С. А. Корниенко А. В. Кривопалов
жүктеу/скачать 7.14 Mb. Pdf көрінісі
|
| in vivo.
Для исследования in vitro мариты или эксцистированные метацеркарии O. felineus культивировали в течение суток с различными концентрациями исследу- емого препарата в RPMI 1640 c L-глутамином с добавлением антибиотиков (100 мкг/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина), антимикотика (25 мкг/мл амфо- терицина В) и 1 % глюкозы в инкубаторе (37 °С, 5 % СО 2 ). После этого оценивали подвижность паразитов по 4-балльной шкале и рассчитывали показатель IC 50 иссле- дуемого вещества. Установлено, что при воздействии ПЗК: Na 2 ГК на взрослых ма- рит IC 50 = 0,76 мкг/мл, тогда как у ПЗК IC 50 = 0,16 мкг/мл. При воздействии на мета- церкарии эти значения составляют 1,48 мкг/мл и 0,22 мкг/мл, соответственно. При воздействии К:Na 2 ГК на взрослых марит IC 50 = 2,49 мкг/мл и на метацеркарии — 6,86 мкг/мл. Поскольку в ПЗК:Na 2 ГК содержание действующего вещества в 11 раз снижено, но IC 50 уменьшился всего в 5-6 раз, то комплекс ПЗК:Na 2 ГК (1:10) показы- вает высокую антигельминтную активность в отношении взрослых и ювенильных гельминтов O. felineus в условиях in vitro. Действие комплекса К:Na 2 ГК было на порядок менее эффективным. Исследования in vivo проводили трижды на модели O. felineus-индуцирован- ного описторхоза на золотистых хомячках (Mesocricetus auratus). Животных инфици- ровали 100 метацеркариями O. felineus и через 3 мес. вводили внутрижелудочно пре- параты: 400 мг/кг ПЗК или ПЗК:Na 2 ГК однократно, 50 мг/кг куркумин (К), 50 мг/кг К:Na 2 ГК и 50 мг/кг Na 2 ГК (ГК) ежедневно в течение 30 дней. Контрольным инфи- цированным животным (группа OF) ежедневно вводили воду. Еще одной контрольной группой были интактные неинфицированные хомячки (Кон). По истечении срока животных умерщвляли, производили забор биоматериала для подсчета паразитар- ной нагрузки, определения экспрессии генов в ткани печени методом ПЦР в реаль- ном времени и для гистологических исследований. Антигельминтный эффект ПЗК:Na 2 ГК был сопоставим с таковым у ПЗК (сни- жение количества паразитов на 67 и 70 % соответственно), не смотря на сниженную в 11 раз долю действующего вещества (рис. 1). Куркумин (К) вызывал снижение количества паразитов на 32 %, однако комплекс К:Na 2 ГК не имел статистически значимого влияния на этот показатель. На гистологических препаратах печени O. felineus-инфицированных хомячков (группа OF) наблюдали выраженную пролиферацию желчных протоков, холангио- фиброз, перидуктальный фиброз и изменения структуры эпителия желчных прото- ков, а также очаги воспалительной инфильтрации и дистрофии гепатоцитов. У хо- мячков из группы ПЗК обнаружено снижение степени выраженности фиброза и Материалы VI межрегиональной научной конференции, 4–6 сентября 2019 151 пролиферации протоков, но сохранялась воспалительная инфильтрация и патологи- ческие изменения эпителия. В группе животных, получавших комплекс ПЗК:Na 2 ГК, положительные эффекты были ещё более выраженными, по сравнению с ПЗК, и проявлялись в виде снижения как выраженности фиброза, так и воспалительных инфильтраций. Хроническое введение куркумина способствовало снижению степе- ни выраженности перидуктального фиброза и изменений эпителия, а также воспа- лительной инфильтрации, при этом пролиферация желчных протоков была мини- мальной, но сохранялась высокая степень выраженности перидуктального фибро- за. Комплекс К:Na 2 ГК вызывал аналогичные эффекты, но снижение фибротических изменений по сравнению с чистым куркумином было менее выраженным. Для молекулярно-генетического исследования были выбраны гены белков хо- зяина паразита, связанные с синтезом или транспортом желчных кислот, а также с уровнем воспалительных реакций. В частности, мы исследовали экспрессию гена ключевого белка синтеза желчных кислот CYP7A1 (Cyp7a1), гена кофактора ядер- ных факторов транскрипции RXRα (Rxra) и гена провоспалительного белка TNFα (Tnfa), играющего важную роль в системных воспалениях. Методом ПЦР в реаль- ном времени установлено, что у хомячков из группы OF было снижение экспрессии Cyp7a1 и повышение Tnfa, экспрессия Rxra не менялась. Под действием ПЗК эксп- рессия гена белка CYP7A1 восстанавливалась до контрольных значений, а RXRα - значимо снижалась, что соответствует литературным данным о том, что RXR в ком- плексе с другим кофактором FXR ингибирует экспрессию Cyp7a1 (Charoensuk et al., 2014). Поэтому нормализация экспрессии этого белка может быть вызвана влияни- ем ПЗК на ядерные факторы транскрипции. Куркумин не оказывал влияния на экс- прессию исследуемых генов при описторхозе, но комплекс К:Na 2 ГК несколько нор- мализовал экспрессию Cyp7a1 и повышал экспрессию Rxra. Эти результаты позво- ляют предположить, что под действием К:Na 2 ГК происходит димеризация RXRα с отличными от FXR ядерными факторами. Уровень экспрессии гена Tnfa сохранялся повышенным у хомячков всех экспериментальных групп, но на фоне введения ком- плекса К:Na 2 ГК повышение было менее выраженным, что может объясняется соче- танием противовоспалительного эффекта глицирризината натрия и пролонгирован- ного действием куркумина в составе мицеллярного комплекса (рис. 2). Ðèñ. 1. Àíòèãåëüìèíòíûé ýôôåêò èññëåäóåìûõ âåùåñòâ. # — p < 0,05; ### — p < 0,001 — ïî ñðàâíåíèþ ñ OF (èíôèöèðîâàííûé êîíòðîëü). Паразитологические исследования в Сибири и на Дальнем Востоке 152 Ðèñ. 2. Îòíîñèòåëüíûé óðîâåíü ýêñïðåññèè òð¸õ èññëåäóåìûõ ãåíîâ â ïå÷åíè õîìÿ÷êîâ. * — p < 0,05, ** — p < 0,01, *** — p < 0,001 — ïî ñðàâíåíèþ ñ Êîí; # — p < 0,05; (#) — p < 0,1 — ïî ñðàâíåíèþ ñ OF; + — p < 0,05; +++ — p < 0,001 — ïî ñðàâíåíèþ ñ ÏÇÊ. Суммируя полученные данные, можно заключить, что супрамолекулярный ком- плекс ПЗК:Na 2 ГК со сниженной в 11 раз долей действующего вещества оказывает сопоставимый с действием чистого ПЗК антигельминтный эффект, и при этом обла- дает некоторыми гепатопротекторными свойствами. Супрамолекулярный комплекс К:Na 2 ГК (1:1) действует на гельминтов O. felineus слабее, особенно в условиях in vivo, но оказывает больший, по сравнению с остальными веществами, нормализующий эффект на экспрессию генов, задействованных в синтезе/транспорте желчи и в реак- циях воспаления. Полагаем, что оба комплекса могут быть использованы как потен- циальные антигельминтные препараты, в большей степени ПЗК:Na 2 ГК, однако они нуждается в дополнительных доклинических исследованиях. Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (грант № 17-43-540175) и бюджетного проекта ФИЦ ИЦиГ СО РАН (№ 0324-2019-0041). жүктеу/скачать 7.14 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|