатый вид. Сами клетки при этом несколько удлиняются. Через 7 - 10 смен среды в матрасах, как правило, начинают появляться новые клеточные элементы, причем в разных культурах они имеют разную морфологию. В культуре клеток почки куриного эмбриона в центре монослоя или между стянутыми его участками появляются округленные клеточные элементы, из которых постепенно формируются скопления в виде небольших колоний. В культуре клеток почки обезьяны появляются одиночные образования, напоминающие зерна. Клетки плотно прилегают друг к другу, образуя мелкие прозрачные колонии. Количество таких клеток нарастает медленно, размеры колоний также почти не увеличиваются. Колонии появляются не только на дне матраса, но также на боковых поверхностях, на границе питательной среды. Поэтому обязательным условием при смене питательной среды является поддержание ее постоянного объема. В культуре клеток почек эмбриона человека на фоне массовой дегенерации стянутого в тяжи монослоя выявляются крупные полигональные клетки с длинными отростками. Возникшие в процессе отбора атипичные клеточные элементы должны быть отделены от остальных участков монослоя и перенесены в отдельные пробирки или матрасы. Для этого может быть использован метод версенизации или механический откол атипичных клеток с помощью бактериологической петли или шпателя. Последний способ особенно необходим при работе с культурой клеток почек обезьяны, где колонии атипичных клеток плотно прикреплены к стеклу и сами от него не отделяются. При смене питательной среды в случае появления атипичных клеток рекомендуется осторожно удалить большую часть ростовой среды, а меньшей частью энергично отполоскать монослой и эту среду разлить по пробиркам. В этом случае в среде могут оказаться атипичные клетки, обладающие способностью образовывать колонии, пригодные для дальнейших пересевов. После переноса культуры атипичных клеток в новую посуду наблюдение за основной культурой целесообразно продолжить, так как процесс выведения новой клеточной линии весьма сложен, и далеко не всегда отобранные атипичные элементы дают начало жизнеспособной линии перевиваемых клеток. Необходимо, чтобы вся работа по получению новых клеточных линий, продолжающаяся в течение многих месяцев, проводилась с одними и теми же питательными средами, сыворотками животных и сериями антибиотиков. Известны такие первичные культуры, как культура клеток почки золотистого хомячка (BHK), культура клеток почки сибирского горного козерога (ПСГК), культура клеток почки зеленой мартышки (CV).
До недавнего времени тканевые культуры применялись в вирусологии преимущественно в виде однослойных стационарных культур. Во многих случаях этот метод выращивания клеток является незаменимым. Многолетний опыт показывает, что при использовании однослойных стационарных культур встречается ряд трудностей, связанных с огромными затратами рабочего времени и материалов. С этой точки зрения, более выгодны роллерные культуры, которые экономичны, характеризуются оптимальным отношением полезной площади культивирования к объему питательной среды и открывают благоприятные возможности для накопления клеточной массы. Термин «роллерные культуры» обозначает метод культивирования, при котором клеточный монослой располагается по всей цилиндрической поверхности горизонтально вращающихся сосудов и периодически омывается питательной средой. В силу определенных причин некоторое количество клеток может в отдельных случаях быть взвешено в культуральной среде. В подобном варианте культуру клеток называют роллерно-суспензионной. "Урожайность" клеточной культуры будет тем больше, чем больше площадь, с которой собирают клетки. Исследователи использовали различные пути увеличения площади поверхности, на которой происходило прикрепление и размножение клеток. Для этого применяли различного характера основы с большой удельной поверхностью: твердую, губчатую, из шерсти, коллагена, на стеклянных спиралях и т. д. Широкого распространения эти методы не получили, так как значительно затрудняли манипуляции с клетками, но следует отметить описанную Л. С. Ратнером и В. А. Крикуном методику многоярусного культивирования. Клетки культивировали в 1,5, 10 и 15-литровых бутылях, полностью загруженных овальными стеклянными трубками, расположенными параллельно продольной оси сосудов. Полезная площадь при этом возрастала по сравнению со стационарными однослойными культурами в сосудах того же объема в 20 раз. Культивирование проходило в 2 этапа. На первом этапе бутыли вращали вокруг горизонтальной оси с целью равномерного распределения клеток. В дальнейшем, когда клетки прикреплялись к стеклу, культивирование продолжалось в стационарном положении. Описанная культуральная система была успешно использована для культивирования вируса ящура. Более эффективным оказалось вращение сосудов, в которых происходило размножение клеток. Вначале клетки выращивали в пробирках, но с развитием технического оснащения возросли объемы культуральных сосудов, и от выращивания клеток во вращающихся пробирках исследователи перешли к вращающимся бутылям. Роллерные культуры стали применяться как для накопления клеток, так и размножения вирусов. Для роллерного культивирования используются специальные стеллажно-ярусные аппараты для вращения бутылей или барабаны. Чаще всего для культивирования используют 0,5—3-литровые бутыли. В производственных условиях объем их может достигать 20 литров и более. Аппараты для роллерного культивирования просты, надежны и обслуживание их несложно. Большое значение имеет скорость вращения бутылей. Она не должна быть слишком большой, чтобы не препятствовать прикреплению клеток, но и не слишком низкой, так как длительное нахождение клеток в газовой фазе ухудшает условия их питания. В работах разных авторов скорости вращения бутылей варьировали от 8—12 об/час, до 1 об/мин. Наиболее пригодной для различных клеточных культур оказалась скорость вращения флаконов в пределах 0,5—1 об/мин. Рекомендуется в течение первых 30 мин. после засева клеток обеспечить высокую скорость вращения флаконов (0,5—1,0 об/мин) для равномерного распределения материалов, затем перевести их на низкую скорость вращения (20—30 об/час). Посевная концентрация в 1 мл среды составляет для клеток СПЭВ, ВНК-21, HeLa, L - 60-80 тыс., для диплоидных клеток 100-200 тыс., для первичных культур - 200-300 тыс. Объем ростовой среды должен составлять 1/10, 1/20 часть объема роллерного флакона. Роллерный метод культивирования позволяет получить большее количество клеток. Так, с флакона емкостью 3 л можно получить урожай клеток HeLa в 8 раз, ВНК-21 - в 9 раз, АО - в 11 раз больший, чем с монослойной стационарной культурой флакона емкостью в 1 л. Кратность экономии сред при использовании 3-литровых флаконов составляет для клеток HeLa 2,8; ВНК-21 - 5,0, АО - 4,0. Способностью к росту и размножению в роллерных условиях обладают субкультуры, перевиваемые культуры и реже первичные, а также диплоидные штаммы клеток. Для лучшего размножения клеток в роллерных аппаратах необходима адаптация их к новым условиям культивирования. Роллерный метод культивирования позволяет получить большие количества клеток. Преимуществом роллерных культур по сравнению с традиционными стационарными культурами является, в частности, более экономичное использование питательных сред и более высокий выход вирусного антигена (на 1—2 lg). Культивирование клеток на микроносителях В 1967 г. Van Werel предложил метод культивирования, сочетающий элементы монослойного и суспензионного выращивания клеток, который он назвал методом «микроносителей». Суть его заключается в том, что клетки прикрепляются и размножаются на поверхности полимерных шариков-частиц «микроносителей» (МН), которые содержатся в суспензии с помощью перемешивающего устройства, например мешалки. На одной частице МН диаметром 160—230 мм может поместиться 350-630 (или в среднем 460) клеток. В одном мл среды можно суспензировать несколько тысяч частиц микроносителя, при этом общая площадь их составит от нескольких до 50 см2/мл. Инокулированные в культиватор клетки прикрепляются к поверхности частиц МН и размножаясь, образуют сплошной монослой на каждой отдельной частице. Основными преимуществами этого метода являются: 1) создание равномерных условий по всему объему сосуда, что делает возможным эффективно контролировать необходимые параметры (рН, р02 и др.); 2) получение высокой плотности клеточной популяции до 5-6 млн. клеток в 1 мл; 3) культивирование одновременно несколько сот миллиардов клеток; 4) введение постоянного контроля за динамикой роста клеток; 5) снижение роста контаминации в связи с сокращением операций, связанных с разгерметизацией культураль-ного сосуда; 6) значительная экономии питательных сред; 7) возможность сохранять выросшие клетки непосредственно на частицах при низких температурах; 8) возможность искусственно создавать различные концентрации МН с выросшими на них клетками; 9) возможность пассирования культуры без применения трипсина путем добавления свежих порций микроносителя. Микроносители должны иметь: - небольшой положительный заряд в пределах 1,5-1,8 МЭКВ/г. В связи с тем, что большинство клеток животных имеют слабо отрицательный заряд, они легче будут прикрепляться к такому МН: - плотность 1,05—1,15 г/см; указанная плотность является оптимальной для поддержания МН во взвешенном состоянии; - диаметр частиц от 100 до 250 мкм, что обеспечивает площади для роста нескольких сотен клеток; - гладкую поверхность; - прозрачность; - отсутствие токсичности компонентов для клеток; - незначительное впитывание компонентов среды; - универсальность, обеспечивающую возможность использования их для первичных, диплоидных и гетероплоидных клеток. Немаловажное значение имеют свойства МН, которые позволяют использовать их многократно. Проведено исследование многих гранулированных препаратов различной химической природы, в том числе из поперечно-сшитого (ПС) декстрана, ПС-агарозы, ПС-поливинилпиролидона, полиакрилнитрита, пористого селикагеля, полистирола, капрона, нейлона, алюмосиликата с целью использования их как микроносителей. Пригодными являются только некоторые из них, главным образом имеющие в своей основе ПС-декстран. Несколько зарубежных фирм разработали коммерческие препараты микроносителей, готовые к употреблению: Цитодекс-1, 2, 3 (Франция, Швеция), Супербит (США, Англия), Биосилон (Дания). Стоимость перечисленных препаратов довольно высока, поэтому необходимо проводить исследования по разработке и производству отечественных МН. Культивирование клеток на микроносителях проводят в обычных ферментерах для суспензионного культивирования. В ферментере не должно быть каких-либо выступов, карманов, чтобы предотвратить накопление микроносителей в застойных зонах. Поэтому разумно использовать ферментеры с круглым дном и гладкими стенками. Внутренняя поверхность ферментера должна быть силиконизирована для предотвращения прилипания микроносителей к стеклу или нержавеющей стали ферментера. Для контроля за окружающими культуру условиями такими, как рН и О2, может быть использовано стандартное оборудование. Скорость перемешивания суспензии с носителем должна быть 40-60 об/мин. Для выращивания на МН применяются различные типы клеток. Концентрация цитодекса может варьировать от 0,5 до 5 мг/мл. Однако, при производстве профилактических вакцин, применяют обычно конечную концентрацию цитодекса, не превышающую 1 мг/мл. Повышение концентрации до 3 мг/мл и выше создает дополнительные трудности, связанные с необходимостью перфузии питательной среды и частичной ее замены, что осложняет технологический процесс. Посевная концентрация клеток, а также условия культивирования на МН в первые часы в значительной степени определяют оптимальные параметры для пролиферации и максимального накопления клеток. Показано, что посев 10 клеток/мл перевиваемой линии почек обезьян (Vero) и диплоидных клеток фибробластов эмбриона человека (MRC-5) в уменьшенном до 1/3 объема питательной среды и при периодическом включении мешалки (30 об/мин) на одну минуту через каждый час в течение 4 часов, с последующим добавлением питательной среды до конечного объема, ведет к увеличению пролиферации клеток и их количества по сравнению с контролем (полный объем питательной среды в момент посадки клеток и непрерывная работа мешалки с начала культивирования). Важное значение для культивирования клеток на МН имеет питательная среда. Правильный подбор питательной среды также будет способствовать оптимизации процесса пролиферации клеток и их качество. Необходимо проводить подбор питательных сред для культивирования клеток на различных типах МН. Показано, что перевиваемая линия клеток почек обезьян (Vero) на цитодексе дает наибольший выход при использовании среды Игла ДМЕ (посадочная концентрация клеток 105 мл) но сравнению со средой ВМЕ и 199. Если же количество клеток при посадке снизить до 104, то лучшие результаты дает среда 199. Все испытуемые среды содержали 10% фетальной сыворотки. жүктеу/скачать 7.03 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|
