С. А. Корниенко А. В. Кривопалов
жүктеу/скачать 7.14 Mb. Pdf көрінісі
|
| Материалы и методы
Использовали планарий лабораторной расы Girardia tigrina и Schmidtea mediterranea (тип Platyhelminthes, класс Turbellaria). Животных содержали в затем- ненных аквариумах с водопроводной и дистиллированной водой (2:1) при темпера- туре 20 ± 1 °С и кормили мотылем два раза в неделю. Перед опытом планарий дер- жали голодными в течение недели. В опыт отбирали особей длиной 8-9 мм (G. tigrina) и 4–5 мм (S. mediterranea). Для идентификации стволовых клеток применяли две разных методики. I. В первой серии опытов подопытных планарий G. tigrina инкубировали c 0,05 % раствором колхицина (Sigma) в течение (1–48 ч), который добавляли в среду содержания, контрольная группа животных находилась в обычной воде. Подсчиты- вали число митозов в суспензии клеток, приготовленных из тканей, взятых от деся- ти особей G. tigrina, учитывали фазы митотического цикла (профазы, метафазы, анафазы и телофазы). Для приготовления суспензии клеток острым глазным скаль- пелем отсекали фрагменты ткани размером около 1,5 мм длиной в предглоточной, окологлоточной и хвостовой областях тела планарий. Образцы ткани помещали в пробирку (Ependorff, 1,5 мл) и диссоциировали на клетки в 120–150 мкл смеси со- держащей метанол, уксусную кислоту, глицерин и фосфатный буфер в соотноше- нии (2 : 1 : 1 : 12) в течение 30 минут при комнатной температуре. В конце процеду- ры клетки окрашивали флуоресцентным красителем, специфически связывающим- ся с ДНК (Hoechst-33342, Sigma), добавляя 10–12 мкл красителя (0,1 мкМ раствора в ДМСО) в пробирку с суспензией клеток и фиксировали 4 % формалином. Каплю клеточной суспензии помещали на предметное стекло, накрывали покровным стек- лом, добавляли 10 % раствор глицерина на фосфатном буфере (PBS, pH 7,3). Препа- раты исследовали под флуоресцентным микроскопом Leica DM6000B, оснащенным цифровой фотокамерой DC 300F (Leica, Германия). Из одной пробы готовили 3– 4 препарата. На каждом стекле подсчитывали число митозов на 1000 клеток, про- сматривали не менее 3000–4000 клеток на одну временную точку. Митотический индекс (МИ) определяли как процент митозов на 100 клеток суспензии. Кроме того, учитывали число клеток, находящихся в разных стадиях митоза и определяли их процент от числа митозов. Для статистической обработки результатов применяли T- критерий Стьюдента, вычисляли среднее значение показателя и стандартную ошибку. Материалы VI межрегиональной научной конференции, 4–6 сентября 2019 67 II. Во второй серии экспериментов исследовали влияние серотонина на проли- феративную активность стволовых клеток у планарий S. mediterranea. В опыте, про- должительностью 4 суток, планарий S. mediterranea содержали в условиях постоян- ного затемнения. Животных подопытной группы содержали в 1µМ растворе серо- тонина. После периода адаптации (3 сут) в каждой группе животных с периодично- стью в два часа на протяжении суток фиксировали (4 % параформальдегидом) по 12 особей. Для выявления митотических клеток применяли иммуногистохимичес- кую окраску тотальных препаратов планарий первичными антителами к фосфори- лированным гистонам (Santa Cruz, USA) в разведении 1:1000 и вторичными флуо- ресцентно меченными иммуноглобулинами с зондом CF488A (Biotium, USA) в раз- ведении 1:1000. Окрашенные препараты исследовали с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа Leica TCS SP5 (Leica, Германия). Определяли число митотических клеток на единицу площади тела планарии. Находили среднее значение числа митозов. В течение суток анализировали пролиферативную актив- ность у животных подопытной и контрольной групп. Использовали по 144 особей в каждой группе. Опыт повторяли два раза. жүктеу/скачать 7.14 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|