электрофизиологических и фармакологических исследований новых

Сравнение действия димебона с действием ЦТ показало, что в основе потенцирующего влияния димебона на АМРА рецепторы лежит его способность снижать десенситизацию этих рецепторов.

Рис. 11. Действие димебона (1) и циклотиазида (2) на КК-вызванные токи в нейронах Пуркинье.

Примечание: по оси абсцисс – логарифм концентрация веществ в Молях. По оси ординат – амплитуда ответов в % по отношению к контролю. Амплитуда токов в контроле взята за 100%.

Таким образом, оба препарата блокируют NMDA рецепторы, но действуют, вероятно, на разные их субъединицы и/или на разные участки рецептора. Наши опыты подтверждают, что мемантин действует как блокатор открытого состояния ионного канала NMDA рецептора, действующий по механизму быстрой диссоциации с рецептором. Одной из вероятных мишеней действия димебона, в отличие от мемантина, является участок связывания ифенпродила, локализованный на NR2B-субъединице NMDA рецептора. Сравнительный анализ результатов компьютерного 3d моделирования, проведенного на кафедре органической химии МГУ им. М.В. Ломоносова,показал, что димебон может достаточно эффективно взаимодействовать с участком связывания ифенпродила на N-концевом домене NR2B субъединицы (чему соответствует блокада NMDA рецепторов в низких концентрациях в нейронах 1 группы), но гораздо менее

Рис. 12. Действие димебона (А) и мемантина (Б) на NMDA-вызванные токи в нейронах 1 группы.

Примечание: 1- контроль, 2 - при добавлении в физ.раствор 10 мкМ димебона (А) и 20 мкМ мемантина (Б), 3 - ответы после 3 минут отмывки. Калибровка: вертикальная- 200 рА, горизонтальная – 2 сек.
эффективно взаимодействовать с участком связывания МК-801 внутри ионного канала NMDA рецептора (Тихонова, 2005; Tihonova et al., 2002) (блокада NMDA рецепторов в высоких концентрациях в нейронах 2 группы).

Изучение влияния димебона на память в поведенческих экспериментах. Тест УРАИ выполнен на животных с экспериментальной моделью БА. Животные, у которых нейротоксином AF64A были разрушены холинергические нейроны, получали димебон в дозе 1,0 мг/кг в течение 12 дней. В результате исследования установлено, что димебон существенно уменьшает латентное время перехода крыс в другую камеру, что свидетельствует о его позитивном влиянии

на обучение и память экспериментальных животных (рис. 13, рис. 14).

Также изучено влияние димебона на память мышей в тесте узнавания известного объекта в новой локализации (рис. 15). В данном тесте димебон достоверно улучшает память мышей в дозах 0,01 – 0,15 мг/кг.

Рис. 13. Влияние димебона в дозе 1,0 мг/кг на латентное время перехода крыс в другую камеру после подачи условного сигнала сразу после обучения.

Рис. 14. Влияние димебона в дозе 1,0 мг/кг на латентное время перехода крыс в другую камеру после подачи условного сигнала после через 24 часа после обучения (влияние на память).

Рис. 15. Влияние различных доз димебона на продолжительность обследования объекта в известной и новой локализации. Ряд 1- известная локализация, Ряд 2- новая локализация.

Двигательная активность молодых животных в возрасте 4-5 месяцев по числу пересеченных квадратов в тесте “открытое поле” составляла 59,5±6,16; старых контрольных животных – 9,17±4,27, старых животных, хронически получающих димебон – 18,83±4,34 (р<0,05). Т.е. димебон существенно сохранял

двигательную активность старых животных.

Средние массы всех органов у животных экспериментальной группы были ближе к массам органов молодых животных. Они имели меньшие отклонения от среднего значения, что также характерно для молодых животных и, по-видимому, связано с меньшим количеством органных патологий, значительно изменяющих массу того или иного органа.

Димебон увеличивал среднюю и максимальную продолжительность жизни животных. Наиболее показательно это проявилось в конце эксперимента: если сравнить количество живых мышей в каждой возрастной группе: 900, 950 и 1000 дней, то мы увидим, что если в группе 900 дней количество доживших животных опытной группы превышало таковых в контрольной только на 28% (р≤0,05), то в группе 950 дней уже в 2,5 раза (р<0,002), а в группе 1000 дней – в 4 раза (р<0,0001).

При микроскопическом изучении взятых в исследование органов и тканей животных обеих групп существенных изменений в их гистоструктуре не выявлено, за исключением миокарда и головного мозга. В миокарде мышей контрольной группы определяются четкие изменения со стороны ядер кардиомиоцитов по типу кариорексиса и кариолизиса. Кроме того, определяются очаги фрагментации волокон. Вышеописанные изменения со стороны миокарда мышей опытной группы почти не наблюдаются. Микроскопическая характеристика вещества больших полушарий и мозжечка головного мозга мышей обеих групп соответствует нормальному строению. Однако у большинства животных контрольной группы, по сравнению с опытной, относящихся к одной возрастной группе, выявлен выраженный перицеллюлярный отек и разрежение вещества мозга.

Таким образом, проведенный эксперимент на старых животных – мышах-самках линии С57Bl/6 - показал, что димебон при его ежедневном пожизненном применении в течение 15 месяцев оказывает выраженное нейропротекторное и цитопротекторное действие. Димебон ни по одному показателю не проявил побочных токсических эффектов, что предполагает его безопасное использования на людях в течение продолжительного времени (Bachurin et al., 2007). На основании полученных результатов была подана заявка в Росздравнадзор для получения разрешения медицинского применения димебона по новому назначению в качестве лекарственного средства для лечения болезни Альцгеймера и стимулятора когнитивных функций.

На основании разрешения Росздравнадзора в начале 2006 года начались клинические испытания димебона на 2-ой фазе в 10 центрах в России по инициативе американской компании Medivation. Испытания проводились по системе двойного слепого контроля. Терапевтическая эффективность оценивалась по шкалам ADAS-cog и CIBIC-plus по пяти параметрам, наиболее часто измеряемым при оценке больных БА. По всем показателям были получены высокие достоверные отличия от пациентов, получающих плацебо (р<0,0001) статье (Doody et al., 2007a, б; Doody et al., 2008).

Полученные результаты свидетельствуют о высоких терапевтических, нейропротекторных и когнитивно-стимулирующих свойствах димебона, что позволяет использовать его в качестве эталона при отборе новых перспективных соединений. Сравнение параметров влияния на ответы АМРА и NMDA рецепторов и когнитивно-стимулирующих свойств димебона и новых соединений-лидеров позволит нам понять связь между этими свойствами веществ и оценить их прогностическое значение при поиске новых потенциальных лекарственных средств.

Табл. 5. Соотношение концентраций и доз веществ, в которых они потенцируют АМРА рецепторы, блокируют NMDA рецепторы в электрофизиологических экспериментах и улучшают память животных в тесте узнавания новой локализации объекта (УНЛО).

Четыре из представленных в табл. 5 соединений потенцируют АМРА рецепторы и одновременно блокируют NMDA рецепторы: димебон, IP5051, IP9150 и IP9040; одно соединение, IP9268, только потенцирует АМРА рецепторы, и не действуют на NMDA рецепторы. И препарат сравнения - мемантин, который только блокирует NMDA рецепторы. Все 4 вещества, которые потенцируют АМРА рецепторы и одновременно блокируют NMDA рецепторы, имеют, в отличие от “чистых” потенциаторов АМРА рецепторов, более низкие действующие дозы, в которых они улучшают память животных, и более широкий диапазон эффективных доз.

Димебон блокирует, как было сказано выше, NR2B содержащие NMDA рецепторы. Таким же образом действует и соединение IP5051. Оба вещества улучшают память, начиная с низких доз, и имеют широкий диапазон эффективных доз. Вероятно, способность этих веществ блокировать NR2B содержащие NMDA рецепторы вносит важный вклад в проявление ими когнитивно-стимулирующих свойств, поскольку недавно было показано, что избирательные антагонисты NR2B содержащих NMDA рецепторов улучшают память животных (Higgins et al., 2005).

Известно, что блокада ионного канала NMDA рецептора веществом приводит к серьезным побочным поведенческим эффектам и ухудшает память животных, если осуществляется аналогично действию МК-801 (Filliat, Blanchet, 1995; Noda et al., 2001). Однако эта блокада может не иметь побочных эффектов, и даже наоборот, существенно улучшать память, если она осуществляется по механизму действия препарата мемантин (Parsons et al., 2007). Мемантин связывается с участком внутри ионного канала NMDA рецептора, но в отличие от МК-801, легко покидает его при деполяризации, если ионный канал открыт (Parsons et al., 1993; Frankiewicz et al., 1996). Приведенный выше анализ блокирующего действия соединения IP9040 показал, что оно блокирует NMDA рецепторы подобно мемантину, результатом чего может быть усиление его когнитивно-стимулирующих свойств.

Исходя из полученных результатов, можно заключить, что сочетание у одного вещества свойств потенциатора АМРА рецепторов и блокатора NMDA рецепторов по определенным механизмам является крайне важным фактором для проявления веществом высоких когнитивно-стимулирующих свойств при нейродегенеративных заболеваниях.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, по результатам нашего исследования установлены оптимальные критерии модуляции глутаматных АМРА и NMDA рецепторов ЦНС для веществ, являющихся потенциальными препаратами для лечения нарушений когнитивных функций при нейродегенеративных заболеваниях. Изучение влияния на АМРА и NMDA рецепторы эндогенных пептидов: CLIP и соматостатина, играющих важную роль в механизмах памяти, показало, что они потенцируют токи АМРА и блокируют токи NMDA рецепторов. В результате изучения механизма действия на АМРА и NMDA рецепторы димебона установлено, что он потенцирует токи АМРА и блокируют токи NMDA рецепторов. Параметры его влияния на эти рецепторы существенно совпадают с параметрами влияния эндогенных стимуляторов памяти CLIP и соматостатина. Изучение действия новых веществ – производных дибензиламинов, алкилизотиомочевин, N,N'-замещенных 3,7-диазабицикло[3.3.1]нонанов, пирролидинов (аналогов АМРАкина BDP), модельных соединений на АМРА и NMDA рецепторы, а также их влияния на память в различных поведенческих тестах показало, что наиболее эффективно влияют на память те соединения, которые способны одновременно потенцировать АМРА рецепторы и блокировать NMDA рецепторы. Важнейшим элементом является способность вещества блокировать NMDA рецепторы по одному из двух возможных механизмов: неконкурентная блокада ионного канала подобно действию мемантина по механизму быстрой диссоциации с рецептором, или блокада NR2B субъединиц содержащих NMDA рецепторов.

В результате изучения действия веществ на АМРА и NMDA рецепторы на клеточном уровне были отобраны соединения- лидеры: IP5051, IP9040,7 IP9150 и ХХХ-2 (рис. 16). Все эти соединения (кроме ХХХ-2) потенцируют АМРА и блокируют NMDA рецепторы. В поведенческих экспериментах эти соединения оказывают наибольшее когнитивно-стимулирующее действие.

IP5051 IP9040 IP9150

XXX-2 димебон Мемантин

Установлено соответствие механизма действия на АМРА- и NMDA рецепторы новых соединений-лидеров действию наиболее эффективного препарата для лечения БА димебона, и их общее соответствие действию эндогенных стимуляторов памяти CLIP и соматостатина.

Рис.

17. Соединения с «двойным» механизмом действия на глутаматные рецепторы в условиях БА или другого снижения когнитивных функций при увеличении синаптического “шума” и снижении относительной величины “полезного сигнала”.

Примечание: 1 – блокада “шума” мемантином, 2 – потенциация ответа “чистым” потенциатором АМРА рецепторов (+ потенциация “шума”), 3 – влияние IP9040, IP5051 или димебона – потенциация ответа АМРАP + блокада “шума” NMDAР. Пре – пресинаптический нейрон, Пост – постсинаптический нейрон. Глу – медиатор глутамат. АМРАР и NMDAP – соответствующие рецепторы.

1. Электрофизиологическим методом patch-clamp показано существование в коре и гиппокампе головного мозга млекопитающих четырех типов нейронов, которые содержат различные NMDA рецепторы, отличающихся по совокупности ответов на NMDA, хинолинат, глицин, АР5 и АР7.

2. Определены параметры и характер ответов АМРА и NMDA рецепторов на воздействие отдельных эндогенных пептидов, которые подтверждают участие некоторых из них (кортикотропин-подобный промежуточный лобный пептид, соматостатин) в формировании памяти и механизмах эндогенной нейропротекции.

3. Из изученных новых представителей двух классов химических соединений – ациклических производных изотиомочевины и N,N¢-замещенных диазабициклононанов – отобраны наиболее активные соединения (IP5051, IP9040, IP9150 и ХХХ-2), обладающие свойствами эффективных позитивных модуляторов АМРА рецепторов.

4. Установлено, что исследованные соединения, потенцирующие АМРА рецепторы, улучшают обучение и память как интактных животных, так и животных с экспериментальной моделью болезни Альцгеймера в поведенческих тестах.

5. Установлено, что неконкурентная блокада NMDA рецепторов, осуществляемая или за счет блокады ионного канала по механизму быстрой диссоциации с рецептором, или за счет блокады NR2B субъединицы, вносит существенный вклад в характер проявления соединением его когнитивно-стимулирующей активности и широты терапевтического действия.

6. Установлен механизм действия отечественного препарата димебон на АМРА и NMDA рецепторы, что явилось одним из оснований для его медицинского применения по новому назначению в качестве лекарственного средства для лечения нейродегенеративных заболеваний (в частности, болезни Альцгеймера) и

стимулятора когнитивных функций.

7. Оптимальными критериями поиска препаратов для коррекции когнитивных нарушений при нейродегенеративных заболеваниях среди лигандов глутаматных рецепторов, являются их способность потенцировать АМРА рецепторы и одновременно блокировать NMDA рецепторы, что подтверждено в поведенческих тестах и клинических испытаниях, и имеет высокую прогностическую ценность.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Григорьев В.В. Гипервозбуждение, вызываемое возбуждающими аминокислотами и его фармакологическая коррекция [Текст] / В.В. Григорьев, В.А. Неманова, В.А. Рагулин // Глутаматные рецепторы. Тезисы I Всесоюзного совещания. Ленинград. – 1987. – С. 37.

3. Grigoriev V.V. Specific and functional differences of NMDA receptors [Текст] / V.V. Grigoriev, V.A. Nemanova, S.O. Bachurin // Proc. 7-th Conference of European Neurochemichal Society. Sweden, Stockholm. – 1988. – P. 143.

5. Григорьев В.В. Фармакологические и функциональные различия NMDA-рецепторов у мышей и крыс [Текст] / В.В. Григорьев, В.В. Рагулин, Е.Н. Цветков // Синтез, фармакол. и клин. аспекты нов. психотр. и серд. сосуд. вещ-в. Тезисы межреспубликанской конференции., Волгоград., – 1989. – C. 73.

6. Григорьев В.В. Фосфорсодержащие аминокислоты – новый класс противосудорожных веществ [Текст] / В.В. Григорьев, В.А. Неманова, В.В. Рагулин, Е.Н. Цветков // Материалы XIY Менделеевского съезда. Москва.– 1989. – C. 175.

7. Григорьев В.В. Видовые и функциональные различия NMDA рецепторов

[Текст] / В.В. Григорьев, В.А. Неманова // Бюлл. экспер. Биол. Мед. – 1989. – № 9. – С. 299-302.

8. Grigoriev V.V. The action of glycine and competitive antagonists on NMDA-induced currents in the rat cortical neurons [Текст] / V.V. Grigoriev, V.V. Ragulin, S.O. Bachurin // Proc. of 13rd International Congress of International Society for Neurochemistry, Australia, Sydney. – 1991а. – P. 218.

9. Grigoriev V.V. Different influence of competitive antagonists (AP5 and AP7) on NMDA responses in rat and mice hippocampal neurons [Текст] / V.V. Grigoriev, V.A. Nemanova, V.V. Ragulin, S.O. Bachurin // Abstacts of 3rd International Congress of Comparative Physiology and Biochemistry, Tokyo. – 1991b. – P. 95.

12. Григорьев В.В. Общие рецепторы аспартата и хинолиновой кислоты, отличные от NMDA-рецепторов, на некоторых нейронах коры головного мозга крыс. [Текст] / В.В. Григорьев // Нейрофизиология/Neurophysiology. – 1993. – Т. 1, № 4. – С. 264-266.