Предмет цитологии. Историческое развитие цитологии

Основными компонентами мембран являются белки и липиды. На долю углеводов может приходиться около 10% массы мембран, при этом они всегда входят в состав гликолипидов или гликопротеинов. Соотношение между белками и липидами в мембранах значи-

Белковый состав мембраны зависит в какой-то степени от метода ее выделения. Некоторые белки непрочно связаны с мембраной и легко удаляются при промывании ее растворами с высокой или, напротив, с низкой ионной силой, щелочными растворами или растворами, содержащими хелатирующие агенты типа ЭДТА. При этом трудно сказать, является ли белок мембранным или цитоплазматическим, случайно связавшимся с мембраной в ходе ее выделения.

Следует отметить в мембранных липидах их огромное разнообразие. Причины этого пока не ясны, хотя становится все более очевидно, что, по-видимому, связано это с тем разнообразием функций, которые липиды выполняют в мембранах. Но, конечно, главная функция мембранных липидов состоит в том, что они формируют бислойный матрикс, с которым взаимодействуют белки. Различают следующие основные классы липидов.

1. 1,2-диацилфосфоглицериды или фосфолипиды. Эти липиды, являющиеся сложными эфирами жирных кислот и глицерола, широко представлены во многих мембранах эукариотических и прокариотических клеток, за исключением архебактерий. В частности, фосфатидилхолин является основным компонентом мембран животных клеток, а фосфатидилэтаноламин – это нередко основной липид бактериальных мембран.

2. Кардиолипины или дифосфатидилглицеролы – это димерные формы фосфолипидов. Они содержатся в большом количестве во внутренней мембране митохондрий, в мембране хлоропластов и в некоторых бактериальных мембранах, но редко встречаются в других мембранах.

4. Плазмалогены – это фосфоглицеролипиды, у которых одна из углеводородных цепей представляет собой простой виниловый эфир Этаноламиновые плазмалогены широко представлены в миелине и в саркоплазматическом ретикулуме сердца.

Гликосфинголипиды находятся на наружной поверхности плазматических мембран животных клеток. Обычно они являются минорными компонентами, но иногда содержатся в значительных количествах (например, в плазматических мембранах эпителиальных клеток. Моногалактозилцерамид – это один из основных компонентов миелиновой оболочки нервного волокна. В некоторых случаях гликосфинголипиды локализуются не в плазматической мембране, а во внутриклеточных мембранах.

Гликосфинголипиды мембран эритроцитов несут антигены группы крови. В клетках аденокарциномы человека накапливаются необычные фукозилированные гликосфинголипиды, которые можно использовать для обнаружения этих клеток и контроля за развитием опухоли.

Стеролы. Эти липиды присутствуют во многих мембранах растений, животных и микробов. Самым распространенным из стеролов является холестерол. Его молекула состоит из компактного, жесткого гидрофобного ядра, а полярной головкой является гидроксильная группа. Холестерол содержится в плазматических мембранах животных клеток, в лизосомах, эндосомах и в мембранах аппарата Гольджи. Он составляет около 30% всей массы мембранных липидов во многих плазматических мембранах животных клеток. В высших растениях обнаружены другие стеролы, чаще всего ситостерол и стигмастерол. Растительные стеролы (фитостеролы) часто имеют еще одну боковую цепь в положении С-24 и двойную связь в положении С-22. В мембранах дрожжей и других эукариотических микроорганизмов часто содержится эргостерол. К классу стеролоподобных липидов относят также гопаноиды, которые найдены в бактериях и некоторых растениях.

Минорные компоненты. В мембранах присутствуют также и другие липиды, которые можно отнести к разряду минорных компонентов вследствие их малого содержания в мембранах. Так, в мембранах обычно обнаруживаются, хотя и в очень малых количествах, свободные жирные кислоты и лизофосфолипиды. Пожалуй, исключением из этого правила являются мембраны хромаффинных гранул, которые, как известно, содержат необычно много свободных жирных кислот. Минорными компонентами мембран являются также моноацил- и диацилглицеролы. Диацилглицеролы выполняют важную функцию вторых посредников в передаче сигнала при активации клеток рядом биологически активных веществ. В мембранах обычно присутствуют и полиизопреноидные липиды. К ним относятся уби-хиноны и менахиноны – компоненты цепи электронного транспорта в мембранах. Можно отметить также ундекапренол и долихол, которые являются липидными переносчиками промежуточных продуктов соответственно при биосинтезе клеточной стенки у прокариот и при биосинтезе гликопротеинов в аппарате Гольджи у эукариот. Длина молекул этих липидов в вытянутом состоянии значительно превышает толщину бислоя, поэтому неизвестно, как эти молекулы в нем расположены. Неясно также, почему липидными переносчиками служат именно полиизопреноидные структуры.
Таким образом, совершенно очевидно, что липидный состав различных мембран не является случайным, однако удовлетворительного объяснения этому феномену не найдено. Любая конкретная мембрана может содержать более ста разных типов липидных молекул. Почему их так много и почему каждая мембрана имеет уникальный липидный состав? Становится все более очевидным, что липиды активно участвуют в процессах, протекающих в мембранах, однако причины их разнообразия также неясны. Рассмотрим некоторые факторы, возможно, определяющие липидный состав мембраны.

1. Смесь липидов обязательно должна быть способна образовать стабильный бислой, в котором могли бы функционировать белки.

2. Некоторые липиды способствуют стабилизации сильно искривленных участков мембраны, образованию контакта между мембранами или связыванию определенных белков, поскольку форма этих молекул благоприятствует нужной упаковке бислоя на соответствующих участках мембраны.

3. Некоторые липиды являются важными биорегуляторами. Наиболее изучена в этом отношении регуляторная роль производных фосфатидилинозитола в плазматических мембранах клеток эукариот (см. разд. 9.7.3).

4. Некоторые липиды участвуют в реакциях биосинтеза. Например, в клетках Е. coli фосфатидилглицерол поставляет глицерофосфатный фрагмент при биосинтезе периплазматических олигосахаридов.

5. Отдельные липиды необходимы для поддержания оптимальной активности ряда ферментов. Этот вопрос рассматривается в гл. 6.

6. Ганглиозиды, как полагают, играют важную роль в регуляции роста клеток, являются специфическими рецепторами в плазматической мембране и ответственны за клеточную адгезию.

7. Специфические функции могут выполнять и полиизопреноиды (например, долихол, убихиноны, менахиноны и каротиноиды), а также фактор активации тромбоцитов.

Как было показано экспериментально, организмы часто могут выдерживать, причем без всяких последствий, существенные изменения липидного состава мембран. Например, с помощью генетической трансформации можно получить штаммы Е. coli, в мембранах которых содержится 34% фосфатидной кислоты, обычно отсутствующей в штаммах дикого типа. Очевидно, тот липидный состав, который характерен для штаммов дикого типа, не является обязательным для выживания клеток, по крайней мере, в условиях их выращивания в лаборатории.
1.5.3. МЕМБРАННЫЕ БЕЛКИ

Мембраны содержат от 20 до 80% (по весу) белка. Как правило, именно белки ответственны за функциональную активность мембран. К ним относятся разнообразные ферменты, транспортные белки, рецепторы, каналы, поры и т. д., которые обеспечивают уникальность функций каждой мембраны. Первые успехи в изучении мембранных белков были достигнуты тогда, когда биохимики научились использовать детергенты для выделения мембранных белков в функционально активной форме. Это были работы по изучению ферментных комплексов внутренней мембраны митохондрий. Мембранные белки могут глубоко проникать в липидный бислой или даже пронизывать его, и их стабилизация осуществляется за счет гидрофобных взаимодействий. Эти термодинамические представления существенно обогатили принцип «гидрофобных сил», предложенный для объяснения структуры белков и предполагавший существование неполярной, гидрофобной области внутри белковой глобулы и полярных, гидрофильных участков, контактирующих с водной средой.

По мере совершенствования методов очистки удавалось получать в изолированном виде все большее число мембранных белков. Определение первичной структуры большинства из них было затруднено из-за плохой растворимости в воде как самих белков, так и получаемых из них гидрофобных пептидов. В середине 1970-х гг. эта проблема была решена для двух мембранных белков – гликофорина и цитохрома, что позволило установить основной принцип структурной организации интегральных белков. В аминокислотной последовательности гликофорина – сиалогликопротеина из мембраны эритроцитов – был обнаружен короткий участок, состоящий из 23 неполярных аминокислот и расположенный примерно в середине цепи. Данные топологических и других исследований показали, что молекула гликофорина полностью пронизывает мембрану, причем погруженный в мембрану гидрофобный участок имеет α-спиральную конфигурацию. Так вошла в жизнь новая, теперь уже общепризнанная концепция о наличии в мембранных белках α-спиральных доменов, пронизывающих мембрану. Эта концепция была полностью подтверждена при изучении трансмембранных белков с помощью методов, которые позволяют получить максимально возможное в наше время разрешение. Судя по результатам реконструкции электронно-микроскопических изображений препаратов бактериородопсина из пурпурной мембраны Halobacterium halobium и по данным рентгеноструктурного исследования фотосинтетических реакционных центров бактерий, эти белки содержат несколько α-спиральных участков, последовательно пересекающих бислой.

Другой вариант расположения полипептидной цепи в мембране был обнаружен при изучении аминокислотной последовательности интактной формы микросомного цитохрома. Было показано, что этот белок содержит относительно короткий участок вблизи карбоксильного конца, состоящий из гидрофобных аминокислот. Этот «гидрофобный якорь» можно было удалить с помощью протеолиза, причем гемсвязывающий домен высвобождался в водорастворимой форме. Локализованный в мембране гидрофобный домен, или «якорь», стал еще одним характерным элементом структуры мембранных белков.

В основе современных представлений о структуре мембранных белков лежит идея о том, что их полипептидная цепь уложена так, чтобы образовалась неполярная, гидрофобная поверхность, контактирующая с неполярной областью липидного бислоя. Полярные или заряженные домены белковой молекулы могут вазимодействовать с полярными головками липидов на поверхности бислоя. Многие мембранные белки являются трансмембранными и пронизывают бислой. Некоторые белки, по-видимому, связаны с мембраной лишь за счет их взаимодействия с другими белками.

Мембранные белки обычно связываются с мембраной с помощью нековалентных взаимодействий – гидрофобных или электростатических сил. Однако есть мембранные белки, которые связаны с липидами ковалентно. Такие примеры пока немногочисленны, но их появляется все больше. Многие белки плазматических мембран растительных и животных клеток (например, гликофорин) относятся к классу гликопротеинов. Углеводные остатки этих белков всегда находятся с наружной стороны плазматической мембраны.

Обычно мембранные белки подразделяют на наружные (периферические) и внутренние (интегральные). При этом критерием служит степень жесткости обработки, необходимой для извлечения этих белков из мембраны. Периферические белки высвобождаются при промывании мембран буферными растворами с низкой ионной силой, буферными растворами с низким или, наоборот, высоким значением рН и в присутствии хелатирующих агентов (например, ЭДТА), связывающих двухвалентные катионы. Как полагают, такие белки связаны с поверхностью мембраны за счет слабых электростатических взаимодействий с полярными головками липидных молекул либо с молекулами других белков. Часто бывает нелегко отличить периферические мембранные белки от белков, связавшихся с мембраной в процессе ее выделения. При обработке мембранного препарата буфером с низкой ионной силой в раствор переходит около 30% белков, связанных с мембраной эритроцитов. При несколько более жесткой обработке высвобождаются периферические белки. В ряде случаев эти агенты оказывают влияние достаточно сильное, чтобы разрушить белок-белковые взаимодействия, хотя денатурации белков при этом не происходит. Для высвобождения интегральных мембранных белков необходимо использовать детергенты или даже органические растворители. Детергенты разрушают липидный бислой и, как полагают, связываются с гидрофобными участками мембранных белков, контактирующими с гидрофобной областью бислоя. Для того чтобы сохранить интегральные мембранные белки в растворенном монодисперсном состоянии, в растворе постоянно должны присутствовать детергенты. При удалении детергентов неизбежно происходят агрегация белков и их последующее осаждение.

Исходя из их функции выделяют следующие основные виды мемб­ранных белков:

Все прочие вещества могут перемещаться через мембрану только при наличии в ней соответствующих белковых транс­портных систем. Причем одни из этих систем обеспечивают двусторонний перенос своих лигандов, а другие – только одно­сторонний.

В итоге деятельность этих систем дает два основных ре­зультата:

а) создаются устойчивые транспортные потоки определен­ных веществ через мембраны (например, в проксимальных ка­нальцах почек – поток глюкозы из первичной мочи в кровь че­рез последовательно расположенную серию мембран);

б) кроме того, транспорт ионов приводит к возникновению трансмембранного потенциала во всех клетках, а также к его из­менениям в нервных и мышечных клетках и волокнах. Послед­нее же лежит в основе таких важнейших явлений, как возбуди­мость и проводимость.

3. Белки, обеспечивающие непосредственное межклеточ­ное взаимодействие. Многочисленные белки этой группы мож­но поделить прежде всего на две совокупности:

а) Т. н. адгезивные белки необходимы для связывания клеток друг с другом или неклеточными структурами (базальной мембраной, волокнами).

б) Другие белки участвуют в образовании специализирован­ных межклеточных контактов (десмосом и др.).

В свою очередь, в каждой из этих совокупностей можно про­извести дальнейшее деление белков, о чем будет речь позднее.

4. Последняя большая группа мембранных белков – белки, участвующие в передаче сигналов от одних клеток к другим.

Такая передача осуществляется в очень многих случаях и самыми разными способами.

Например, в нервных и нервно-мышечных синапсах с т. н. ионотропными рецепторами сигнальной молекулой (внеклеточным медиатором) является определенное низко­молекулярное вещество, а плазмолемма воспринимающей клетки содержит:

а) рецепторные белки,

Как видно, участвующие в этом ионные каналы попадают сразу в две функциональные группы: кроме данной, еще и в группу транспортных белков. Помимо того, обычно эти ион­ные каналы сами же осуществляют и рецепторную функцию (за счет дополнительных субъединиц). Так обстоит, например, дело в случае т. н. н-холинорецепторов – они одновременно являют­ся ионными каналами для катионов. Все это иллюстрирует сложность классификации мембранных белков, о чем уже гово­рилось выше.

Как видно, это близко к тому, что было сказано для синап­сов с ионотропными рецепторами. Таким образом, данную триа­ду можно распространить на большинство случаев передачи сиг­нала.

Итак, мы перечислили четыре основные функциональные группы мембранных белков, каждая из которых обычно подраз­деляется далее и объединяет большое количество конкретных белков.

Наличие углеводного компонента характерно практически для всех мембран клетки, но особенно для мембран вакуолярной системы и плазматической мембраны. Углеводный компонент мембран представлен главным образом гликопротеинами – молекулами белков, ковалентно (в отличие от нуклеопротеидов) связанных с цепочками углеводов – гликокаликс. Как правило, цепочки углеводов расположены в наружных слоях мембран (для цитоплазматических вакуолей наружными считают слои, обращенные не к матриксу цитоплазмы, а в полость везикул или вакуолей). Они имеют ковалентные связи с интегральными белками, образуя гликопротеиды, или с липидами (гликолипиды). Углеводы мембран представляют собой короткие линейные или разветвленные цепочки, в состав которых входят галактоза, манноза, фруктоза, сахароза, N-ацетилглюкозамин, N-ацетилгалактозамин, пентозы (арабиноза и ксилоза), а также нейраминовая (сиаловая) кислота. Значение этого компонента очень велико для функционирования плазматической мембраны и обеспечения ее механической устойчивости. Как показали электронно-микроскопические исследования, особенно с применением специальных методов контрастирования полисахаридов, гликокаликс имеет вид рыхлого волокнистого слоя толщиной 3–4 нм, покрывающего всю поверхность клетки. Особенно хорошо гликокаликс выражен в щеточной каемке клеток всасывающего эпителия кишечника (энтероциты), однако он обнаружен практически у всех животных клеток, но степень его выраженности различна.

Механическая устойчивость плазматической мембраны, кроме того, обеспечивается структурой примыкающего к ней со стороны цитоплазмы кортикального слоя и внутриклеточных фибриллярных структур.

Барьерная роль плазмалеммы заключается также в ограничении свободной диффузии веществ. Модельные опыты на искусственных липидных мембранах показали, что они проницаемы для воды, газов, малых неполярных молекул жирорастворимых веществ, но совершенно не проницаемы для заряженных молекул (ионы) и для крупных незаряженных (сахара) (рис. 1).

Естественные мембраны также ограничивают скорость проникновения низкомолекулярных соединений в клетку.