Сабақтың тақырыбы: Биотехнологиядағы ақпараттық әдістер

1. Флуоресцентті белгіленген ПЦР-праймерлерді қолдану арқылы генотипирлеу ПЦР/ЛОЗ әдісі

2.Бір геннің әр түрлі сайттарындағы мутациялар

ПТР әдісі (полимеразалық тізбекті реакция) қазіргі заманғы ДНК диагностикасы, молекулалық биологияның өте сезімтал әдісі «алтын стандарт» болып табылады. ПТР әдісі медицина, генетика, криминология және басқа салаларда қолданылады. Көптеген жұқпалы ауруларды диагностикалауда жиі және табысты қолданылады.

ПТР арқылы жұқпалы аурулардың диагностикасы

ПТР тесті патогеннің өзі ғана емес, сонымен бірге зерттелетін материалдардағы шетелдік ДНҚ-ның бір фрагментін анықтауға мүмкіндік береді. Зерттелетін (биологиялық) материал: веноздық қан, эпителий жасушалар және жыныс жолдарының, сперматозоидтар, сілекей, қышқыл және басқа да биологиялық экскреталардың құпиялары. Қажетті биологиялық материал болжамды аурумен анықталады.

Мақалада молекулярлық биологияның қазіргі заманғы әдістерінің бірі - ПТР балау әдісі сипатталған (полимеразды тізбекті реакция). ПТР диагностика көптеген ауруларды анықтау үшін қазіргі заманға сай жылдам және нақты әдіс болып табылады. ПТР диагностика жұқпалы аурулар қоздырғышын басқа әдістермен (иммунологиялық, бактериологиялық, микроскопиялық) анықтау мүмкін болмаған жағдайда қолданылады. ПТР диагностика 3 негізгі процедурадан тұрады: зерттелетін материалды дайындау, бұл кезде қоздырғыш ДНК-н немесе РНК-н бөліп алу процесі жүреді, полимеразды тізбектік реакцияның өзінен және ПТР өнімін бөліп алу (детекция). Бұл кезде қоздырғыштың генетикалық материалы ДНК-полимераза ферментінің әсерінен бірнеше рет көбейіп, ДНК фрагменттерінің көшірмелері тіркеледі. Бұл ПТР диагностика кезінде тіпті бактерия немесе вирустардың бірен-саран жасушаларын немесе кейбір қиын жағдайларда, мысалы, антигендік өзгергіштігі өте жоғары немесе жасуша ішінде тіршілік ететін қоздырғыштар да анықталады. Зерттеу ұзақ уақытты қажет етпейді. Қазіргі жаңа технологияның дамыған кезеңінде қоздырғышты бөліп алу және өсіру, одан нуклеин қышқылын бөліп алу үрдістері толығымен стандартталған және автоматтандырылған. Әдістің автоматизациялығы қолмен жүргізілетін зерттеу кезінде кездесетін мүмкін қателіктерді азайтады. Нәтиже бірнеше сағаттың ішінде алынуы мүмкін. Зертханалық балау заманауи медицинаның ажырамас бөлігі болып табылады, онсыз толыққанды кез келген ауруды балауды жүргізу мүмкін емес. Қазіргі уақытта «ескі» диагностикалық әдістерді үнемі жетілдіріп отырады, жаңа, барынша тиімді және сенімді әдістер жасап шығарылуда. Сібір жарасын зертханалық балау әдістері бүгінгі күні өте жетілген және балау әдістерініңсаны көбейюде.балау әдістерінің жетілуінің және көбеюінің басты өзектілігі - нақты диагноз қою және аурудың аурудың алдын алуда маңызды болып табылады. Дәстүрлі морфологиялық, иммунологиялық және биохимиялық әдістермен қатар, зертханалық қызмет мамандары дәлірек нәтижелерге қол жеткізу үшін сібір жарасын балауда жаңа технологияларды қолданады. Молекулярлық биологияның ең заманауи әдістерінің бірі - ПТР балау әдісі болып табылады (қате ықтималы 5% артық емес). ПТР тесті әдеттегі әдістермен салыстырғанда бірқатар артықшылықтарға ие, өйткені бұл әдіс сынау үлгісінде патогенді аурудың ДНҚ бөлігін жүздеген есе үлкейтіп көруге мүмкіндік береді. Әдістің сезімталдығы иммунохохимиялық және микробиологиялық әдістерге қарағанда әлдеқайда жоғары, ал әдіс принципі маңызды антигендік өзгермелілігі бар инфекциялардың болуын диагностикалауға мүмкіндік береді.

Біздің заманымыздағы ПТР әдісі, әрине, қуатты диагностикалық құралы болып табылады. Зерттеудің бірден-бір кемшілігі оның жоғары бағасы болып табылады.

ПТР әдісімен анықталуы мүмкін аурулардың тізімінде:

• 
  вирустық және бактериялық пневмония;
  
• 
  туберкулез;
  
• 
  қызылша, қызамық, паротит;
  
• 
  барлық нысандардағы жұқпалы гепатит;
  
• 
  сальмонеллез, дифтерия;
  
• 
  Helicobacteriosis және ішек инфекцияларынан туындаған аурулар;
  
• 
  ЖЖБИ (жыныстық жолмен берілетін аурулар): гонорея, хламидиоз, уреаплазмоз, сифилис, СПИД, жыныстық гепард, гарднереллез және басқалар.
  

Дәстүрлі талдаулардан айырмашылығы, ПТР әдісі жыныстық жолмен берілетін инфекцияларды (ЖЖБЖ) анықтауға мүмкіндік береді, тіпті олардың белгілері толық болмаған жағдайда да. Биологиялық материалдарды жинау үшін әйелдердің мойны арнасының эпителиалдық жасушалары скребирленеді, ерлер - уретрді қырқу. Қажет болса, ПТР әдісі веноздық қанды зерттеуді жүргізеді.

Осылайша, ПТР әдісімен STI сынағы анықтайды:

• 
  адамның иммун тапшылығы вирусы (ВИЧ);
  
• 
  бозғылт тронино (мерездің қоздырғышы);
  
• 
  Herpes simplex вирусы және цитомегаловирус;
  
• 
  адам папилломавирусы (HPV);
  
• 
  хламидиоз, токсоплазмалар, микоплазмалар, уреаплазмалар және басқа жыныстық инфекциялар.
  

Иммуноферменттік талдау (ELISA) және полимеразды тізбекті реакция (ПТР) әдісі: артықшылықтар мен кемшіліктер

Қандай диагностикалық әдіс жақсы: PCR немесе ELISA? Бұл сұраққа дұрыс жауап жоқ, өйткені осы екі зерттеудің көмегімен диагноз әртүрлі мақсаттарға ие. Көп жағдайларда IFA және PTSR әдістері кешенде қолданылады.

ПТР сынағы аурудың симптоматикалық көрінісі болмағанына қарамастан инфекцияның белгілі бір қоздырғышын анықтау үшін қажет. Бұл әдіс жасырын және созылмалы бактериалды және вирустық инфекцияларды анықтауға арналған.   Оның көмегімен бірнеше патогенді бір мезгілде анықталуы мүмкін және терапия кезінде ПТР әдісі шетелдік ДНҚ көшірмелерінің санын анықтау арқылы оның сапасын бағалауға мүмкіндік береді.

ПТР әдісінен айырмашылығы, ELISA әдісі инфекцияның қоздырғышын емес, ағзаның иммундық реакциясын анықтауға арналған, яғни белгілі бір патогенге антиденелердің болуы мен мөлшерін анықтауға арналған. Анықталған (IgM, IgA, IgG) антиденелердің түріне қарай инфекциялық процестің даму сатысын анықтауға болады.

Екі әдіс пен ПТР және ELISA жоғары сенімділікке ие (тиісінше 100 және 90%). Бірақ кейбір жағдайларда ЭЛИСА-ның талдауы жалған (егер бұрын адамның белгілі бір ауруы бар болса) немесе жалған-теріс (инфекция салыстырмалы түрде жақында өткен жағдайда) нәтижесін береді.

Полимераза 3'- праймер шетінен екінші тізбек синтезін бастайды, ол матрицамен байланысып, матрицаны бойлай қозғалады. Элонгация температурасы полимеразаға байланысты болады. Жиі қолданылатын полимеразалар Taq және Pfu 72 °C кезінде өте белсенді.. Бұл стадия 7-10 мин. созылады. ПТР әдетте, 0,1 °C кем емес нақтылығымен түтікшелерді мерзімді салқындату және қыздыруды қамтамасыз ететін аспабы - амплификатордаөткізеді.Қазіргі заман амплификаторлары күрделі бағдарлама жасау, сонымен қатар «қызу старт», Touchdown ПЦР және 4 °C кезінде амплифицирленген молекулаларды кейінгі сақтау мүмкіндігін береді. Дәстүрлі микробиологиялық әдістерімен салыстырғанда ПЦР қолдану артықшылығы:

1. Жылдамдығы және жоғары өнімділігі (яғни көптеген үлгілерді параллельді талдау мүмкіндігі). Клиникалық материалдан және кейінгі ПЦР- амплификациядан микробты ДНК бөлу процедурасы өз аяқталуы үшін бірнеше сағатты талап етеді. Осылайша, ПЦР-талдаудың барлық үдерісі – зертханаға үлгінің келіп түсуінен бастап соңғы нәтижені алғанға дейін – әдетте, бір жұмыс күнінен артық болмайды. Культуральдік әдістермен салыстырғанда жылдамдықта ПЦР артықшылығы баяу өсетін микро ағзазарды зерттеу кезінде ерекше көзге түседі.

2. Жоғары спецификалығы – әр микро ағзалар түрінің генетикалық материал бірегейлігімен анықталады. Сондықтан праймерді, ДНК комплементарлық белгілі «спецификалық түр» реттілігін қолдану және реакцияның ұтымды температуралық режимін сақтау кезінде тек ізденіс түріндегі ДНК басқа «балласты» ДНК көптеген мөлшері болғанда бірнеше рет көшірме жасалады, мысалы, адам ДНК немесе басқа микро ағзалар түрі. Басқа жақтан алып қарасақ, бастапқы жинақтау ортасына себу кезінде әр түрлі микро ағзалар түрінің өсуін анықтауға мүмкіндік беретін культуральдік әдістерге қарағанда, ПЦР «шектеулі бағыты» туралы есте сақтау қажет.

3. ПЦР аса жоғары сезімталдығымен ерекшеленеді. Реакцияны теориялық тұрғыдан жүзеге асыру үшін тізденіс ДНК (РНК) тек бір көшірмесі - зерттелетін материал реттілігі жеткілікті.

Сынама үшін микро ағзасының 0,5-1 тәртібінің сезімталдығы ПЦР үшін әбден ақиқатқа сай, бұл серологиялық және бактериологиялық зерттеулер оң нәтиже бермеген жағдайда да қолдануға мүмкіндік береді, салдары өте төмен микробты титрлер (мысалы, донор қаны мен органдардың инфекциялық қауіпсіздігі, созылмалы және латентті инфекция диагностикасын бақылау кезінде). Сол уақытта ПЦРэкстремалдық сезімталдығы зертханада алынатын нәтижелерді клиникалық түсіндірудің жаңа тәсілдін талап етеді. Жеке алғанда, клиникалық үлгілерде сапрофитті және шартты-патогенді микро ағзасын анықтау патологиялық үдеріс болуын білдірмейді, сондықтан диагноз ретінде, әсіресе пациенттің қолайлы клиникалық картинасы фонында автоматты түсіндірілмейді. Осы себеп бойынша тән полимикробты бірлестігімен үлгілерді талдау үшін ПЦР аса сақтықпен қолдану қажет (жоғары тыныс жолдары және гениталийден алынған нәжіс және материал). ДНК ферментативті амплификациясы реакциясының экстремальдік сезімталдығы бір уақытта ПЦР технологиясының ахиллесов осал жері болып табылады. Бұл парадокс ДНК бөтен молекуласымен ластануға (контаминирование) ПЦР сезімталдық проблемасы ретінде белгілі, ол қолданатын праймер жинағы үшін нысана қызметін атқарады. Тіпті ластанатын ДНК жеке молекулалары мақсатты ДНК өнімін жасауға әкелетін ПЦР үдерісінде бірнеше рет көшірмесін жасайды, демек, жалған оң нәтижеге әкеледі. ПЦР әр түрлі көздері бар - ластану. Өте жиі өткен реакцияның ДНК өнімдерімен реакциялық қоспасын ластау болып табылады. Нәтижесінде ПЦР әр реакциялық түтікшеде ДНК шығыс реттілігімен миллиардтан астам көшірмесін жасайды, олардың әрқайсысы өз кезегінде кейінгі амплификация үшін ықтимал нысана болып табылады. Талдау үдерісінде ДНК синтезделген фрагменттері ПЦР қолданылатын реактивтер мен материалдарды ластай отырып және іздейін қоздырушының ДНК болмаған үлгілерді талдау кезінде жалған оң нәтижесіне әкеліп, зерттеушілер қолы және зертханалық құрал-саймандар арқылы аэрозоль түрінде (реакциялық түтікшені ашу кезінде) зертханаға оңай тарайды.

ПЦР зерттелетін клиникалық материалында микробты ДНК жоғары концентрациясы жағдайында – бір үлгіден екінші үлгіге ДНК шағын мөлшерін тасымалдау кезінде ластанады, мысалы, үлгісі бар түтікшелерді ашу кезінде қолғаптың үстіңгі беті немесе тканьдердің механикалық гомогенизациясы үшін қолданылатын құрылғылары арқылы ластанады. Әмбебап праймермен (жоғары қараңыз) ПЦР қолдану ластайтын ДНК көзі ДНК-полимеразаның коммерциялық препараттары және ПЦР қолданылатын басқа реактивтер болады.

Диагностикалық мақсатта ПЦР үнемі қолданатын зертханада жалған нәтижені алу қаупімен байланысты қатаң талаптарды сақтау және ПЦР – ластану қаупін төмендетуге бағытталған арнайы тәсілдер қажет.

1. Диагностикалық ПЦР – зертханаға қойылатын маңызды талаптардың бірі зертхананы бөлу «алдында – ПЦР - бөлме», үлгілерді өңдеу және реакциялық қоспаны дайындау және «кейін - ПЦР – бөлме», реакция өнімдерін талдау қажеттілігі болып табылады. Сонымен қатар ПЦР әр түрлі кезеңдерінде реактивтер мен материалдарды бөлек сақтау, амплификацияның алғышарты болып табылатын бір рет пайдаланатын пластик материалдарын барынша қолдану және ДНК ластайтын реттілігін зақымдайтын ультра күлгін (УФ) сәулелерімен бөлмелерді үнемі өңдеу міндетті болып табылады. Ластанудан ПЦР қорғанысын қамтамасыз ететін, қосымша шаралар үлгілермен жұмыс үшін ламинарлық боксты қолдану және ПЦР қоспаны дайындау, арнайы биохимиялық (урацилгликозилаза) және ПЦР өнімдері инактивациясының физикалық-химиялық (УФ сәулелендіру + изопсорален) әдістерін қолдануды қосады. Әсіресе ПЦР-талдау мәліметтерінің дұрыстығын бағалау және жалған оң нәтиже болмауы, клиникалық үлгілермен паралельді теріс бақылауды (ДНК-нысанадан тұрмайды) үнемі зерттеу үшін маңызды.

2. Теріс нәтиже алу қаупінен басқа ПЦР сезімталдығы төмендеуімен байланысты кері проблема да бар, оның салдары жалған теріс нәтижелер.

Практикада ПЦР теориялық (яғни барынша мүмкін) және нақты сезімталдық арақатынасы туралы үнемі бір мағыналы шешілмейді. ПЦР сезімталдығы көптеген себептер салдарынан төмендетіледі, оның ең маңыздысы биологиялық үлгілер компоненттері реакциясының төмендеуі болып табылады. ПЦР ингибиторлары қан үлгісі (гемоглобин), қақырық, несеп, биопсиялық материалда болады. Әр түрлі заттар, мысалы, жиі қолданылатын антикоагулянттар (әсіресе гепарин) немесе құнарлы ортаның қанды компоненттері ДНК амплификациясы реакциясын басады. ПЦР төмендетуді әдетте, зерттелетін үлгі және оның кейінгі амплификациясына ДНК-нысананы жасанды қосу арқылы анықтауға болады Әдейі оң бақылаумен алынған теріс нәтиже ингибиторлар болуы туралы айтады, оларды жою үшін үлгілерді араластыру немесе сынаманы дайындаудың арнайы әдістерін қолдану қажет. Сонымен қатар ПЦР көмегімен зерттеуге клиникалық үлгілерді дайындаудың нақты әдістерін таңдау маңызды проблема болып табылады. Қазіргі уақытта әр түрлі көздерден әр түрлі микро ағзалар түрінің ДНК бөлуге әмбебап тәсілдері жоқ. Автоматизация мүмкіндігін қарастыратын сынаманы дайындаудың тез әдістері кейде талап етілетін сезімталдық деңгейіне жетуге мүмкіндік бермейді. Басқа жағынан ПЦР-талдау үшін микробты ДНК тазалау және шоғырландыруға мүмкіндік беретін көп кезеңді әдістемелер көп еңбек сіңіруді талап етеді және үлгілер ластану қаупі артуына әкеледі. Соңында, ПЦР қымбат тұрады. Жүзеге асыру үшін термоциклер және ДНК-электрофорезі үшін құрылғы, сонымен бірге жеке центрифуга, мұздатқыш, дозаторлар және басқа жабдықты қоса отырып, зертхананы кешенді жарықтандыру қажет. ПЦР шығындары реактивтер мен шығындалатын материалдардың жоғары құнын қосады. Сондықтан ПЦР қиын культивирленген қоздырушыларын анықтаған және зерттеген жағдайда ғана дәстүрлі микробиологиялық әдістер құнымен салыстыруға болады.

Дәріс № 13