Разработка системы поиска препаратов для коррекции нарушений Когнитивных функций при нейродегенеративных заболеваниях в ряду лигандов глутаматных рецепторов 14. 00. 25 фармакология, клиническая фармакология


электрофизиологических и фармакологических исследований новых



бет3/4
Дата24.04.2016
өлшемі0.5 Mb.
#74629
түріАвтореферат диссертации
1   2   3   4

электрофизиологических и фармакологических исследований новых

соединений на примере препарата димебон

Изучение влияния димебона на функциональное состояние АМРА рецепторов. Установлено, что димебон вызывает позитивную модуляцию ответов АМРА рецепторов в нейронах Пуркинье. Димебон приводил к увеличению каинат-вызванных токов на 16%, начиная с концентрации 2х10-7 М. В концентрации 5х10-7 М димебон вызывал потенциацию в среднем на 52%. Увеличение концентрации препарата не увеличивало потенциацию КК-вызванных токов. В диапазоне концентраций димебона 1х10-6 - 2х10-5 М потенциация токов составляла в среднем 42%. Дальнейшее увеличение концентрации димебона приводило к уменьшению потенцирующего эффекта, и в концентрации 4х10-5 – 5х10-5 М потенциация токов была равна нулю или ответы были даже меньше, чем в контроле (до - 6%). Таким образом, потенциация каинат-вызванных токов димебоном имеет куполообразную форму (рис. 11).

Сравнение действия димебона с действием ЦТ показало, что в основе потенцирующего влияния димебона на АМРА рецепторы лежит его способность снижать десенситизацию этих рецепторов.



Изучение влияния димебона на функциональное состояние NMDA рецепторов. Установлено, что димебон оказывает блокирующее действие на токи, вызываемые аппликацией NMDA в нейронах (n=33) коры головного мозга крыс. По характеру этой блокады мы разделили исследованные нейроны коры на 2 группы. В нейронах 1-й группы (n=9) димебон в низких концентрациях блокировал NMDA-активируемые токи: IC50=7,7±1,4х10-6 М (рис. 12). В нейронах 2-й группы (n=24) димебон блокировал NMDA-активируемые токи в гораздо более высоких концентрациях: IC50 = 7,3±2,1х10-5 М.

Рис. 11. Действие димебона (1) и циклотиазида (2) на КК-вызванные токи в нейронах Пуркинье.

Примечание: по оси абсцисс – логарифм концентрация веществ в Молях. По оси ординат – амплитуда ответов в % по отношению к контролю. Амплитуда токов в контроле взята за 100%.


Препарат сравнения мемантин также оказывал блокирующее действие на NMDA-активируемые токи (n=23), отличавшееся от действия димебона. В нейронах 2-й группы по нашей классификации мемантин эффективно блокировал токи: IC50 =1,4±0,4х10-6 М. В нейронах 1-й группы мемантин менее эффективен: IC50=1,5±0,32х10-5 М (рис. 12).

Таким образом, оба препарата блокируют NMDA рецепторы, но действуют, вероятно, на разные их субъединицы и/или на разные участки рецептора. Наши опыты подтверждают, что мемантин действует как блокатор открытого состояния ионного канала NMDA рецептора, действующий по механизму быстрой диссоциации с рецептором. Одной из вероятных мишеней действия димебона, в отличие от мемантина, является участок связывания ифенпродила, локализованный на NR2B-субъединице NMDA рецептора. Сравнительный анализ результатов компьютерного 3d моделирования, проведенного на кафедре органической химии МГУ им. М.В. Ломоносова,показал, что димебон может достаточно эффективно взаимодействовать с участком связывания ифенпродила на N-концевом домене NR2B субъединицы (чему соответствует блокада NMDA рецепторов в низких концентрациях в нейронах 1 группы), но гораздо менее



Рис. 12. Действие димебона (А) и мемантина (Б) на NMDA-вызванные токи в нейронах 1 группы.

Примечание: 1- контроль, 2 - при добавлении в физ.раствор 10 мкМ димебона (А) и 20 мкМ мемантина (Б), 3 - ответы после 3 минут отмывки. Калибровка: вертикальная- 200 рА, горизонтальная – 2 сек.
эффективно взаимодействовать с участком связывания МК-801 внутри ионного канала NMDA рецептора (Тихонова, 2005; Tihonova et al., 2002) (блокада NMDA рецепторов в высоких концентрациях в нейронах 2 группы).

Изучение влияния димебона на память в поведенческих экспериментах. Тест УРАИ выполнен на животных с экспериментальной моделью БА. Животные, у которых нейротоксином AF64A были разрушены холинергические нейроны, получали димебон в дозе 1,0 мг/кг в течение 12 дней. В результате исследования установлено, что димебон существенно уменьшает латентное время перехода крыс в другую камеру, что свидетельствует о его позитивном влиянии

на обучение и память экспериментальных животных (рис. 13, рис. 14).

Также изучено влияние димебона на память мышей в тесте узнавания известного объекта в новой локализации (рис. 15). В данном тесте димебон достоверно улучшает память мышей в дозах 0,01 – 0,15 мг/кг.

Рис. 13. Влияние димебона в дозе 1,0 мг/кг на латентное время перехода крыс в другую камеру после подачи условного сигнала сразу после обучения.

Рис. 14. Влияние димебона в дозе 1,0 мг/кг на латентное время перехода крыс в другую камеру после подачи условного сигнала после через 24 часа после обучения (влияние на память).


Исследование влияния димебона на функциональное состояние животных в условиях длительного хронического применения. Мыши получали димебон в дозе 1,5 мг/кг в сутки в течение 15 месяцев. Через несколько месяцев эксперимента стало понятно, что димебон не только не оказывает каких-либо токсических эффектов на стареющих животных, но наоборот, вызывает улучшение их состояния. Число волосяных фолликулов на единице

Рис. 15. Влияние различных доз димебона на продолжительность обследования объекта в известной и новой локализации. Ряд 1- известная локализация, Ряд 2- новая локализация.


площади кожного лоскута по данным морфологических измерений составляло в среднем в контрольной группе 2,19±1,47 и 3,54±1,67 (р<0,04) в экспериментальной группе. Количество животных с катарактой также было больше в контрольной группе - до 26% (р≤ 0,03158, начиная с возраста 26 месяцев). Чисто внешне животные опытной группе выглядели намного сохраннее, активнее, чем в контрольной группе.

Двигательная активность молодых животных в возрасте 4-5 месяцев по числу пересеченных квадратов в тесте “открытое поле” составляла 59,5±6,16; старых контрольных животных – 9,17±4,27, старых животных, хронически получающих димебон – 18,83±4,34 (р<0,05). Т.е. димебон существенно сохранял

двигательную активность старых животных.

Средние массы всех органов у животных экспериментальной группы были ближе к массам органов молодых животных. Они имели меньшие отклонения от среднего значения, что также характерно для молодых животных и, по-видимому, связано с меньшим количеством органных патологий, значительно изменяющих массу того или иного органа.

Димебон увеличивал среднюю и максимальную продолжительность жизни животных. Наиболее показательно это проявилось в конце эксперимента: если сравнить количество живых мышей в каждой возрастной группе: 900, 950 и 1000 дней, то мы увидим, что если в группе 900 дней количество доживших животных опытной группы превышало таковых в контрольной только на 28% (р≤0,05), то в группе 950 дней уже в 2,5 раза (р<0,002), а в группе 1000 дней – в 4 раза (р<0,0001).

При микроскопическом изучении взятых в исследование органов и тканей животных обеих групп существенных изменений в их гистоструктуре не выявлено, за исключением миокарда и головного мозга. В миокарде мышей контрольной группы определяются четкие изменения со стороны ядер кардиомиоцитов по типу кариорексиса и кариолизиса. Кроме того, определяются очаги фрагментации волокон. Вышеописанные изменения со стороны миокарда мышей опытной группы почти не наблюдаются. Микроскопическая характеристика вещества больших полушарий и мозжечка головного мозга мышей обеих групп соответствует нормальному строению. Однако у большинства животных контрольной группы, по сравнению с опытной, относящихся к одной возрастной группе, выявлен выраженный перицеллюлярный отек и разрежение вещества мозга.

Таким образом, проведенный эксперимент на старых животных – мышах-самках линии С57Bl/6 - показал, что димебон при его ежедневном пожизненном применении в течение 15 месяцев оказывает выраженное нейропротекторное и цитопротекторное действие. Димебон ни по одному показателю не проявил побочных токсических эффектов, что предполагает его безопасное использования на людях в течение продолжительного времени (Bachurin et al., 2007). На основании полученных результатов была подана заявка в Росздравнадзор для получения разрешения медицинского применения димебона по новому назначению в качестве лекарственного средства для лечения болезни Альцгеймера и стимулятора когнитивных функций.

На основании разрешения Росздравнадзора в начале 2006 года начались клинические испытания димебона на 2-ой фазе в 10 центрах в России по инициативе американской компании Medivation. Испытания проводились по системе двойного слепого контроля. Терапевтическая эффективность оценивалась по шкалам ADAS-cog и CIBIC-plus по пяти параметрам, наиболее часто измеряемым при оценке больных БА. По всем показателям были получены высокие достоверные отличия от пациентов, получающих плацебо (р<0,0001) статье (Doody et al., 2007a, б; Doody et al., 2008).

Полученные результаты свидетельствуют о высоких терапевтических, нейропротекторных и когнитивно-стимулирующих свойствах димебона, что позволяет использовать его в качестве эталона при отборе новых перспективных соединений. Сравнение параметров влияния на ответы АМРА и NMDA рецепторов и когнитивно-стимулирующих свойств димебона и новых соединений-лидеров позволит нам понять связь между этими свойствами веществ и оценить их прогностическое значение при поиске новых потенциальных лекарственных средств.

Табл. 5. Соотношение концентраций и доз веществ, в которых они потенцируют АМРА рецепторы, блокируют NMDA рецепторы в электрофизиологических экспериментах и улучшают память животных в тесте узнавания новой локализации объекта (УНЛО).





Соединение: название или шифр

Потенциация АМРА рецепторов (макс % к контролю)

Блокада NMDA рецепторов, IC50

Эффективные дозы в тесте УНЛО, мг/кг

Димебон

2х10-7 – 2х10-5 М

(170%)



1) 7,7х10-6 М

2) 7,3х10-5 М



0,01- 0,15


IP5051

5х10-7 – 5х10-5 М

(1050%)



1) 0,4х10-6 М

2) 2,3х10-5 М



0,05 – 0,5*

IP9268

1х10-6–3х10-5 М

(770%)



Не действует

5,0

IP9150

1х10-9 –5х10-7 М

(165%)



1,5х10-6 М

0,05 – 2,0

IP9040

3х10-8–10-6 М

(148%)



8,0х10-7 М

0,1 – 1,0

Мемантин

Не действует

1,4х10-6 М

2,0 – 2,5

Примечание- доза 0,5 мг/кг находится на границе достоверности (р=0,51).

Четыре из представленных в табл. 5 соединений потенцируют АМРА рецепторы и одновременно блокируют NMDA рецепторы: димебон, IP5051, IP9150 и IP9040; одно соединение, IP9268, только потенцирует АМРА рецепторы, и не действуют на NMDA рецепторы. И препарат сравнения - мемантин, который только блокирует NMDA рецепторы. Все 4 вещества, которые потенцируют АМРА рецепторы и одновременно блокируют NMDA рецепторы, имеют, в отличие от “чистых” потенциаторов АМРА рецепторов, более низкие действующие дозы, в которых они улучшают память животных, и более широкий диапазон эффективных доз.

Димебон блокирует, как было сказано выше, NR2B содержащие NMDA рецепторы. Таким же образом действует и соединение IP5051. Оба вещества улучшают память, начиная с низких доз, и имеют широкий диапазон эффективных доз. Вероятно, способность этих веществ блокировать NR2B содержащие NMDA рецепторы вносит важный вклад в проявление ими когнитивно-стимулирующих свойств, поскольку недавно было показано, что избирательные антагонисты NR2B содержащих NMDA рецепторов улучшают память животных (Higgins et al., 2005).

Известно, что блокада ионного канала NMDA рецептора веществом приводит к серьезным побочным поведенческим эффектам и ухудшает память животных, если осуществляется аналогично действию МК-801 (Filliat, Blanchet, 1995; Noda et al., 2001). Однако эта блокада может не иметь побочных эффектов, и даже наоборот, существенно улучшать память, если она осуществляется по механизму действия препарата мемантин (Parsons et al., 2007). Мемантин связывается с участком внутри ионного канала NMDA рецептора, но в отличие от МК-801, легко покидает его при деполяризации, если ионный канал открыт (Parsons et al., 1993; Frankiewicz et al., 1996). Приведенный выше анализ блокирующего действия соединения IP9040 показал, что оно блокирует NMDA рецепторы подобно мемантину, результатом чего может быть усиление его когнитивно-стимулирующих свойств.

Исходя из полученных результатов, можно заключить, что сочетание у одного вещества свойств потенциатора АМРА рецепторов и блокатора NMDA рецепторов по определенным механизмам является крайне важным фактором для проявления веществом высоких когнитивно-стимулирующих свойств при нейродегенеративных заболеваниях.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, по результатам нашего исследования установлены оптимальные критерии модуляции глутаматных АМРА и NMDA рецепторов ЦНС для веществ, являющихся потенциальными препаратами для лечения нарушений когнитивных функций при нейродегенеративных заболеваниях. Изучение влияния на АМРА и NMDA рецепторы эндогенных пептидов: CLIP и соматостатина, играющих важную роль в механизмах памяти, показало, что они потенцируют токи АМРА и блокируют токи NMDA рецепторов. В результате изучения механизма действия на АМРА и NMDA рецепторы димебона установлено, что он потенцирует токи АМРА и блокируют токи NMDA рецепторов. Параметры его влияния на эти рецепторы существенно совпадают с параметрами влияния эндогенных стимуляторов памяти CLIP и соматостатина. Изучение действия новых веществ – производных дибензиламинов, алкилизотиомочевин, N,N'-замещенных 3,7-диазабицикло[3.3.1]нонанов, пирролидинов (аналогов АМРАкина BDP), модельных соединений на АМРА и NMDA рецепторы, а также их влияния на память в различных поведенческих тестах показало, что наиболее эффективно влияют на память те соединения, которые способны одновременно потенцировать АМРА рецепторы и блокировать NMDA рецепторы. Важнейшим элементом является способность вещества блокировать NMDA рецепторы по одному из двух возможных механизмов: неконкурентная блокада ионного канала подобно действию мемантина по механизму быстрой диссоциации с рецептором, или блокада NR2B субъединиц содержащих NMDA рецепторов.

В результате изучения действия веществ на АМРА и NMDA рецепторы на клеточном уровне были отобраны соединения- лидеры: IP5051, IP9040,7 IP9150 и ХХХ-2 (рис. 16). Все эти соединения (кроме ХХХ-2) потенцируют АМРА и блокируют NMDA рецепторы. В поведенческих экспериментах эти соединения оказывают наибольшее когнитивно-стимулирующее действие.

IP5051 IP9040 IP9150



XXX-2 димебон Мемантин


Рис. 16. Строение соединений-лидеров и препаратов сравнения.
Принципы отбора наиболее перспективных соединений в ряду лигандов глутаматных рецепторов представлены на схеме на рисунке 17. Согласно этой схеме эффективность соединений «двойного» действия в улучшении когнитивных функций особенно при нейродегенеративных заболеваниях оказывается существенно выше, чем действие мемантина (другого антагониста NMDA рецепторов) или просто «чистого» потенциатора АМРА рецепторов.

Установлено соответствие механизма действия на АМРА- и NMDA рецепторы новых соединений-лидеров действию наиболее эффективного препарата для лечения БА димебона, и их общее соответствие действию эндогенных стимуляторов памяти CLIP и соматостатина.



Рис.

17. Соединения с «двойным» механизмом действия на глутаматные рецепторы в условиях БА или другого снижения когнитивных функций при увеличении синаптического “шума” и снижении относительной величины “полезного сигнала”.

Примечание: 1 – блокада “шума” мемантином, 2 – потенциация ответа “чистым” потенциатором АМРА рецепторов (+ потенциация “шума”), 3 – влияние IP9040, IP5051 или димебона – потенциация ответа АМРАP + блокада “шума” NMDAР. Пре – пресинаптический нейрон, Пост – постсинаптический нейрон. Глу – медиатор глутамат. АМРАР и NMDAP – соответствующие рецепторы.


Таким образом, система поиска препаратов для коррекции когнитивных нарушений при нейродегенеративных заболеваниях среди лигандов глутаматных рецепторов предполагает наличие у вещества способности потенцировать АМРА рецепторы и одновременно блокировать NMDA рецепторы по одному из двух механизмов: блокада ионного канала по механизму быстрой диссоциации с рецептором или блокада NR2B субъединицы, действуя на сайт связывания ифенпродила. Эффективность данного подхода подтверждена в поведенческих тестах и клинических испытаниях, и имеет высокую прогностическую ценность.
Выводы

1. Электрофизиологическим методом patch-clamp показано существование в коре и гиппокампе головного мозга млекопитающих четырех типов нейронов, которые содержат различные NMDA рецепторы, отличающихся по совокупности ответов на NMDA, хинолинат, глицин, АР5 и АР7.

2. Определены параметры и характер ответов АМРА и NMDA рецепторов на воздействие отдельных эндогенных пептидов, которые подтверждают участие некоторых из них (кортикотропин-подобный промежуточный лобный пептид, соматостатин) в формировании памяти и механизмах эндогенной нейропротекции.

3. Из изученных новых представителей двух классов химических соединений – ациклических производных изотиомочевины и N,N¢-замещенных диазабициклононанов – отобраны наиболее активные соединения (IP5051, IP9040, IP9150 и ХХХ-2), обладающие свойствами эффективных позитивных модуляторов АМРА рецепторов.

4. Установлено, что исследованные соединения, потенцирующие АМРА рецепторы, улучшают обучение и память как интактных животных, так и животных с экспериментальной моделью болезни Альцгеймера в поведенческих тестах.

5. Установлено, что неконкурентная блокада NMDA рецепторов, осуществляемая или за счет блокады ионного канала по механизму быстрой диссоциации с рецептором, или за счет блокады NR2B субъединицы, вносит существенный вклад в характер проявления соединением его когнитивно-стимулирующей активности и широты терапевтического действия.

6. Установлен механизм действия отечественного препарата димебон на АМРА и NMDA рецепторы, что явилось одним из оснований для его медицинского применения по новому назначению в качестве лекарственного средства для лечения нейродегенеративных заболеваний (в частности, болезни Альцгеймера) и

стимулятора когнитивных функций.

7. Оптимальными критериями поиска препаратов для коррекции когнитивных нарушений при нейродегенеративных заболеваниях среди лигандов глутаматных рецепторов, являются их способность потенцировать АМРА рецепторы и одновременно блокировать NMDA рецепторы, что подтверждено в поведенческих тестах и клинических испытаниях, и имеет высокую прогностическую ценность.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Григорьев В.В. Гипервозбуждение, вызываемое возбуждающими аминокислотами и его фармакологическая коррекция [Текст] / В.В. Григорьев, В.А. Неманова, В.А. Рагулин // Глутаматные рецепторы. Тезисы I Всесоюзного совещания. Ленинград. – 1987. – С. 37.



2. Григорьев В.В. Исследование противосудорожной активности антагонистов глутаматных рецепторов в ряду фосфорсодержащих аминокарбоновых кислот [Текст] / В.В. Григорьев, B.B. Рагулин, B.A. Неманова, E.H. Цветков // Хим.-фарм. Ж. – 1988. – № 3. – С. 275-277.

3. Grigoriev V.V. Specific and functional differences of NMDA receptors [Текст] / V.V. Grigoriev, V.A. Nemanova, S.O. Bachurin // Proc. 7-th Conference of European Neurochemichal Society. Sweden, Stockholm. – 1988. – P. 143.



4. Григорьев В.В. Гиперактивность и судороги, вызываемые возбуждающими аминокислотами, и их фармакологическая коррекция [Текст] / В.В. Григорьев, В.А. Неманова; редкол. "Бюлл. Экспер. Биол. Мед". – М., – 1988. – 5 с. – Деп. В ВИНИТИ № 3469-В88.

5. Григорьев В.В. Фармакологические и функциональные различия NMDA-рецепторов у мышей и крыс [Текст] / В.В. Григорьев, В.В. Рагулин, Е.Н. Цветков // Синтез, фармакол. и клин. аспекты нов. психотр. и серд. сосуд. вещ-в. Тезисы межреспубликанской конференции., Волгоград., – 1989. – C. 73.

6. Григорьев В.В. Фосфорсодержащие аминокислоты – новый класс противосудорожных веществ [Текст] / В.В. Григорьев, В.А. Неманова, В.В. Рагулин, Е.Н. Цветков // Материалы XIY Менделеевского съезда. Москва.– 1989. – C. 175.

7. Григорьев В.В. Видовые и функциональные различия NMDA рецепторов

[Текст] / В.В. Григорьев, В.А. Неманова // Бюлл. экспер. Биол. Мед. – 1989. – № 9. – С. 299-302.

8. Grigoriev V.V. The action of glycine and competitive antagonists on NMDA-induced currents in the rat cortical neurons [Текст] / V.V. Grigoriev, V.V. Ragulin, S.O. Bachurin // Proc. of 13rd International Congress of International Society for Neurochemistry, Australia, Sydney. – 1991а. – P. 218.

9. Grigoriev V.V. Different influence of competitive antagonists (AP5 and AP7) on NMDA responses in rat and mice hippocampal neurons [Текст] / V.V. Grigoriev, V.A. Nemanova, V.V. Ragulin, S.O. Bachurin // Abstacts of 3rd International Congress of Comparative Physiology and Biochemistry, Tokyo. – 1991b. – P. 95.



10. Григорьев В.В. Видовые различия в действии конкурентных антагонистов NMDA-рецепторов в нейронах гиппокампа мышей и крыс [Текст] / В.В. Григорьев, В.А. Неманова, В.В. Рагулин // Докл. РАН. – 1992.– Т. 326, № 4.– С. 742-745.

11. Григорьев В.В. Действие NMDA и хинолиновой кислоты на нейроны коры головного мозга крыс. [Текст] / В.В. Григорьев // Докл. РАН. – 1993. – Т. 330, № 5. – С. 646-648.

12. Григорьев В.В. Общие рецепторы аспартата и хинолиновой кислоты, отличные от NMDA-рецепторов, на некоторых нейронах коры головного мозга крыс. [Текст] / В.В. Григорьев // Нейрофизиология/Neurophysiology. – 1993. – Т. 1, № 4. – С. 264-266.




Достарыңызбен бөлісу:
1   2   3   4




©dereksiz.org 2024
әкімшілігінің қараңыз

    Басты бет