Рабочая программа по дисциплине Акушерство и искусственное осеменение (полное наименование дисциплины по рабочему учебному плану) для студентов специальности

Лаборатория – 14

Сушильный шкаф,

Автоклав,

Сода,

Макросоли,

Микросоли

Культуры растений

Преподаватель объясняет общие принципы култивирования клеток и тканей ин витро. Потом

покажит принципы работы сушильного шкафа, автоклава и подготовку растворов.

Отвечает вопросы студентов. В конце Лабораторной работы проверяет результаты приготовления растворов для дезинфекции.

1. 
   Для стерилизации горячим воздухом стеклянную посуду прогревают при 160 градусной температуре в течение 90 –0120 минут.
   
2. 
   Термостабильные растворы стерилизуются обработкой горячим паром при температуре 121 градуса в течение 20 – 30минут.
   
3. 
   При стерилизации фильтрованием используются нитроцеллюлозные6 асбестовые или фарфоровые фильтры, имеющие поры размером менее 0.75 мкм6 которые механически задерживают микроорганизмы. Фильтрованию подвергаются те среды, в которых при автоклавировании происходит гидролиз компонентов.
   
4. 
   При стерилизации облучением используют бактерицидные ртутные лампы низкого давления, излучающие волны света длиной 254 нм.
   

Компоненты среды для выращивания клеток можно разделить на 6 групп: 1. основные неорганические питательные вещества / макроэлементы/; 2. микроэлементы; 3. источник железа; 4. витамины; 5. источник углерода /глюкоза, фруктоза, сахароза/; 6. регуляторы роста: акусины В – индолил – 3 – уксусная кислота; а – нафтилуксусная кислота; 2,4 – дихлорфеноксиуксусная кислота /Д/; и цитокинины 6 – фурфуриламинопурин, 6 – бензиламинопурин, зеотин. Ниже приводится состав наиболее часто употребляемой среды Мурасиге – Скуга, эффективной для роста многих одноклеточных растений. Компоненты перечислены в порядке смешивания.

1. 
   Макросоли 50 мл/л
   
2. 
   Микросоли 1 мл/л
   
3. 
   Fe – хелат 5 мл/л
   
4. 
   Тиамин HCL 1 мл/л
   
5. 
   Мезоинозит 80 мг/л
   
6. 
   2,4 – Д 2 мг/л
   
7. 
   Сахароза 30 г/л
   
8. 
   CaCL2 20H2O 1.46 мл/л
   
9. 
   Агар – агар 7 г/л
   

Макросоли мг/л Микросоли мг/л

KNO3 1900 HBO 6.2

KHPO 170 MnSO. HO 22.3

NHNO 1650 Fe (SO) . HO 27.8

MgSO . 7HO 370 NaMoO. 37.3

CaCl . 2HO 440 CuSO. HO 0.025

ZnSO.HO 8.6

NaMoO. HO 0.25

KJ 0/83
Для приготовления плотных агаризованных сред добавляют агар до конечной концентрации 6 – 10 г/л. Величину рН среды перед автоклавированием доводят до 5.5 – 6.

Для каждого нового объекта приходится подбирать свою питательную среду эмпирическим путем. Кроме того состав среды приходится изменять и в процессе культивирования для того, чтобы направить морфогенез в нужную сторону.

Важным условием успешной работы с культурой клеток является поддержание оптимальной температуры, влажности воздуха и освещения. Наиболее часто используют температуру 25 – 26 градусов, влажность воздуха 65 – 70 %, освещенность 1 – 3тыс. люкс.

Однако поскольку сам эксплант /фрагмент изолированной ткани или органов,инкубируемый на питательной среде самстоятельно для получения первичного каллуса/ содержит незначительное количество физиологически активных вешеств, то в состав среды вводят в качестве индукторов каллусогенеза фитогормоны.

По консистенции каллус бывает рыхлый и плотный. Рыхлый каллус быстрее растет и более предпочтителен для образоиания суспензии. Плотный каллус используется для морфогенеза.

Для начала образования каллуса содержание в среде ауксина должно быть в несколько раз выше, чем для поддержания его роста. Например, для инициации каллуса нужно добавлять в среду 6 мг/л 2,4-Д, а для поддержания роста /т.е,со 2-го пассажа/ -3 мг/л 2,4 –Д.
Полученную из экспланта каллусную ткань принято называть первичной. Для поддержания ее дальнейшего роста периодически /через 4-6 недель/ небольшую часть этой ткани переносят с соблюдением стерильности на свежую питательную среду. Этот прием получил название субкультивирование или пассирование.

Таким образом удается длительное время /десиятилетия/ сохранять культуры каллусных тканей. Пассировать ткань можно неограниченнле число раз. Однако при многократном пассировании ткани на свежие питательные среды наблюдается явление / привыкания/ , которое выражается в приобретении гормононезависимости и утрате или значительном ослаблении способности каллусных клеток к регенерации целого растения.

Культура каллуса может быть получена из многих органов растений:

Корней, побегов, листьев /рис 3/

Молодые ткани более пригодны для этой цели,чем зрелые.

Так , например, из эксплантов эндосперма кукурузы, полученных позднее чем через 8-11 дней после опыления,каллус не образуется.

Размер исходного экспланта не оказывает влияния на рост каллуса, хотя существует минимальный критический размер уменьшив который, нельзя вызвать рост экспланта. Например, экспланты из флоэмы корней маркови массой все 3.8 мг вполне жизнеспособны, тогда как та же масса экспланта клубня земляной груши слишком мала для этого. Дело здесь в числе клеток в экспланте –у моркови клетки мельче, значит их больше и при вырезании экспланта повреждается меньший процент клеток.

Обычно масса колеблется от 60 до 100 мг на 20 –40 мг агаризованной питательной среды. Этого хватает , чтобы большая часть эксплантов за 3-8 недель образовала каллусы в количестве , достаточном для пересадки. В ходе дальнейшего субкультивирования формируется штамм клеток, характеризующися индвидуальными генетическими и физиологическими особенностями. В ходе вырашивания каллусные клетки делятся, растут дифференцируются и, наконец деградируют. На рис. 4 представлен ростовой цикл культивируемых клеток.

Культивирование отдельных клеток позволяет получить клоны культуры, возникшие из одной клетки. Но коллусные растительные клетки, в отличие от микробных, не делятся и не образуют колоний, если их помещают на плотной питательной среде изолированно одно от другой.

Деление пройсходит только при большой плотности размещения клеток. Наиболее эффективными способами получения клонов из отдельных клеток являются методы /няньки/, кормящего слоя и культивирование в микрокаплях.
Метод Няньки /Рис. 5/ сводится к тому , что вблизи расположенных на плотной питательной среде единичных каллусных клеток, на расстоянии 4 –5 мм , помещают кусочки каллусной ткани того же вида растения, но находящиеся в фазе интенсивного роста. Ткань нянька оказывает стимулирующее действие на деление отдельных клеток.

Для создания кормящего слоя используют суспензию клеток того же вида растения, что и одиночная клетка, или близкого вида. Клеточная суспензия берется в ранней экспоненциальной фазе ростогово цикла. На поверхности суспензии, налитой на дно широкогорлой колбы, спомошью сетки или иных устройств закрепляют фильтровальную бумагу, на которой расположены одиночные клетки. По достижении колонией , возникшей из отдельной клетки, величины 0.5 – 1 мм клон может быть перенесен для дальнейшего выращивания на агаризованную питательную среду.