Ресвератрол на основе комбинаторных стратегий борьбы с раковыми заболеваниями

5-FU is widely used for the treatment of many types of cancers, including colorectal, breast, and cancers of the aerodigestive tract. Notably, 5-FU is routinely employed in the management of colorectal cancer via one of the two FDA-approved first line combinatorial chemotherapy regimes, which involve intravenous administration of the fluorinated base analog[^10,11]. One problem with 5-FU treatment is that more than 50% of tumors demonstrate resistance to5-FU in the clinical setting. Thus, novel treatments are needed to treat these resistant tumors. Novel biological agents, such as the monoclonal antibodies Cetuximab (an epidermal growth factor receptor inhibitor) and Bevacizumab (a vascular endothelial growth factor inhibitor), have recently been shown to provide additional clinical benefit for patients with metastatic colorectal cancer. However, these agents have demonstrated marginal results when treating resistant tumors[^51,52].

During the past few decades, investigators have attempted to elucidate the mechanism underlying 5-FU resistance[^10-12]. Some investigators developed 5-FU resistant cell lines and studied their sensitivity to multiple chemotherapeutic agents by activation and inhibition of several signaling pathways[^53,54]. Unfortunately, none of these agents showed promising results.

In the present report, we developed a new strategy for overcoming 5-FU resistance by establishing 5-FU-R cell lines and studying their sensitivity to a combination treatment with BCNU and Res. BCNU and Res display anti-cancer properties by inducing DNA damage, arresting cell cycle progression, inhibiting anti-apoptotic makers and autophagy[^13,28]. We have shown recently that moderately low concentration of 5-FU (0.5 μmol/L) increased chemoprevention potential of Res in colon cancer cells[⁷]. However, in that report we could not eliminate the probability of 5-FU resistance because of presence of 5-FU. Thus, that cocktail will not be appropriate for the treatment of 5-FU resistance patients. In the present study, we treated the cells with BCNU and Res to increase the sensitivity of 5-FU resistant cell lines. Initially, we checked whether BCNU and Res combination increase the sensitivity of 5-FU sensitive HCT-116 cells. LC₅₀ was observed at 60 μmol/L BCNU and 35 μmol/L Res; however, the same amount of cell death was observed when 18 μmol/L Res was combined with 20 μmol/L BCNU. Reduction of both BCNU and Res concentration for fifty percent cell death revealed that BCNU and Res killed HCT-116 colon cancer cells synergistically (Figure ​(Figure1B).1B). The isobologram data (Figure ​(Figure6F)6F) also support the synergistic action of BCNU and Res to kill colon cancer cells.

Cell death associated with the synergistic effects of treating cells with a combination of BCNU and Res was further confirmed by multiple parameters, such as DAPI nuclear staining, comet assay, FACS analysis and measuring the expression patterns of several DNA damage/repair, cell cycle regulatory and apoptosis related protein biomarkers. Increased numbers of apoptotic nuclei after DAPI stain, average comet formation and comet length, percentage of sub G₁ population were observed after combined treatment (BCNU + Res) in HCT-116 cells. An increased ratio of BAX/BCL-XL, cleaved product of PARP, tumor suppressor PTEN, cell cycle regulatory protein p21, and CASPASE-3 were also noted in BCNU and Res combination. Thus, the data suggests that the BCNU and Res combination represents a potential treatment option for 5-FU resistant colon cancer.

We have developed a 5-FU resistant cell line from 5-FU sensitive HCT-116 cells by continuous treatment with 5-FU. These cells were resistant to 5-FU, but sensitive to other chemotherapeutic agents, such as Res. The cell death effects of the BCNU and Res combination in the resistant cell lines were measured. MTT cell survival, DAPI nuclear staining and comet assays showed that the BCNU + Res combination was highly effective to sensitize the 5-FU-R cells in comparison to individual compounds. They caused cell death synergistically. The FACS analysis showed approximately 70% cell death when 20 μmol/L BCNU combined with 8 μmol/L Res (Figure ​(Figure6C).6C). By contrast, approximately 60% cell death was observed when 20 μmol/L of BCNU combined with 30 μmol/L Res in HCT-116 sensitive cells. Increased percentages (70% vs 60%) of apoptosis even at lower concentration of Res (8 μmol/L vs 30 μmol/L) indicated that Res was more effective to sensitize the 5-FU-R than HCT-116 cells when combined with BCNU. The expression of PARP cleaved product and BAX/BCL-XL ratio increased with the combined treatment (BCNU + Res) in 5-FU-R cells compared with Res and BCNU alone (Figure ​(Figure6D).6D). Isobologram analysis also indicated that BCNU and Res also killed the 5-FU-R cells synergistically.

To study the mechanism of action of the BCNU and Res combination, we have first analyzed whether the DNA damage/repair pathway was involved. Comet assays showed that the average comet length and comet formation increased in both 5-FU sensitive and resistant cell lines after treatment with the BCNU + Res combination. Interestingly, a much lower concentration of Res (8 μmol/L) was needed to cause the same comet length in 5-FU-R cells compared with 5-FU sensitive cells (Res 30 μmol/L) (Figure ​(Figure2B2B vs Figure ​Figure6B).6B). This observation suggests that Res was more effective in causing DNA damage in 5-FU-R cells than in 5-FU sensitive cells when associated with the same amount of BCNU. This data prompted us to check the level of DNA damage/repair related proteins after treatment with BCNU + Res in 5-FU-R cells. Interestingly, the major DNA repair proteins, such as FEN1, POLH, DDB2 and POL-β decreased in case of combination treatment while the level of APC increased in comparison to the individual drug as well as untreated cells (Figure ​(Figure6E6E).

Multiple pieces of evidence indicate that the repair of apurinic/apyrimidinic (AP)-sites in DNA occurs through two sub-pathways of BER, which differ on the basis of repair gap size and the enzymes involved in these repair pathways[⁵⁵]. These sub-pathways are designated as ‘‘single-nucleotide BER’’ or ‘’short patch (SP)-BER’’ and “multinucleotide BER’’ or ‘’long patch (LP)-BER’’. In both pathways, repair is started by removal of a damaged base by a DNA glycosylase leaving an abasic (AP-site) DNA. The resulting AP sites are subsequently acted upon by an APE to generate a 3’ hydroxyl group and a 5’-deoxyribosephosphate (dRP) terminus. In SP-BER, Pol-β extends the 3’ terminus by a single nucleotide and removes the dRP moiety with its dRP lyase activity. Finally, the nick is sealed by DNA ligases[⁵⁶]. However, the oxidized or reduced AP sites become resistant to β-elimination and cannot be excised by the dRP lyase activity of Pol-β. Then the modified AP-site is repaired via the LP-BER pathway, in which Pol-β, d or epsilon incorporates 2-15 nucleotides, displacing the strand containing the modified AP-site. Then, the DNA flap structure is cleaved by FEN1, and the nick is sealed by a DNA ligase[^57,58]. APC expression is induced in cancer cell lines upon exposure to DNA-damaging agents[^39,40,59,60], suggesting an interaction between APC and the DNA repair machinery. We have already shown that APC physically interacts with Pol-β, FEN1 and blocks BER by blocking strand-displacement synthesis and then DNA repair[^39-42]. Increased levels of APC and decreased levels of Pol-β and FEN1 after combined treatment with BCNU + Res revealed that this cocktail kills cancer cells by inhibiting the BER pathway. Thus, the above result indicates that BCNU + Res in combination caused cell death through reduction of BER repair pathway. The possible cause of this effect might be activation of APC by the combination but not the individual treatments.

A new and emerging concept is to sensitize cancer cells to DNA-damaging agents by inhibiting various proteins in DNA repair pathways. Molecular docking or NMR studies identified small molecular weight inhibitors (SMIs) that target the BER pathway by inhibiting APE1 and Pol-β activities[⁶¹]. Although a number of Pol-β inhibitors have been reported in recent years[^61,62], more potent and selective inhibitors are still needed. Since abasic DNA damage (which may also be caused by BCNU) can also be repaired by LP-BER, there is a need for agents that can block the LP-BER pathway as well, in which 5’-flap endonuclease 1 (FEN1) plays a major role[⁶³]. FEN1 recognizes and removes the 5’-flap structure generated by Pol-β during the strand-displacement synthesis. The removal of this flap is essential for the joining of the newly synthesized DNA strand with the parent strand by DNA ligase to complete the repair. Interestingly, the FEN1 level decreased after BCNU and Res combination in both cell lines, indicating that the BCNU + Res combination inhibited the removal of flap from the newly synthesized step in LP-BER. BCNU + Res might cause more DNA damage that could not be repaired by the cells because of a lack of sufficient FEN1. This would result in mutations accumulating within the cells, eventually leading to apoptosis instead of survival. However, more study will be needed to understand the molecular mechanism involving the BER pathway triggered by the BCNU + Res combination.

In conclusion, this study showed that a combination of BCNU and Res could be useful to overcome 5-FU resistance in colon cancer patients. BCNU and Res caused apoptosis in both the HCT-116 cells and 5-FU-R cells by inhibiting the base excision repair, especially via the FEN1 protein of the LP-BER pathway. These findings represent a novel concept for overcoming 5-FU resistance in colon cancer patients.

ОБСУЖДЕНИЕ

5-ФУ широко используется для лечения различных видов рака, включая колоректальный рак, рак груди и рак aerodigestive тракта. В частности, 5-ФУ регулярно занятых в управлении колоректального рака через один из двух одобрен FDA в первой строке комбинаторных химиотерапии, которые связаны внутривенного введения на фторированной основе аналоговых[10,11]. Одна из проблем, с 5-FU лечения заключается в том, что более 50% опухолей демонстрировать сопротивление 5-ФУ в клинических условиях. Таким образом, новые процедуры, необходимые для лечения этих резистентных опухолей. Новые биологические агенты, такие как моноклональные антитела Цетуксимаб (эпидермальный фактор роста ингибитора рецепторов) и Бевацизумаб (фактора роста сосудистого эндотелия, ингибитор), недавно было показано, чтобы обеспечить дополнительный положительный клинический эффект у больных с метастатическим колоректальным раком. Однако, эти агенты показали маргинальные результаты при лечении резистентных опухолей[51,52].

В течение последних нескольких десятилетий, исследователи попытались выяснить механизм, лежащий в основе 5-ФУ сопротивление[10-12]. Некоторые исследователи разработали 5-ФУ устойчивы клеточных линий, и изучал их чувствительность к нескольким химиотерапевтических агентов по активации и торможения несколько сигнальных путей[53,54]. К сожалению, ни один из этих агентов показали многообещающие результаты.

В настоящем докладе, мы разработали новую стратегию для преодоления 5-ФУ сопротивление, установив 5-ФУ-R изучение клеточных линий и их чувствительность к комбинированной терапии с BCNU и рез. BCNU и Res дисплей анти-раковые свойства, вызывая повреждение ДНК, арестовав ход цикла клетки, препятствуя антиапоптозных производители и аутофагии[13,28]. Недавно мы показали, что умеренно низкая концентрация 5-ФУ (0.5 мкмоль/Л) вырос химиопрофилактики потенциала ВИЭ в клетки рака кишечника[7]. Однако, в этом докладе мы не могли исключить вероятность 5-ФУ сопротивление из-за присутствия в 5-ФУ. Таким образом, что коктейль не подходят для лечения 5-ФУ сопротивление пациентов. В данном исследовании мы рассматривали клетки с BCNU и Res повышают чувствительность 5-ФУ устойчивы клеточных линий. Изначально, мы проверили ли BCNU и Res комбинации повышают чувствительность 5-ФУ чувствительных HCT-116 клеток. LC50 наблюдалось в 60 мкмоль/Л BCNU и 35 мкмоль/Л Res; однако же сумму гибели клеток наблюдалось, когда 18 мкмоль/Л Res сочеталось с 20 мкмоль/Л BCNU. Снижение как BCNU и Res концентрации на пятьдесят процентов гибели клеток показало, что BCNU и Res убил HCT-116 клеток рака толстой кишки синергетически (Рисунок (Figure1B).1B). В isobologram данных (Рисунок (Figure6F)6F), тоже поддерживают синергическое действие BCNU и Res убить клеток рака толстой кишки.

Гибель клеток, связанные с синергетический эффект лечения клеток с сочетанием BCNU и Res подтверждается еще несколько параметров, таких как DAPI ядерное окрашивание, комет, FACS анализа и измерения выражение структуры из нескольких повреждения ДНК/ремонт, клеточный цикл, регулирующих апоптоз, связанных с белковых биомаркеров. Увеличение количества апоптотических ядра, после DAPI пятно, средняя комет и комета длина, процент sub G1 населения наблюдались после комбинированного лечения (BCNU + ВИЭ) в HCT-116 клеток. Увеличенный коэффициент BAX/BCL-XL, сколотыми продукта PARP, - супрессор опухолевого роста, PTEN, клеточный цикл регуляторного белка p21, и КАСПАЗЫ-3 были также отмечены в BCNU и Res комбинации. Таким образом, приведенные данные свидетельствуют о том, что BCNU и Res комбинации представляют собой один из возможных вариантов лечения 5-ФУ устойчивы рака толстой кишки.

Мы разработали 5-ФУ резистентных клеток линии из 5-ФУ чувствительных HCT-116 клеток непрерывное лечение с 5-ФУ. Эти клетки были устойчивы к 5-ФУ, но это зависит от других химиотерапевтических агентов, таких, как исследование клеточной смерти последствия BCNU и Res сочетание в устойчивых клеточных линий были измерены. МТТ выживаемость клеток, DAPI ядерное окрашивание и комета анализы показали, что BCNU + Res комбинация была очень эффективной для повышения осведомленности 5-ФУ-R клеток в сравнении с индивидуальных соединений. Они вызвали гибель клеток синергично. В FACS анализ показал, что около 70% клеточной гибели при 20 мкмоль/Л BCNU в сочетании с 8 мкмоль/Л Res (Рисунок (Figure6C).6C). Напротив, около 60% гибель клеток наблюдалось при 20 мкмоль/Л BCNU в сочетании с 30 мкмоль/Л ВИЭ в HCT-116 чувствительных клеток. Увеличился процент (70% против 60%) апоптоза даже при более низкой концентрации Res (8 мкмоль/Л против 30 мкмоль/Л) указали, что Res была более эффективной, чтобы привлечь 5-ФУ-R, чем HCT-116 клеток в сочетании с BCNU. Выражение PARP расщепляется продукта и BAX/BCL-XL коэффициент вырос с комбинированное лечение (BCNU + ВИЭ) в 5-ФУ-R-клеток по сравнению с ВИЭ и BCNU в одиночку (Рисунок (Figure6D).6D). Isobologram анализа также показали, что BCNU и Res также убил 5-ФУ-R клеток синергично.

Исследование механизма действия BCNU и Res комбинации, мы в первую очередь анализируются ли повреждения ДНК/ремонт путь был вовлечен. Комета анализы показали, что в среднем комета длина и комет увеличилось в 5-ФУ чувствительные и резистентные клетки линии после лечения с BCNU + Res комбинации. Интересно, гораздо более низкой концентрации Res (8 мкмоль/Л) нужен был для того, чтобы вызвать те же кометы длиной в 5-ФУ-R-клеток по сравнению с 5-FU чувствительных клеток (Res 30 мкмоль/Л) (Рис. (Figure2B2B vs Рис. Figure6B).6B). Это наблюдение предполагает, что Res оказался более эффективным в нанесении повреждений ДНК в 5-ФУ-R клеток, чем в 5-ФУ чувствительных клеток, связанная с тем же количеством BCNU. Эти данные побудили нас проверьте уровень повреждений ДНК/ремонт родственных белков после лечения с BCNU + ВИЭ в 5-ФУ-R клеток. Интересно, что основные репарации ДНК, белков, таких как FEN1, POLH, DDB2 и POL-бета снизилась в случае комбинированной терапии, в то время как уровень APC увеличился по сравнению с отдельных лиц, а также необработанные клетки (Рис. (Figure6E6E).

Несколько улики указывают на то, что ремонт apurinic/apyrimidinic (AP)-сайты в ДНК происходит через два суб-пути BER, которые различаются между собой на основе ремонт размер зазора и ферментов, участвующих в ремонте этих путей[55]. Эти суб-пути обозначены как ‘однонуклеотидные БЕР’ или ‘короткий патч (SP)-БЕР’ и “multinucleotide БЕР’ или ‘long патч (LP)-БЕР’. В обоих путей, ремонт начался с удаления поврежденной базы ДНК glycosylase оставив abasic (AP-сайта) ДНК. В результате АП сайты впоследствии действовал в соответствии с обезьяной, чтобы генерировать 3’ гидроксильной группы и 5’-deoxyribosephosphate (dRP) terminus. В SP-БЕР, Pol-бета расширяет 3’ конечная остановка одного нуклеотида и удаляет dRP радикала с его dRP лиазы деятельности. Наконец, ник печатью ДНК-лигазы[56]. Однако, окисленные или снижение AP сайты становятся устойчивыми на бета-ликвидация и не могут быть вырезаны по dRP лиазы деятельности Pol-бета. Затем измененный AP-сайта ремонта через LP (BER пути, в которых Pol-бета -, d или Эпсилон включает 2-15 нуклеотидов, вытесняя strand, содержащего измененные AP-сайта. Затем, ДНК лоскут структура расщепляется, FEN1, и ник герметизирован ДНК-лигазу[57,58]. APC выражение, индуцированного в клеточных линий рака при воздействии на ДНК-повреждающих агентов[39,40,59,60], предлагая взаимодействие между БТР и ДНК ремонт спецтехники. Мы уже показали, что APC физически взаимодействует с Pol-бета, FEN1 и блоков BER блокируя strand-объемом синтез и затем репарации ДНК[39-42]. Повышение уровня APC и снижение уровня Pol-бета и FEN1 после комбинированного лечения с BCNU + Res выяснилось, что этот коктейль убивает раковые клетки за счет ингибирования BER пути. Таким образом, полученный результат указывает на то, что BCNU + ВИЭ в сочетании причиной гибели клеток за счет снижения BER ремонта пути. Возможной причиной этого эффекта может быть активации APC by комбинации, но не отдельных процедур.

Новые концепции является увеличение чувствительности раковых клеток к ДНК-повреждающих агентов путем ингибирования различных белков в пути репарации ДНК. Молекулярный докинг или ЯМР исследования определили небольшой молекулярный вес ингибиторы (SMIs), что целевой BER пути, подавляя APE1 и Pol-бета деятельности[61]. Хотя ряд Pol-бета ингибиторы были зарегистрированы в последние годы[61,62], более мощным и селективным ингибитором прежнему нужен. С abasic повреждения ДНК (которая также может быть вызвана BCNU) также может отремонтировать LP-БЕР, нужны агенты, которые могут блокировать LP-БЕР путь, в котором 5’-flap эндонуклеазы 1 (FEN1) играет важную роль[63]. FEN1 распознает и удаляет 5’-flap структура генерируемых компанией Pol-бета во время strand объемом синтеза. Удаление этот клапан необходим для присоединения вновь синтезированной ДНК с материнской strand ДНК-лигазу, чтобы завершить ремонт. Интересно, FEN1 уровень снизился после BCNU и Res сочетание в обеих клеточных линий, указывая, что BCNU + Res сочетание предотвратили вывоз лоскут от новообразованной шаг в LP (BER. BCNU + Res может нанести больше повреждений ДНК, которые не могут быть восстановлены с помощью клеток из-за отсутствия достаточного FEN1. Это приведет к тому, накопления мутаций в клетках, в конечном счете приводит к апоптозу вместо выживания. Однако дополнительные исследования будут необходимы, чтобы понять молекулярный механизм с участием BER пути вызваны BCNU + Res комбинации.

В заключение этого исследования показали, что сочетание BCNU и Res могли бы быть полезными для преодоления 5-ФУ сопротивление больных раком толстой кишки. BCNU и Res вызывали апоптоз в HCT-116 клеток и 5-ФУ-R клеток, подавляя эксцизионной репарации, особенно через FEN1 белок LP-БЕР пути. Эти результаты представляют собой новое понятие для преодоления 5-ФУ сопротивление больных раком толстой кишки.

Exp Neurol. 2014 Jan;251:91-100. doi: 10.1016/j.expneurol.2013.11.013. Epub 213 Nov 16.

жүктеу/скачать 2.08 Mb.

Достарыңызбен бөлісу: