Регуляция I и II типов программированной клеточной гибели т-лимфоцитов при атопической бронхиальной астме 03. 01. 04 биохимия
жүктеу/скачать 493.6 Kb.
|
- Бұл бет үшін навигация:
- Оценка апоптоза Т-лимфоцитов периферической крови больных легкой и тяжелой формами атопической бронхиальной астмой
- Оценка аутофагии в Т-лимфоцитах больных бронхиальной астмой.
Рис. 1. Микрофотографии Т-лимфоцитов периферической крови здоровых доноров. (a) Микрофотография типичного Т-лимфоцита, полученная с помощью электронной микроскопии. Шкала - 500 нм, увеличение 12000 раз; (б) Микрофотография типичного Т-лимфоцита, полученная с помощью атомно-силовой микроскопии; в) Изображение поверхности Т-лимфоцита здорового донора. Я – ядро, ХР – хроматин, М – митохондрия, АГ – Аппарат Гольджи, ЭПР – эндоплазматический ретикулум. Стрелками показаны микроворсинки и псевдоподии. Большая часть Т-лимфоцитов больных легкой формой астмы обладает характерными морфологическими признаками Т-клеток, однако часть лимфоцитов имеет не значительные морфологические отличия по сравнению с контрольной группой (рис. 2, а). Для всех Т-лимфоцитов данной группы характерно наличие правильной овальной формы. Однако плазматическая мембрана, в отличие от контрольной группы, образует инвагинации. Ядра лимфоцитов, как и сами клетки, имеют овальную форму, ярко выраженный лопастной вид. Хроматин ядра – конденсированный и расположен по его периферии. В цитоплазме различимы клеточные компоненты. На АСМ-изображениях Т-лимфоциты данной группы больных, также как и на ТЭМ-микроснимках, имеют правильную округлую форму с достаточно крупным ядром, которое занимает почти весь объем клетки (рис. 2, б). Ядро имеет овальную форму и расположено эксцентрично. В сравнении с лимфоцитами контрольной группы, у Т-клеток больных легкой формой астмы отсутствуют клеточные микроворсинки, но сама клеточная мембрана формирует различные инвагинации. На поверхности плазматической мембраны глобулярная структура выявляется более отчетливо, чем в контрольной группе. Количество глобул увеличивается, но размер их уменьшается (20,5±5,5 нм; р<0,05) (рис. 2, в).
Рис. 2. Микрофотографии Т-лимфоцитов периферической крови больных легкой формой атопической бронхиальной астмой. a) Микрофотография типичного Т-лимфоцита больного легкой формой АБА, полученная с помощью электронной микроскопии. Шкала – 1 мкм, увеличение 12000 раз; б) Микрофотография типичного Т-лимфоцита, полученная с помощью атомно-силовой микроскопии; в) Изображение поверхности Т-лимфоцита больного легкой формой астмы. Я – ядро, ХР – хроматин, М – митохондрия. Мы можем предположить, что подобная структура связана с появлением различных белков на поверхности клеток, например, маркеров активации CD4+ лимфоцитов или белков-адгезии (L-селектинов), экспрессия которых увеличивается при бронхиальной астме (Simon, 2010). В группе больных тяжелой формой астмы наряду с нормальными клетками, встречаются Т-лимфоциты с морфологическими изменениями (рис. 3, а). Обнаруживаются глубокие инвагинации ядерных мембран, изменения цитолеммы и поверхностных структур клетки, отсутствие микроворсинок и десмосом. Клеточная поверхность формирует многочисленные выросты, выявляются блеббинги. Отмечено наличие везикул с электронно-светлым содержимым, мультиламеллярных телец, а также аутофагосом с содержимым средней электронной плотности. Целостность мембран Т-лимфоцитов не нарушена.
Рис. 3. Микрофотографии Т-лимфоцитов периферической крови больных тяжелой формой атопической бронхиальной астмой. a) Микрофотография типичного Т-лимфоцита больного тяжелой формой астмы, полученная с помощью электронной микроскопии. Шкала – 500 нм, увеличение 12000 раз; б) Микрофотография типичного Т-лимфоцита, полученная с помощью атомно-силовой микроскопии; в) Изображение поверхности Т-лимфоцита больного тяжелой формой астмы. Я – ядро, ХР – хроматин, М – митохондрия, АГ – Аппарат Гольджи, АФ – аутофагосома, БЛ - блеббинг. АСМ-исследование Т-лимфоцитов больных тяжелой формой астмы показало, что эта группа характеризуется наличием как нормальных клеток с типичной сферической формой, так и с выраженными морфологическими изменениями (рис. 3, б). Клеточная мембрана образует многочисленные глубокие инвагинации, микроворсинки и псевдоподии отсутствуют. Ядро также формирует инвагинации. Сканирование поверхности Т-лимфоцитов больных тяжелой формой астмы показало, что, также как и в группе с легкой формой, имеется большое количество глобулярных структур, но они большего размера (47,1±11,3 нм; р<0,05). В то время как у измененных клеток глобулы становятся трудноразличимыми, диффузионными, а их количество уменьшается (рис. 3, в). Топографические и наноструктурные изменения Т-лимфоцитов в группе с тяжелой формой астмы могут быть связаны с перестройкой цитоскелета и / или более массовой активацией Т-клеток, чем у больных с легкой формой заболевания. Для взаимодействия клеточных и гуморальных компонентов между собой необходимо участие молекул адгезии. При воспалении происходит повышенная экспрессия молекул адгезии в очаге воспаления, что приводит к аккумуляции и задержке лимфоцитов в бронхах. С помощью метода атомно-силовой микроскопии была определена сила адгезии на поверхности Т-лимфоцитов у больных с разной степенью тяжести астмы. Считая линейной зависимость силы от смещения кантилевера относительно поверхности клетки, сила адгезии F (измеряемая в наноньютонах, нН) определяется согласно закону Гука:
При исследовании Т-лимфоцитов в различных группах нами были получены значения силы адгезии на поверхности Т-клеток и выявлена прямая корреляционная зависимость между значением силы адгезии F и степенью тяжести заболевания (рис. 4). Было установлено, что с увеличением тяжести астмы происходит увеличение силы адгезии на поверхности Т-лимфоцитов. Таким образом, можно предположить, что повышенная аккумуляция Т-лимфоцитов на стенках бронхов может быть обусловлена молекулами адгезии и межмолекулярным взаимодействием и, как показано в проведенном эксперименте. Полученные результаты исследований могут быть полезны для дальнейшего понимания взаимосвязи между топографией клеток (механическими свойствами плазматической мембраны) и функцией Т-лимфоцитов в иммунном ответе. С целью выяснения характера нарушений программированной гибели Т-лимфоцитов при бронхиальной астме и влияния на данный процесс синтетического глюкокортикоида - дексаметазона – на следующем этапе работы было проведено исследование выраженности спонтанного и индуцированного апоптоза в Т-лимфоцитах пациентов после 3 и 6 дней культивирования in vitro. Оценка апоптоза Т-лимфоцитов периферической крови больных легкой и тяжелой формами атопической бронхиальной астмой Для изучения биохимических параметров апоптоза, инициация которого происходит в процессе длительного культивирования клеток, было необходимо оценить, во-первых, динамику роста Т-лимфоцитов на 3 и 6 сутки культивирования. И, во-вторых, исследовать влияние дексаметазона (индуктора апоптоза) на рост клеток в культуре. Сравнительный анализ показал, что в группе с легкой формой астмы динамика роста Т-лимфоцитов в целом совпадает с группой контроля (рис. 5). Однако мы установили, что, несмотря на добавление в питательную среду дексаметазона, клетки больных легкой формой астмы проявляли устойчивость к апоптозу, что выражалось в незначительном снижении количества Т-лимфоцитов под влиянием глюкокортикоида на 3 сутки культивирования (рис. 5, а). На 6 сутки культивирования содержание Т-клеток в группе с легкой формой астмы было достоверно выше по сравнению с группой контроля. Падение содержания Т-лимфоцитов на 6 сутки культивирования связано со снижением содержания питательных веществ в среде, вследствие чего в клетках происходит активация программы гибели (рис. 5, б). Таким образом, изменение содержания Т-лимфоцитов в группе с легкой формой заболевания относительно контрольной группы на 6 сутки культивирования может быть связано с подавлением апоптоза, что согласуется с литературными данными (Бойчук, 2001; Spinozzi, 2008). Однако установленные изменения могут быть проявлением активации другого физиологического процесса – аутофагии, которая способствует выживанию клеток в условиях снижения питательных веществ. Изменение динамики пролиферативной активности было также выявлено в группе с тяжелой формой астмы (рис. 5). В отличие от здоровых доноров и больных легкой формой астмы, у больных с тяжелой формой содержание Т-лимфоцитов относительно 0 суток практически не менялось как на 3, так и на 6 сутки культивирования (рис. 5, а, б). Незначительное повышение количества Т-клеток к 3 суткам говорит о снижение пролиферативной активности клеток. А слабое падение содержания Т-лимфоцитов на 6 сутки, так же как и в группе с легкой формой заболевания, может быть связано с устойчивостью клеток к апоптозу, либо с активацией аутофагии.
Рис. 5. Изменение содержания Т-лимфоцитов в группах контроля (К) и больных бронхиальной астмой с легкой (Л) и тяжелой (Т) формами астмы в присутствии и отсутствии в питательной среде дексаметазона (Д) (10-4М) на 3 (а) и 6 сутки (б) культивирования. Изменение динамики пролиферативной активности в зависимости от тяжести заболевания может быть обусловлено активацией апоптотического процесса. Спонтанную инициацию апоптоза можно наблюдать уже в первые дни культивирования, однако, она не значительна. Поэтому мы провели исследование биохимических параметров апоптоза Т-лимфоцитов до их культивирования (рис. 6). Результаты показали, что содержание апоптотических клеток во всех исследуемых группах не превышает 2% от общего количества лимфоцитов.
Рис. 6. Содержание Т-лимфоцитов с ранними (а) и поздними (б) признаками апоптоза в группах больных легкой (Л) и тяжелой (Т) формами атопической бронхиальной астмы, а также в группе контроля (К) до культивирования в присутствии и отсутствии дексаметазона (Д) (10-4М). Длительное культивирование лимфоцитов в питательной среде сопровождается истощением ростовых факторов, вследствие чего запускается апоптоз. Исследование основных биохимических параметров апоптоза (экспрессия фосфатидилсерина на плазматической мембране и фрагментация ДНК) проводилось на 3 и 6 сутки культивирования. Оценка экспрессии фосфатидилсерина (ФС) на поверхности клеток на 3 сутки культивирования показала, что содержание Т-лимфоцитов с ранними признаками апоптоза достоверно ниже (p<0,05) у больных астмой (рис. 7, а). Инкубация с дексаметазоном индуцировала транслокацию фосфатидилсерина с внутренней стороны плазматической мембраны на внешнюю, инициируя, таким образом, ранние этапы апоптотического процесса, однако динамика существенно различалась между лимфоцитами различных групп (рис. 7, а). Наиболее высокое содержание апоптотических клеток отмечено в группе контроля. Индуцирующее влияние дексаметазона на апоптоз также отмечено в группе с легкой формой астмы. В группе с тяжелой формой под влиянием дексаметазона содержание клеток с ранними признаками апоптоза оказалось наименьшим. Продолжение культивирования Т-лимфоцитов в питательной среде в течение 6 суток показало относительную резистентность к развитию апоптоза в группах с легкой и тяжелой формой заболевания, в то время как в контрольной группе отмечено достоверное повышение содержания апоптотических клеток (рис. 7, б). Культивирование клеток с дексаметазоном привело к увеличению содержания апоптотических клеток во всех исследуемых группах (рис. 7, б). Содержание Т-лимфоцитов, находящихся на поздней стадии апоптоза, после 3 суток культивирования было не значительным во всех исследуемых группах (рис. 8, а). Добавление дексаметазона стимулировало апоптоз в Т-лимфоцитах, за исключением группы больных тяжелой формой астмы, в которой клетки проявляли слабую чувствительность к индуцированному апоптозу.
Рис. 7. Изменение содержания Т-лимфоцитов с ранними признаками апоптоза в группах больных легкой (Л) и тяжелой (Т) формами атопической бронхиальной астмой, а также в группе контроля (К) в процессе культивирования в присутствии и отсутствии в питательной среде дексаметазона (Д) (10-4М). а) Содержание Т-лимфоцитов после 3 дней культивирования; б) Содержание Т-лимфоцитов после 6 дней культивирования.
Рис. 8. Изменение содержания Т-лимфоцитов с поздними признаками апоптоза в группах больных легкой (Л) и тяжелой (Т) формами атопической бронхиальной астмой, а также в группе контроля (К) в процессе культивирования в присутствии и отсутствии в питательной среде дексаметазона (Д) (10-4М). а) Содержание апоптотических Т-лимфоцитов после 3 дней культивирования; б) Содержание апоптотических Т-лимфоцитов после 6 дней культивирования. На 6 сутки культивирования установлено повышение содержания клеток с поздними признаками апоптоза в контрольной группе (рис. 8, б). В группах с легкой и тяжелой формами астмы содержание апоптотических клеток оказалось достоверно ниже (p<0,05). Культивирование Т-лимфоцитов больных астмой с дексаметазоном в течение 6 суток оказало слабую стимуляцию апоптоза (рис. 8, б). Поскольку были получены противоречивые данные относительно динамики пролиферативной активности Т-лимфоцитов и установлено угнетение апоптотического процесса у больных АБА, на следующем этапе работы мы провели изучение другого типа ПКГ – аутофагии. Оценка аутофагии в Т-лимфоцитах больных бронхиальной астмой. Мы провели морфологический анализ микрофотографий Т-лимфоцитов всех исследуемых групп (полученных с помощью метода электронной микроскопии) на 3 сутки культивирования. Поскольку в настоящее время отсутствует информация о влиянии дексаметазона на процесс аутофагии, мы исследовали его влияние на процесс аутофагии. В результате экспериментальных работ мы установили, что большая часть Т-лимфоцитов здоровых доноров обладает морфологией, соответствующей апоптотическим изменениям на ранней стадии процесса, однако аутофагосомы не были выявлены (рис. 9, а). Культивирование с дексаметазоном привело к стимуляции поздних этапов апоптоза, что согласовывалось с результатами цитометрии (рис. 9, б). Активация аутофагии (наличие аутофагосом в клетках) под влиянием дексаметазона не была установлена.
Анализ микрофотографий Т-лимфоцитов больных легкой формой АБА показал, что большая часть клеток сохраняет типичную морфологию пролиферирующих клеток (рис. 10, а). Но при этом обнаружены крупные аутофагасомы, внутри которых достаточно хорошо детерминированы различные клеточные компоненты (рис. 10, а, б). Инициация аутофагии в клетках вызвана истощением питательных веществ в среде в процессе культивирования. Можно предположить, что в отличие от контрольной группы, где стресс индуцирует апоптоз, в группе с легкой формой астмы Т-лимфоциты продолжают функционировать, получая необходимые соединения за счет «переваривания» собственных компонентов.
Помимо лимфоцитов с вышеописанными морфологическими изменениями были обнаружены фрагменты погибших клеток, в которых большая часть содержимого представлена аутофагосомами (рис. 10, в). Это может свидетельствовать о том, что гибель клеток была опосредована запуском ПКГ по типу II или аутофагической гибели, а не апоптотической. Таким образом, в условиях снижения апоптотической активности в Т-клетках больных легкой формой астмы инициируется программа аутофагии, способствующая гибели клеток и поддержанию клеточного гомеостаза в целом. Культивирование Т-лимфоцитов больных легкой формой заболевания с дексаметазоном сказывалось на стимулировании ранних этапов апоптоза и ингибировании аутофагии (рис. 10, г). У больных тяжелой формой астмы наряду с характерными признаками ранних и поздних этапов апоптоза было отмечено повышенное содержание вакуолей и аутофагосом (рис. 11, а, б). То есть в Т-клетках возникает парадоксальная ситуация: с одной стороны инициируется программа гибели клетки - апоптоза, с другой стороны происходит активация аутофагии, способствующая выживанию Т-лимфоцитов. Вероятно, в данном случае аутофагия является необходимым стимулом апоптоза. Культивирование клеток данной группы больных с дексаметазоном способствовало интенсивной активации аутофагии: отмечено значительное увеличение количества и размера аутофагосом в клетках (рис. 11, в, г). При этом апоптотические проявления оказываются незначительными.
жүктеу/скачать 493.6 Kb. Достарыңызбен бөлісу:
|
в
