Изучение влияния новых химических соединений на функциональное

В результате направленного синтеза в ИФАВ РАН и на кафедре органической химии МГУ им. М.В. Ломоносова были синтезированы новые вещества в трех химических классах, которые были изучены на их способность модулировать ответы АМРА и NMDA рецепторов нейронов ЦНС.

Табл. 1. Влияние новых производных дибензиламинов на КК-вызванные токи в нейронах Пуркинье мозжечка крыс. В колонках – амплитуды токов в % при действии соответствующей концентрации вещества (M±m).

На рисунке 3 приведены графики влияния некоторых представителей производных дибензиламинов на каинат-вызванные токи, демонстрирующие диапазон их активности как потенциаторов АМРА рецепторов.

На основании анализа полученных данных определено наиболее активное соединение. Этим соединением оказалось IP5051, вызывающее наибольшую потенциацию АМРА рецепторов.

Проведенные исследования показали, что циклотиазид (ЦТ) – модельный потенциатор АМРА рецепторов, блокирующий их десенситизацию, и соединение IP5051 оказывают на КК-вызванные токи аналогичное действие. Графики зависимости концентрация - ответ для КК, и для КК в присутствии 30 мкМ ЦТ или IP5051 (рис. 4) показывают, что оба соединения вызывают непараллельный сдвиг кривой концентрация-ответ для КК в диапазоне концентраций последней от 10 до 4000 мкМ. Ответы в присутствии IP5051 были немного больше, чем в

присутствии ЦТ.

Практически полное сходство действия ЦТ и IP5051 на ответы, вызываемые активацией АМРА рецепторов в нейронах Пуркинье (рис. 4), позволяет сделать вывод, что в основе механизма потенцирующего действия IP5051 лежит блокада десенситизации АМРА рецепторов.

Рис. 3. Действие некоторых производных дибензиламинов на КК-вызванные токи в нейронах Пуркинье мозжечка крыс. Соединения: 1 – IP5051, 2 – IP9242, 3 – IP9122, 4 – IP9260, 5 – IP9128.

Примечание: по оси абсцисс – логарифм концентраций веществ в Молях, по оси ординат – амплитуда токов по отношению к контролю в %.

Рис. 4. Влияние ЦТ и соединения IP5051 на зависимость концентрация - ответ для токов, вызванных аппликацией КК в нейронах Пуркинье.

Примечание: Ответы нормализованы к ответам, вызываемым аппликацией максимально использованной концентрации КК - 4 мМ для соответственно контроля (●) (принятом за 1) и в присутствии 30 мкМ ЦТ (○) и IP5051 (□).
Действие соединения IP5051 на NMDA рецепторы в нейронах коры головного мозга крыс. Установлено, что IP5051 блокирует токи, вызываемые активацией NMDA рецепторов. По степени чувствительности NMDA-активируемых токов к действию IP5051 и характеру вызываемой им блокады NMDA рецепторов исследованные нейроны коры головного мозга крыс были разделены на 2 группы.

Соединение IP5051 в нейронах 1 группы (n=5) блокировало ответы NMDA рецепторов в низких концентрациях. Важной особенностью действия IP5051 в

этих нейронах явилось то, что более эффективно оно блокировало токи большей амплитуды. IC₅₀ соединения IP5051 для блокады токов различной амплитуды были неодинаковы и тем меньше, чем больше были NMDA-активируемые токи. Для максимальных токов в наших экспериментах IC₅₀ равнялась 0,4±0,15х10^-6 М. Для самых маленьких токов IC₅₀ равнялась 2,1±0,4х10^-6 М (рис. 5).

Рис. 5. Блокада соединением IP5051 NMDA-вызванных токов в нейронах 1 группы коры головного мозга крыс.

Примечание: 1- контроль, 2-6 – концентрации IP5051– 0,5 мкM, 1,0 мкM, 2,0 мкM, 10,0 мкM и 30,0 мкM соответственно.
Соединение IP5051 в нейронах 2 группы (n=13) вызывало блокаду NMDA-активированных токов в гораздо более высоких концентрациях. Характер блокирующего действия в этих нейронах также существенно отличался от действия IP5051 в нейронах 1 группы. Величина блокирующего эффекта не зависела от амплитуды NMDA-активированных токов. IC₅₀ соединения IP5051 в этой группе нейронов составляет примерно 2,3х10^-5 М.

Изучение влияния производных алкилизотиомочевины

Действие веществ на АМРА рецепторы. Только два соединения данного класса веществ – IP9040 и IP9150 потенцировали токи АМРА рецепторов. Особенностями действия этих веществ на токи АМРА рецепторов являются небольшие величины потенцирующего эффекта – максимум 170% от контроля – и обращение потенцирующего эффекта на противоположный при дальнейшем увеличении концентрации веществ (табл. 2).

Табл. 2. Влияние новых производных алкилизотиомочевины на каинат-вызванные токи в нейронах Пуркинье мозжечка крыс.

На основании компьютерного моделирования на кафедре органической химии МГУ были предсказаны и синтезированы новые производные, в качестве потенциаторов АМРА рецепторов, относящиеся к классу 3,7-диазабицикло[3.3.1]нонанов. Их структура представляет собой как бы сдвоенную молекулу АМРАкина BDP, что, по замыслу авторов, должно существенно усилить потенцирующие свойства соединений (Тихонова и др., 2004).

Действие обоих веществ на АМРА рецепторы имело куполообразную форму: низкие концентрации увеличивали токи, а большие наоборот - блокировали их (рис. 6). Оба соединения не влияли на NMDA-вызванные токи в нейронах коры головного мозга крыс в концентрациях 1х10^-7 М – 3х10^-5 М.

Рис. 6. Влияние производных N,N'-замещенных 3,7-диазабицикло[3.3.1] нонанов на каинат-вызванные токи в нейронах Пуркинье мозжечка крыс.

Примечание: 1 – XXX-1, 2 – ХХХ-2. Амплитуда контрольных токов принята за 100%. По оси абсцисс – логарифм концентрации веществ в молях, по оси ординат - % амплитуды ответов к контролю, принятом за 100%.

По своей активности в потенцировании АМРА рецепторов соединение ХХХ-2 является “абсолютным рекордсменом”: концентрация 10^-11 М является наименьшей из известных в настоящее время, в которой вещества - позитивные модуляторы АМРА рецепторов - способны вызывать потенциацию АМРА рецепторов. Как недавно установлено, процесс десенситизации предотвращается встраиванием двух молекул потенциатора АМРА рецепторов в межщелевое пространство между двумя S1S2 “петлями”, образующими димер АМРА рецептора (Jin et al., 2005). Молекулы соединений ХХХ-1 или ХХХ-2, представляя собой производные сдвоенных молекул АМРАкина BDP, по-видимому, способны более эффективно, чем одиночные молекулы потенциатора, встраиваться в это пространство, предотвращая поворот димера.

Изучение влияния соединений серии ОСЛМ (производных BDP) на

функциональное состояние АМРА рецепторов.

Два соединения из синтезированного ряда – ОСЛМ-4 и ОСЛМ-8 – оказались активнее на 3 порядка исходного соединения BDP в потенциации токов АМРА рецепторов (рис. 7). Другие соединения этого ряда не показали

Рис. 7. Действие ОСЛМ-4 (1), ОСЛМ-8 (2) и BDP (3) на КК-вызванные токи в

нейронах Пуркинье мозжечка крыс.

Примечание: по оси абсцисс – логарифм концентрации веществ в молях, по оси ординат - % амплитуды ответов к контролю, принятом за 100%.

способности потенцировать КК-вызванные токи. Все исследованные соединения, кроме BDP, приобрели свойство при увеличении концентрации блокировать КК-вызванные токи.

Таким образом, среди новых производных дибензиламинов, алкилизотиомочевины и N,N'-замещенных 3,7-диазабицикло[3.3.1]нонанов выявлены соединения, которые обладают свойствами позитивных модуляторов АМРА рецепторов. Ранее подобная активность для представителей данных химических классов показана не была. Изучение механизма действия новых соединений на АМРА рецепторы показало, что потенциация ответов АМРА рецепторов происходит аналогично действию ЦТ, т.е. за счет уменьшения их десенситизации.

Другой важнейшей особенностью некоторых представителей производных дибензиламинов и алкилизотиомочевины является их способность неконкурентно блокировать NMDA рецепторы наряду с потенциацией АМРА рецепторов.

Изучение процесса блокады NMDA рецепторов соединением IP5051 показало, что в разных нейронах оно блокирует рецепторы различными механизмами. Один из механизмов, по-видимому, заключается в блокаде NMDA рецепторов, содержащих NR2B субъединицы. Такое предположение можно сделать, сравнивая блокаду NMDA рецепторов в нейронах 1 группы с литературными данными, полученными при изучении действия ифенпродила на ответы NMDA рецепторов, содержащих NR2B субъединицы (Kew et al., 1996) (Ифенпродил – прототипический антагонист NR2B субъединицы NMDA рецепторов). Имеется практически полная аналогия в характере блокирующего действия IP5051 и ифенпродила (рис. 8).

А Б

Рис. 8. Сравнение блокирующего действия соединения IP5051 на токи NMDA рецепторов в нейронах 1 группы и ифенпродила на токи NR2B-содержащих NMDA рецепторов (из Kew et al., 1996).

Примечание: ▲– маленькие токи, ■ – большие токи. По оси абсцисс – логарифм концентрации IP5051 (А) и ифенпродила (Б), по оси ординат –

величина блокирующего действия соединений в %, полная блокада – 100%.

гораздо более высоких концентрациях, чем в нейронах 1 группы. Вероятно, что и характер этого связывания сходен с характером блокирующего действия МК-801, о чем говорит длительное время отмывки МК-801 и IP5051 в больших концентрациях.

Соединение IP9040 также блокирует NMDA рецепторы. Вероятно, IP9040 блокирует NMDA рецепторы только путем блокады ионного канала NMDA

рецептора, но характер этой блокады существенно отличается от блокады, вызываемой IP5051 в нейронах 2 группы. Сравнительный анализ блокирующего действия IP9040 и мемантина позволяет предположить, что оно осуществляется аналогично, по механизму быстрой диссоциации с рецептором, поскольку и мемантин и соединение IP9040 отмывались одинаково быстро, в течение 2-3-х минут.

Целью данной серии экспериментов было установить возможную связь между параметрами изменения ответов АМРА рецепторов в нейронах головного мозга при действии соединений и влиянием этих соединений на обучение и память экспериментальных животных. Для достижения этой цели определено влияние наиболее активных новых и модельных соединений на обучение и память как нормальных животных, так и животных с экспериментальной моделью БА.

Изучено влияние соединения IP5051 на обучение и память животных с

экспериментальной моделью БА в тесте УРАИ. В таблице 3 представлены результаты измерения количества правильных переходов во время обучения животных.

Табл. 3. Процент “правильных” переходов крыс в другую камеру во время подачи условного сигнала; последние 15 сигналов - при действии соединения IP5051.

Группы	Контроль	AF64A	AF64A+ IP5051 1,0 мг/кг	AF64A+ IP5051 5,0 мг/кг
Процент правильных переходов	78 ± 5 р < 0,001	37 ± 6,5	67 ± 6 р < 0,05	85 ± 7 р < 0,001

Примечание: достоверность рассчитывали по сравнению с группой животных

с AF64A.
Через 24 часа крыс повторно помещали в установку и замеряли количество “правильных” переходов в другую камеру при подаче 25 сигналов. В расчет брали 5 последних сигналов. Тем самым было определено влияние IP5051 на память животных (табл. 4).

Табл. 4. Процент “правильных” переходов крыс в другую камеру во время подачи условного сигнала – последние 5 сигналов - при действии соединения IP5051 (влияние на память).

Группы	Контроль	AF64A	AF64A+ IP5051 1,0 мг/кг	AF64A+ IP5051 5,0 мг/кг
Процент правильных переходов	66 ± 8 Р < 0,05	28 ± 7	68 ± 7 р < 0,05	88 ± 6 р < 0,05

Примечание: достоверность рассчитывали по сравнению с группой животных с AF64A.
В результате исследования установлено, что IP5051 в дозах 1,0 и 5,0 мг/кг достоверно улучшало количество “правильных” переходов как во время обучения, так и во время воспоминания у животных с экспериментальной

моделью БА.

Влияние новых и модельных веществ на обучение и память интактных

животных было изучено в тесте узнавания новой локализации объекта. При тестировании через 48 часов после тренировки контрольные животные затрачивали на обследование объекта в известной и новой локализации одинаковое количество времени, т.е. они воспринимали объекты в обоих местах как новые. Животные, которым вводили IP5051 в дозах 0,05 и 0,1 мг/кг, затрачивали на обследование объекта в новой локализации достоверно больше времени, чем на обследование в старой, а результаты животных, получивших дозу 0,5 мг/кг (р=0,051), находятся на границе достоверности (рис. 9). Исследование соединения IP9268 показало, что только животные, получившие оединение в дозе 5,0 мг/кг, помнят расположение объектов (рис. 10). Животные, получившие другие соединения: IP9150 в дозах 0,05 – 2,0 мг/кг; IP9040 в дозах 0,1 -1,0 мг/кг; ХХХ-1 в дозе 0,1 мг/кг; ХХХ-2 в дозе 0,01 мг/кг; ОСЛМ-4 в дозе 0,1 мг/кг; BDP в дозах 1,0 и 2,0 мг/кг помнят расположение объектов.

Рис. 9. Влияние соединения IP5051 на память в тесте узнавания новой локализации известного объекта.

Примечание: ряд 1- контроль, ряд 2 - IP5051. Дозы IP5051 - в мг/кг.
Проведенные исследования показали, что соединения, которые потенцируют токи АМРА рецепторов, улучшают память животных в

Рис. 10. Влияние соединения IP9268 на продолжительность обследования объекта в известной и новой локализации.
поведенческих экспериментах. Однако, не во всех случаях имелась прямая связь между величиной потенцирующего эффекта ответов АМРА рецепторов веществом и величинами доз, в которых это вещество оказывает когнитивно-стимулирующее действие. Хотя для некоторых соединений одного химического класса такая связь прослеживалась, в других случаях наблюдалось явное противоречие. Например, соединения ХХХ-1 и ХХХ-2 отличаются по своей активности в качестве потенциаторов АМРА рецепторов в 10 раз. В качестве стимуляторов памяти ХХХ-2 также активнее ХХХ-1 в 10 раз. Однако, для другой пары веществ наблюдается совсем иная картина: соединения IP5051 и IP9268 вызывают почти одинаковую потенциацию АМРА рецепторов (1050% и 770% соответственно при 3х10^-5М), но в поведенческих экспериментах первое соединение было в 100 раз активнее, чем второе. В поисках ответа на вопрос за счет чего возникает такая большая разница в эффективных дозах этих веществ, обратим внимание на то, что IP5051 дополнительно блокирует NMDA рецепторы. Может ли блокада NMDA рецепторов вносить свой вклад в проявление когнитивно-стимулирующего действия вещества? Исследование механизма действия димебона – лекарственного препарата, который обладает высоким нейропротекторным и когнитивно-стимулирующим действием (Bachurin et al., 2001a; Doody et al., 2008) позволило предложить ответ на этот вопрос.

Прогностическая значимость для клинических испытаний результатов