Методические подходы к исследованию влияния вирусов на клеточные культуры

2.1.1. Подготовка сеточек для электронно-микроскопического исследования суспензий

Наиболее удобным способом изучения суспензий в просвечивающем электронном микроскопе является нанесение ее на тонкую пленку-подложку, лежащую на медной или никелевой электронно-микроскопической сеточке (рис. 11).

В том случае, если сетки используют повторно, перед процедурой промывания их обрабатывают ультразвуком. Сетки помещают в стеклянную колбу с дихлорэтаном и погружают в ультразвуковую ванну, наполненную водой. При использовании ультразвуковой ванны с пьезокерамическим преобразователем с выходной мощностью 0,06 кВт обработку проводят при 37 или 44 кГц в течение 10 - 15 мин. При использовании ванн с большей мощностью время обработки можно снижать пропорционально мощности, но не меньше 5 мин.

Пленка-подложка, выполняющая роль предметного стекла в световом микроскопе, должна быть по возможности более прозрачной. Для этого она должна изготавливаться из вещества с малым удельным весом и с низкой рассеивающей способностью, быть достаточно прочной, чтобы выдерживать все необходимые манипуляции, изменение давления, электронную бомбардировку и нагревание. Подложка не должна заряжаться под действием электронной бомбардировки.

Наиболее просты методы получения пленок с помощью 2% растворов коллодия или формвара (поливинилформальдегид).

Ниже приведены способы приготовления таких пленок.

Для приготовления пленки используют 0,3% раствор формвара в дихлорэтане (хлороформе). Для этого 30 мг формвара помещают в мерную колбу с притертой крышкой и добавляют туда 10 мл химически чистого дихлорэтана. Полное растворение достигается за 3 дня. Можно использовать также 2% раствор формвара в хлороформе. Раствор хранят в темноте!

Затем последовательно выполняют следующие действия:

• 
  опустить чистое предметное стекло в емкость с формваром на 5-10 сек;
  
• 
  вынуть стекло и поставить его ребром на фильтровальную бумагу для удаления излишков формвара, высушить в течение 1 мин;
  
• 
  процарапать препаровальной иглой прямоугольник по краю стекла;
  
• 
  в широкую емкость (например, кристаллизатор), налить дистиллированную воду до образования выпуклого мениска;
  
• 
  удалить пыль с поверхности воды с помощью стеклянной палочки или пипетки. Удаление пыли обязательно, иначе пыль попадет на формваровую пленку;
  
• 
  коротко подышать на стекло с формваровой пленкой и медленно погрузить его в емкость с водой. В процессе погружения формваровая пленка отделится от стекла;
  
• 
  с помощью пинцета поместить вымытые бленды на поверхность пленки. Пленка с сетками вылавливается на чистое предметное стекло, которое помещают в чашку Петри для последующего высушивания.
  

Испарение углерода производят в вакуумных установках при разрежении 10-5–10-8 мм. рт. ст. В качестве источника углерода применяют спектрально чистые стержни диаметром 2–6 мм. Конец одного угольного стержня затачивается в виде острого конуса, а второй стержень спиливается по наклонной плоскости. Наклонная плоскость стержня располагается таким образом, чтобы основной поток атомов углерода направлялся в сторону предметного стекла, на которое напыляется углерод. При пропускании тока силой около 20А в месте контакта происходит резистивный разогрев стержней и испарение углерода.

Обычно слой углерода наносят на пленку из поливинилового спирта, покрывающую предметное стекло. Для оценки толщины напыляемой пленки рядом с предметным стеклом помещают кусочек белого фарфора с каплей диффузионного масла. При напылении фарфор постепенно темнеет, а под каплей масла остается белым. Требуемая толщина пленки 10 – 20 нм получается при окрашивании фарфора в коричневый цвет.

После напыления предметное стекло с двойной пленкой извлекают из вакуумной установки, насекают пленку острым лезвием на квадратики со стороной 3 – 10 мм и погружают предметное стекло в чашку Петри, наполненную горячей водой. При этом поливиниловый спирт быстро растворяется и углеродная пленка всплывает на поверхность. При помощи пинцета под квадратики подводят медные или никелевые сеточки (или бленды), вылавливают пленку и помещают на фильтровальную бумагу для высушивания.

Если очень тщательно очистить поверхность стеклянной пластинки, то можно напылять углерод непосредственно на нее и отделение углеродной пленки проводить в горячей воде.

2.1.2. Прямое электронно-микроскопическое исследование вирусов в суспензиях

1. Материал, содержащий вирус, ресуспендируют в электронно-микроскопической краске для негативного контрастирования до получения полупрозрачной суспензии. Краска для негативного контрастирования представляет собой 2%-ный раствор фосфорно-вольфрамовой кислоты в дистиллированной воде.

2. Для получения электронно-микроскопического препарата капельку суспензии помещают на электронно-микроскопическую медную или никелевую сетку (или бленд) пленкой-подложкой. Во время этой операции сетку держат парой тонких пинцетов.

3. Препарат оставляют на воздухе на 30 сек.

4. Излишки жидкости удаляют, прикасаясь к краю сетки фильтровальной бумагой.

5. Препарат высушивают на воздухе.

6. В случае необходимости жизнеспособный вирус инактиви-руют, облучая обе стороны сетки ультрафиолетом с интенсивностью 440 000 мкВт-с/см². При этом используют коротковолновую ультрафиолетовую лампу с фильтром. Лампа должна находиться на расстоянии 15 см от сетки; время облучения каждой стороны — 5 мин.

7. Вирионы анализируют под трансмиссионным электронным микроскопом с увеличением от 30 000 до 50 000.

2.1.3. Иммуноэлектронная микроскопия

1. 10 мкл антисыворотки к исследуемому вирусу в 100 раз разводят PBS (фосфатно-солевой буфер). Раствор нагревают в водяной бане до 56°С.

2. Обычным способом расплавляют 10 мл 2%-ной агарозы в PBS и охлаждают до 56 °С в водяной бане.

3. При 56 °С смешивают 1 мл разведенной антисыворотки с 1 мл 2%-ной агарозы.

4. Переносят по 200 мкл полученной смеси в две лунки 96-луночного планшета для микротитрования.

5. Агарозе дают застыть при комнатной температуре. Планшет можно хранить при 4°С в течение нескольких недель, если заклеить его клейкой лентой.

6. В лунку, содержащую смесь агарозы с антисывороткой, вносят 10 мкл сыворотки, содержащей вирус.

7. Сетку для электронной микроскопии с заранее приготовленным углеродно-формваровым покрытием (см. раздел 2.1.1.) кладут менее блестящей стороной на каплю сыворотки.

8. Сетку выдерживают 2 ч при 37 °С во влажной камере.

9. Тонким пинцетом достают сетку и наносят каплю 2%-ной фосфорно-вольфрамовой кислоты на ту поверхность сетки, которая находилась в контакте с сывороткой.

10. Через 30 сек отмывают избыток краски, высушивают препарат и инактивируют вирус.

Агрегированные вирусные частицы исследуют под трансмиссионным электронным микроскопом при увеличении от 30000 до 50000.

2.1.4. Электронно-микроскопическое изучение тонких срезов клеточных культур

Весь процесс приготовления электронно-микроскопических препаратов можно разбить на 6 основных этапов. Это: фиксация, обезвоживание, пропитка смолой и полимеризация, ультрамикротомирование - приготовление ультратонких срезов, контрастирование. В данном методическом пособии наиболее подробно будут рассмотрены первые четыре этапа, так как в случае культуры клеток они имеют некоторую специфику.
В силу особенностей просвечивающей электронной микроскопии, препараты представляют собой срезы материала толщиной 40-60 нм. Направление резки материала может представлять дополнительную информацию об ультраструктурном строении клеток и пространственном распределении внутриклеточных компонентов в живой клетке. Так различают три вида заливки материала, которые позволяют получать срезы 1) параллельные плоскости прикрепления клеток к субстрату, 2) перпендикулярные этой плоскости и 3) срезы клеток, ориетированных случайным образом. Для первых двух случаев клетки выращиваются на кусочках специальной подложки (Film, Agar), которые затем вместе с клетками проходят пробоподготовку для электронной микроскопии. В случае если подложка ориентирована параллельно плоскости ножа, получают плоско-параллельные срезы клеток. Этот тип ориентации образцов часто используется для исследования цитоскелета клеток и связанных с ним структур. Однако этот подход требует высокого уровня навыков ультрамикротомирования, так как количество срезов, которые можно получить с таких образцов ограниченно толщиной клетки, особенно той области, которая является с одной стороны максимально обширной, а с другой максимально информативной в плане насыщенности цитоплазматическими органелами. В зависимости от морфологии клеток, размер этой области значительно варьируется, а в случае распластанных клеток, как на-пример фибробласты, может составлять несколько микрометров.

Подложка с клетками может также быть оринтирована перпендикулярна плоскости ножа. В этом случае получаются срезы клеток, захватывающие верхнюю и нижнюю плазматические мембраны, что позволяет проводить качественный и количественный анализ ультраструктуры клеток в вертикальном направлении. Особенно популярен этот вид ориентирования образцов при исследовании ультраструктур, отвественных за прикрепления клеток к субстрату. Но в данном случае ультрамикротомирование захватывает как сами клетки так и подложку, на которой они росли. Так как твердость подложки и смолы, в которую заключен образец, значительно отличаются, это создает трудности при ультрамикротомировании образцов и влияет на качество препаратов.

Перечисленные методы приготовления безусловно дают дополнительные данные для исследователей, однако сопряженные с ними трудности, часто делают их менее привлекательными для использования. Наиболее простым методом приготовления клеток является их трипсинизация, как было описано выше, фиксация и заключение в агарозные блоки. Однако при трипсинизации меняется морфология клеток, реорганизуется цитоскелет, также как нарушаются межклеточные контакты.

Одним из оптимальных компромиссов является метод, который позволяет провести стандартную пробоподготовку большого количества клеток, ориентированных случайным образом, но сохранивших морфологию, характерную для прикрепленной культуры. При этом методе клетки фиксируются непосредственно в культуральном сосуде, без предварительного открепления от субстрата, затем снимаются при помощи скребка (рис. 12) и заключаются в агарозу. С использованием последнего метода будут рассмотрены все этапы приготовления препаратов культуры клеток для просвечивающей электронной микроскопии.

Рис. 12. Снятие клеток скребком после фиксации в культуральном сосуде без предварительной трипсинизации.
Фиксация. Перед фиксацией клетки отмывают от культуральной среды 2 раза по 5 мин фосфатным буфером. Время воздействия фосфатного буфера необходимо минимизировать, чтобы не внести изменения в морфологию клеток. В качестве фиксатора используется 2,5% раствор глютарового альдегида на натрий какодилатном буфере (0,1М рН 7,2). Внимание! Растворы натрий какодилата ядовиты! Следует избегать вдыхание их паров и попадание в организм через рот и кожу!

В силу монослойного характера культуры, время фиксации при комнатной температуре составляет 30 мин. Удобно, что в таком фиксаторе материал можно хранить несколько дней при +4⁰ С, что позволяет проводить накопление материала для последующей пробоподготовки. Клетки отмываются от фиксатора тем же буфером 3 раза по 5 минут, соскребают скребком, добавляют буфер и осаждают центрифугированием. Время и скорость центрифугирования как правило составляет 1000 оборотов/мин 5 мин, но в некоторых случаях, когда клетки снимаются обширными участками, эти параметры приходится подбирать экспериментально.

Заключение суспензии клеток в агарозу. Один из способов иммобилизации мелких объектов в фиксированном объеме является заключение их в агарозу, что позволяет в дальнейшем отказаться от осождения клеток центрифугированием. Застывшая агароза создает крупнопористый гель, через который легко проникают водные растворы и смолы, поэтому этот подход широко используется в электронной микроскопии клеток, дрожжей и т.д. Для этого 2% раствор агарозы, доводится до кипения в микроволновой печи, смесь охлаждается до 37⁰ С, и при помощи водного термостата поддерживается при такой температуре на протяжении всего времени манипуляций с клетками. Предварительно необходимо прогреть до 37-40^О С носик пипетки со срезанным кончиком, для того чтобы предотвратить полимеризацию агарозы на охлажденном носике. Смешав в носике равные объемы 2% агарозы и осадка фиксированных клеток, полученную смесь выдавливают тонкой полоской на охлажденную до +4⁰С фольгу. Застывшая смесь формирует объемную полоску, которая затем разрезается лезвием на блоки длиной 3-4 мм. Полученные блоки переносятся во флакон с буфером комнатной температуры для предотвращение высыхания материала.

.

Постфиксафия. Следующий этап - постфиксация образцов в четырехокиси осмия - OsO4. Известно, что этот фиксатор взаимодействует с липидами по месту двойных связей. Образование поперечных связей вызывает сшивку молекул липидов, что снижает их растворимость и предотварящает экстракцию в процессе обезвоживания образцов в спиртах и ацетоне. В преапаратах, не прошедших постфиксацию в четырехокиси осмия, наблюдается негативное изображение всех мембраных струтур. Они выглядят как светлые линии, ограниченные прилежащим материалом. Что касается взаимодействия OsO4 с белками, то в этом вопросе ясности еще нет. По-видимому, OsO4 способствует образованию попречных связей между молекулами белков, реагируя главным образом с триптофаном, цистеином и гистидином. Четырехокись осмия продается в запаенных ампулах, содержащих, как првило, по 1 г вещества. Концентрированный раствор OsO4 -4% готовят заранее, растворяя вещество в дистилированной воде. Раствор для фиксации содержит 1% раствор OsO4 на натрий какодилатном буфере (0,1М, 7,2 рН). Продолжительность фиксации при комнатной температуре составляет 1 час или в течении ночи при 4^ОС. Затем образцы тщательно отмываются дистиллированной водой 3 раза по 5-7 минут.
Дегидратация. Дегидратация или обезвоживание образцов проводится в растворах спиртов возрастающей концентрации. Рекомендуется приготовить растворы заранее, некоторые исследователи предпочитают использовать растворы спиртов охлажденные до 4^ОС, для предотвращения экстракции различных компонентов клеток. Обезвоживание проводится по следующей схеме:

30^{0 -} 15 мин,

50^{0 -} 15 мин

70⁰ - 15 мин

96⁰ - 15 мин

100⁰ спирте - 15 мин

ацетон две смены по 10 минут.

Для того чтобы получить абсолютный спирт, необходимо провести обезвоживание 96% спирта при помощи прокаленного медного купороса (сульфат меди). В основе этого метода лежит свойство сульфата меди отдавать и присоединять молекулы воды, меняя при этом свой цвет (прокаленный сульфат меди имеет вид серовато-белого порошка; который по мере присоединения воды приобретает синюю окраску). Насыпав порошок прокаленного медного купороса (примерно 10 г на 100 мл спирта) в чистую стеклянную бутылку с притертой пробкой, наливают туда же 96% спирт. Затем бутылку встряхивают до равномерного распределения порошка. Подобную процедуру повторяют на протяжении 1—2 дней. По мере поглощения воды порошок приобретает синюю окраску. Однократная обработка, как правило, не дает обезвоживания, поэтому спирт переливают в другой сосуд, содержащий свежую порцию сульфата меди. Подобную процедуру повторяют до тех пор, пока осадок не перестанет приобретать голубой цвет. Обезвоженный спирт отфильтровывают в чистую посуду, которую плотно закрывают. Желательно проверить рН абсолютного спирта, как после обработки сульфатом меди он может стать слегка подкисленным. Для нейтрализации достаточно прибавить небольшое количество карбоната кальция (СаСОз). Если в лаборатории нет фабричного порошка безводного сульфата меди, то его можно приготовить самим, прокалив кристаллическую соль над огнем в широкой фарфоровой чашке (до тех пор, пока из синих кристаллов не образуется белый порошок). для равномерного прокаливания необходимо перемешивать купорос стеклянной палочкой. Следует помнить, что порошок медного купороса сильно раздражает слизистые оболочки. Нужно проводить прокаливание в вытяжном шкафу.
Пропитка. Смесь компонентов, вхдящих в состав смолы, проводят тщательно, избегая образования пузырьков воздуха. Компоненты отмеряют либо при помощи весов, либо с использованием мерного цилиндра и пипетки в следующем соотношении:

Эпон 812 10 мл (12 г)

HY 964 8 мл (8г)

MNA 4 мл (5г)

катализатор полимеризации DMP30 0,65 мл (0,5г)

Добавлении пластификатора дибутилфталата 1,5-2% от объема смеси позволяет регулировать твердость смолы, что облегчает в последствии ультрамикротомирование.

Затем обезвоженные образцы последовательно инкубируются в растворах смолы с ацетоном в следующих пропорциях:

а) смола : ацетон = 1:3 на 30 мин.

б) смола : ацетон = 2:2 на 30 мин.

в) смола : ацетон = 3:1 на 1-1,5 часа

г) чистая смола на 1-1,5 часа

После этого образцы переносятся в формы для заливки, которые заполняются свежей смолой и выдерживаются в течении ночи при комнатной температуре в закрытом сосуде, для завершения пропитывая образцов. Затем формы помещаются в термостат на 60⁰ на 2-3 для полимеризации. В готовых блоках ясно прослеживается положение образца, что позволяет заточить блок таким образом чтобы на вершине пирамидки оказался исследуемый материал. Горизонтальная плоскость затачивается, как правило, в виде трапеции, что позволяет в дальнейшем определить положение интересующего участка на полутонком срезе.
Микротомирование. Полутонкие срезы толщиной 0,5 мкм, режут на ультрамикротоме стеклянным ножом согласно инструкции к оборудованию, предоставленной производителями. Готовые срезы переносят на предметное стекло в каплю воды и высушивают над спиртовкой или на гистологической плитке до полного испарения воды. Одна из проблем, с которой может столкнуться исследователь на данном этапе, это смывание срезов при дальнейшем окрашивании. Это происходит из-за слабого приклеивания срезов к поверхности предметного стекла, как правило из-за загрязнения стекла, обезжиривание стекол 70% спиртом в течении 15-20 мин, обычно позволяет справиться с этой проблемой, также можно помещать срезы в 10% раствор ацетона, что также способствует лучшемы приклеиванию срезов.

Срезы окрашиваются 1%-ным раствором метиленового синего (или толуидиного синего, тионином, азур-эозином, гематоксилином и эозином и т.д. в зависимости от задач исследования) с добавлением 1%-ного раствора тетрагидробората натрия в течение 2 минут при нагревании стекла со срезами над спиртовкой. Затем препараты промываются дистилированной водой, подсушиваются и анализируются под световым микроскопом. Представленные виды обзорного окрашивания позволяет определить морфологию клеток, выявить черты характерные для различных стадий клеточного цикла и физиологического состояния клеток. В зависимости от задачи исследования выбирается участок для будущих ультратонких срезов и повторно затачивается пирамидка, вершина которой представляет интересующую область.

Ультрамикротомирование - получение срезов толщиной 50-80нм, выполняют с использованием алмазного ножа, при отсутсвие алмазного ножа, можно использовать стеклянный нож, но в этом случае количество качественных срезов, нарезанных одним ножом, ограниченно. Как правило на одном участке ножа первые 2-3 среза являются наиболее качественными, в дальнейшем качество срезов снижается, на них могут появиться поперечные и продольные полосы, и место на ноже приходится менять. Готовые срезы переносят на специальные медные или никелевые сеточки, предварительно тщательно промытые в ацетоне. Обезжиривание сеточек в органических растворителях способствует плотному и стойкому приклеиванию срезов к поверхности сетки, что влияет на конечное качество электронно-микроскопического препарата.
Контрастирование. Если посмотреть на препараты, не прошедшие этап контрастирования, в электронный микроскоп, то материал будет выглядить бледным, слабо-контрастным, но опытный микроскопист с легкость опознает на срезе основные структуры клетки. Это происходит из-за накопления в компанентах клеток, фиксаторов - глутарового альдегида и четырехокиси осмия, которые кроме фиксирующих свойств обладают контрастирующими. Так фиксация глутар альдегидом хорошо контрастирует хроматин и частично лизосомы, несколько слабее - ядрышко и рибосомы в цитоплазме, умеренный контраст имеют матрикс митохондрий и цитоплазмы. Четырехокись осмия активно реагирует с этиленовыми группами ненасыщенных липидов, фиксируя и контрастируя таким образом мембраны клетки и липосомы. Улучшение контраста может быть достигнуто путем избирательного повышения плотности структур. Для этой цели пригодны контрастирующие вещества с высоким молекулярным весом, лучше всего тяжелые металлы и их соединения. При контрастировании биологического материала увеличение электронной плотности определяется общим числом захваченный тканью атомов или молекул контрастирующего вещества. Таким образом, окончательная электронная плотность зависит от массы молкул (атомов) контрастирующего вещества и от числа захваченных тканью молекул (атомов) этого вещества. К элементам, используемым для контрастирования, относятся: свинец, уран, вольфрам, осмий, марганец, а также иод, железо, труть, барий, ванадий, хром, золото, серебро, никель, лантан, рутений, платина, индий, висмут, стронций и торий. В данном методическом пособии мы остановимся лишь на некоторых общеупотребительных контрастирующих веществах.
Контрастирование уранилацетатом. Катион уранила связывается с фосфатными и карбоксильными группами, контрастируя практически все структуры клетки. Контрастирование уранилацетатом можно осуществлять после фиксации образцов в четырехокиси осмия, отмытые дистилированной водой образцы инкубируются в течении ночи при 4^ОС в водном растворе 2% уранилацетата. Затем промываются 3 раза по 5-10 мин дистилированной водой и подвергаются дегидратации. Также контрастирование уранилацетатом можно проводить на срезах. Водный или спиртовой раствор 1% уранилацетата помещают в виде капли на тефлоновую подложку или или пленку парафилм, сетоку со срезами помещают на каплю и инкубируют в течении 5-15 мин. В зависимости от свежести реактива и образца этот параметр может варьировать. Время инкубации зависит от скорости диффузии уранилацетата в ткани, как было показано экспериментально, за 20 мин катин уранила способен проникнуть в ткань, залитую в эпон, на глубину большую чем толщина ультратонкого среза, поэтому увеличивать время инкубации больше чем на 20 мин не имеет смысла. По оканчании окрашивания сетки тчательно промываются дистилированной водой не менее 2 мин.
Контрастирование свинцом. Замечательные качества солей свинца как контрастирущего агента были отмечены еще в 1942 году. Использование солей свинца в качестве контрастирующего агента осложняется образованием нестворимого карбоната свинца и других нежелательных осадков, которые выпадают в виде мерких гранул на препаратах, значительно ухудшая их качество. Для преодоления этого недостатка был предложен целый ряд модификаций метода, среди которых наиболее популярна модификация Рейнольдца:

В узкую пробирку с притертой крышкой на 15 мл наливают 6 мл бидистиллированной воды и добавляют 2,28 г. Pb(NO3)2 и 0,325 г. Na3(C6H5O7). Раствор непрерывно перемешивается в течение 30 мин до образования гомогенного белого раствра, затем по каплям, осторожно перемешивая, добавляется 1N NaOH для увеличения pH, пока раствор не станет прозрачным. После этого объем раствора доводится до 10 мл. Важно хранить раствор без доступа воздуха (обычно для этого используется медицинский шприц) при 4^ОС.

Контрастирование цитратом свинца проводят на срезах, для этого на тефлоновую подложку или пленку Парафильм помещают капли раствора, обкладывают их гранулами NaOH и закрывают чашкой Петри. Эти предосторожности позволяют снизить содержание СО2 и предотвратить выпадение нерастворимых солей свинца. Продолжительность контрастирования может варьироваться от 3 до 15 мин, и, как правило, подбирается экспериментально. По оканчании окрашивания сетки тчательно промываются дистилированной водой не менее 2 мин. Внимание! Свинец ядовит! Следует избегать вдыхание его паров и попадание в организм через рот и кожу!
Контрастирование рутениевым красным. Сведения о гликокаликсе были существенно дополнены благодаря методу контрастирования рутениевым красным в модификации Люфта. В своих опытах in vitro Люфт доказал, что рутениевый красный реагируют с веществами, которые обладают умеренным или сильным отрицательным зарядом. Это могут быть, главным образом, кислые углеводные соединения, входящие в состав гликокаликса клеток и внеклеточного матрикса (рис. 13). Как предполагают, реакция начинается с образования связи между катионом рутеневого красного и кислым углеводом, при этом субстрат окрашивается в красный цвет, но электронно-микроскопическое контрастирование происходит лишь в процессе обработки четырехокисью осмия, при котором в результате окислительно-востановительной реакции, катализируемой рутениевым красным, низшие окислы осмия осаждаются на окисленном субстрате. Учитывая это, а также в связи





Рис. 13. Выявление рутениевым красным кислых углеводных соединений в гликокаликсе клеток и во внеклеточном матриксе. Электроннограмма. Бар соответствует 1 мкм.
с тем, что рутениевый красный плохо проникает в биологический материал (мол. вес 858,5, высокий электроположительный заряд) его добавляют непосредственно в глютар альдегидрый фиксатор в концентрации 0,5 мг/мл. В результате использования этого контрастирующего агента, на препаратах хорошо виден гликокаликс клеток, внеклеточный матрикс, а также внутриклеточные кислые мукоиды.

2.2. Подготовка опухолевых клеточных линий, зараженных ВБН, для электронномикроскопического анализа

В качестве примера методического подхода подготовки культур клеток для электронно-микроскопического анализа, приведен протокол исследования, целью которого было выявления механизмов взаимодействия ВБН с опухолевыми клетками.
Используемые в работе клеточные линии были посажены на 6-ти луночные планшеты. Через сутки после посадки были заражены ВБН..

Забор материала производили через 3 часа, сутки, 5 дней, 10 или 12 (для ВБН «Адыгея» и «Голубиный» соответственно) после инфекции.

Пробоподготовку проводили по модифицированной нами стандартной методике, что позволило в большей степени сохранить структуру культуральных клеток.

Клетки фиксировали через 3 часа, 1 сутки, 5 суток и 10 суток после обработки вирусом. Фиксацию проводили в 2,5%-ном глутаральдегиде на 0,1 М Na-какодилатном буфере и в 2,5% глутаральдегиде на 0,1 М Na-какодилатном буфере с добавлением рутениевого красного (0,1 М).

Клетки инкубировали с фиксатором 1 час, затем аккуратно снимали их покровным стеклом с лунок и переносили в пробирки.

Пробирки центрифугировали 5 минут при 4200 об./мин., затем убирали фиксатор и заливали клетки 2%-ным раствором агарозы.

С помощью пастеровской пипетки суспензию клеток в агарозе переносили на охлаждающий столик, застывшие агарозные блоки нарезали лезвием на кусочки объемом 1 мм³ .

Полученные агарозные блоки с клетками отмывали 0,1 М Na-какодилатным буфером и проводили дофиксацию 2%-ным раствором OsO₄.

Материал, фиксированный без рутениевого красного, инкубировали с 1%-ным водным раствором уранилацетата в течение 12 часов при температуре +4.

Далее материал обезвоживали в серии спиртов восходящей концентрации (30°, 50°, 70°, 90°, 96°), ацетоне и пропитывали смесью ацетона и эпоксидной смолы (3:1, 1:1, 1:3), а затем чистой смолой.

Материал заливали в смесь эпоксидных смол (Epon 812, Epon DDSA, Epon MNA) с катализатором DMP30 и проводили полимеризацию при температуре +60°С в течение 48 часов.

С полученных блоков делали ультратонкие срезы толщиной 50-60 нм на ультрамикротоме Leica UC6 (Германия) и помещали их на никелевые сеточки.

Срезы клеток, предварительно инкубированных с уранилацетатом, контрастировали цитратом свинца по Рейнгольдсу.

Срезы клеток, предварительно инкубированных с рутениевым красным, контрастировали насыщенным спиртовым раствором уранилацетата и цитратом свинца по Рейнгольдсу.

Образцы просматривали под электронным микроскопом Libra 120 (Carl Zeiss, Германия) при ускоряющем напряжении 120 kV.

ЛИТЕРАТУРА

1. 
   Адамс Р., Методы культуры клеток для биохимиков. Москва, Издательство "Мир", 1983, 262 с.
   
2. 
   Балашов Ю. С., Миккау Н. Е., Изучение живых животных в растровом электронном микроскопе, "Природа", 1977, № 1;
   
3. 
   Киселев Н. А., Электронная микроскопия биологических макромолекул, М., 1965;
   
4. 
   Миронов А. А. Методы электронной микроскопии в биологии и медицине. - СПб.: Наука, 1994.
   
5. 
   Гайер Г. Электронная гистохимия. Москва, Издательство "Мир", 1974, 488
   
6. 
   Голубев Д. Б., Соминина А. А., Медведева М. Н. Руководство по применению клеточных культур в вирусологии. - Л.: Медицина, 1976, 224 с.
   
7. 
   Животная клетка в культуре  под. ред. Л. П. Дьяконова, В. И. Ситькова. – М.: 2000.
   
8. 
   Келдыш М.А., Помазков Ю.И. Вирусы, вироиды и микоплазмы растений: К 34 / Учебное пособие.- М.: Изд-во РУДН, 2003 – с. 157
   
9. 
   Культура животных клеток. Методы. / Под ред. Р. Фрешни. - М.: Мир, 1989, 333 с.
   
10. 
    Методы общей бактериологии: Пер. с англ./Под ред. Ф. Герхардта и др. — М.: Мир, 1983. — 536 с.
    
11. 
    Миронов А.А., Комиссарчик Я.Ю., Миронов В.А. Методы электронной микроскопии в биологии и медицине.Спб «Наука» 1994 400 с.
    
12. 
    Оленов Ю.М., - 1976 - "Новые методы культуры животных тканей".
    
13. 
    Сергеев В. А. Репродукция и выращивание вирусов животных. - М.: Колос, 1976, 303 с.
    
14. 
    Синдо Дайзуке. Аналитическая просвечивающая электронная микроскопия. - Москва: Техносфера, 2006.
    
15. 
    Темников Д.А., Мезина З.Р., Александрова И.С., Ларионова Н.Л. «Основы культивирования клеток животных». Интернет-курс. 2000 – 2003. Доступен на сайте http://www.ksu.ru/nilkto/cell/author.html.
    
16. 
    Уикли Б., Электронная микроскопия для начинающих.Москва, Издательство "Мир", 324.
    
17. 
    Уосли Д. Новые методы культуры животных тканей. Перевод с английского Фридлянской И.И., под редакцией Оленова Ю.М., Москва, Издательство "Мир",255.
    
18. 
    Alberts B., Bray D., Lewis J. et al. Molecular biology of the cell: third edition / Garland Publ. Inc., N.Y. & London. - 1994.
    
19. 
    Animal Cell Culture: A Practical Approach / Ed. John Masters, 2000.
    
20. 
    Electron microscopy of enzymes. Principles and methods, v. 1—2, N. Y., 1973—74.
    
21. 
    Harrison M.A., Rae I.F. General Techniques of Cell Culture, 2001.
    
22. 
    Freshney R.I. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 4th Edition, 2000.
    
23. 
    Langdon S. Cancer Cell Culture: Methods and Protocols, 2003.
    
24. 
    Tribe М. A., Eraut M. R., Snook R. K., Basic biology course, book 2 — Electron microscopy and cellstructure, Camb., 1975;
    
25. 
    Для подготовки данной работы были использованы материалы с сайта http://www.study.online.ks.ua/
    

жүктеу/скачать 7.03 Mb.

Достарыңызбен бөлісу: