Современные биотехнологические процессы и иммунологические методы при промышленном производстве ветеринарных препаратов 03. 00. 23 биотехнология

Таблица 1

процессов культивирования клеток животных в биореакторах

При крупномасштабном выращивании культур клеток и вирусов основным критерием продуктивности процесса является обеспечение физиологических потребностей культур клеток, которые зависят от применяемого способа культивирования. Во ВНИТИБП разработаны процессы крупномасштабного культивирования клеток в биореакторах различных конструкций с модулем технологической обвязки и блоком автоматического управления основными параметрами (t_к, t_ст, рН, еН, рО₂, рСО₂, давление, расход воздуха на аэрации и др.). На автоматизированных блочно-модульных установках отработаны оптимизированные режимы выращивания клеток линии ПТ-80 на микроносителе «Cytodex» (табл. 2).

Таблица 2

Средняя продуктивность различных систем

Для практической реализации процесса культивирования клеток животных и вирусов выбран метод культивирования на микрокапсулах и микроносителях.

В результате 5-ти культивирований перевиваемых клеток ПТ-80 на микроносителе «Cytodex-3» при среднем времени культивирования 72 ч средний индекс пролиферации был равен 2.

В целях масштабирования процессов культивирования стадию адсорбции клеток на микроносителе осуществляли непосред­ственно в биореакторах. При отработке промышленной технологической схемы адсорбции клеток на микроносителе в 25 л биореакторе установлено, что опти­мальной посевной концентрацией клеток ПТ-80 является 8-12 кл на микроносителе. Рас­пределение клеток на поверхности микроносителя в конце стадии адсорбции через 2,5-3 часа после добавления в биореактор клеточной суспензии оказалось более равномерным при посевной концентрации 10-12 кл на микроносителе. При этом количест­во прикрепившихся к микроносителю клеток составляло около 95%. Теоретически рас­считанный при такой посевной концентрации индекс пролиферации клеток ПТ-80 может достигать 6-8, максимальный, полученный в наших опытах, со­ставлял 4,2.

Особое внимание при выборе конструкции биореактора для куль­тивирования клеток животных и вирусов уделяли харак­теристикам их конструктивных соотношений, материалам узлов биореактора и гидродинамическим условиям культивирования при гарантированном соблюдении асептических условий при дли­тельном культивировании путем сравнения существующих систем культивирования.

2.2.2. Изучение основных факторов, влияющих на гибель клеток при глубинном культивировании в биореакторах

Гибель клеток является основной проблемой при глубинном суспен­зионном культивировании в биореакторах. Гибель клеток в биореакторе, при прочих равных условиях, может быть вызвана гидродинамическими силами, которые могут быть объяснены влиянием аэрации с использованием барботажных устройств. Процесс аэрации является необходимым для снабжения клеток достаточных количест­вом кислорода и углекислого газа. Влияние аэрации можно разделить на влияние са­мих перемешиваемых потоков среды и поверхности раздела фаз газ-жидкость. Основ­ные потоки перемешивания создаются за счет поднятия газовых пузырьков. Кроме влияния потоков при перемешивании, образовании поверхности контакта газ-жидкость и ее разрушение происходит в процессе образования пузырьков при диспер­гировании газа и, соответственно, при переходе пузырька в поток жидкости. Также, разрушение пузырька происходит и при образовании пены.

Если пузырьки образуются в месте барботирования, первоначально они не покрыты защитной пленкой (поверхностно-активных веществ-ПАВ). В период образова­ния и подъема пузырьков, ПАВ адсорбируется на поверхность пузырька.

До достижения критического положения взаимодействие клеток-пузырьков приводит к немедленной гибели клеток. Чем больше молекул ПАВ адсор­бируется пузырьком, тем насыщенней он становится и клетки могут далее быть адсор­бируемыми пузырьком не будут поврежденными. Адсорбированные клетки могут передвигаться по поверхности пузырька. Если пузырек полностью насыщен, то новые клетки больше не смогут примкнуть к нему, а уже адсорбированные пузырьком поднимаются вместе с пузырьком на поверхность, где они могут затем погиб­нуть, если пузырек лопнет.

Скорость гибели клеток является простой линейной функцией от интенсивности аэрации F/V(F – скорость потока газа, V – рабочий объем биореактора), для пузырьков диаметром от 4 до 5,5 мм. Эксперименты по барботированию, при которых варьировалось время пребывания пузырьков в куль­туральной жидкости, четко показали, что гибель клеток в биореакторе не всегда вызывается всплыванием пузырьков. Влияние размера пузырьков и их слияния на скорость гибели клеток требует дальнейшего изучения. Хорошее защитное действие ПАВ от гидроди­намических напряжений сдвига при барботировании так же эффективно, как и при пе­ремешивании, предлагается в качестве основного метода и при масштабировании про­цесса выращивания клеточных культур в биореакторах.

2.2.3. Культивирование клеток сперматогоний

Предложена и испытана четырехпериодная система суспензионного культивирования сперматогоний свиньи.

В первом периоде культивирование осуществлялось в спиннере емкостью 100 мл, при коэффициенте заполнения 0,5. Посевная доза клеток составляла 5-10⁶ кл/мл.

Культивирование во втором периоде суспензионного культивирования осуществлялось в спиннере емкостью 200 мл, при коэффициенте заполнения 0,5. Посевная доза клеток составляла 10⁹ кл/мл.

В третьем периоде культивирование осуществлялось в спиннере емкостью 500 мл при коэффициенте заполнения 0,5. Посевная доза жизнеспособных клеток составила 10⁷ кл/мл.

■

Прежде, чем приступить к четвертому периоду суспензионного культивирования сперматидов, было проведено концентрирование их заданной дозы на установке BDF-1 с использованием биофильтра Sulzer с 10¹⁰ кл/мл до концентрации 5х10¹⁵ кл/мл, что соответствует приведенной технологической схеме процесса сперматогенеза клеток семенника поросенка. После концентрирования суспензионное культивирование осуществлялось на спиннере емкостью 1000 мл, коэффициент заполнения 0,5. Концентрация сперматидов составила 5x10¹⁵ кл/мл.

Наиболее сложным и определяющим является четвертый период сперматогенеза в культуральной системе.

С целью создания трансгенных свиней оптимизированные параметры культивирования позволяли получать 5-10% живых клеток, включая сперматогонии, несущие дополнительную информацию.

Таким образом, показана принципиальная возможность поэтапного суспензионного культивирования клеток семенника поросенка в процессе сперматогенеза.

Алгоритмы управления процессом суспензионного

культивирования сперматидов

Период сперматогенеза	Параметр	Уровень поддержания
Первый период	Температура рН еН рО2 рСО2	35+0,5°С 7,0-7,1+0,01 -200мв+10% 40% нас. + 10% 5%нac. + 10%
Второй период	Температура рН еН рО2 рСО2	35+0,5°С 7,2+0,01 -100мв+10% 40% нас. +10% 5%нас.+ 10%
Третий период	Температура рН еН рО2 рСО2	35+0,5°С 7,1+0,01 -200мв+10% 60% нас. + 10% 7%нac.+ 10%
Четвертый период	Температура рН еН рО2 рСО2	35+0,5°С 7,2+0,01 -200мв+10% 60%нас.+10% 7%нас.+ 10%

Кроме того, работы по оптимизации питательных сред на втором периоде и особенно на третьем и четвертом периодах сперматогенеза, осуществляемого нами способом суспензионного культивирования, являются более сложными и требуют дальнейшего изучения.

При культивировании вирусов ИРТ, ПГ-3 и бешенства с использованием культур клеток ПТ-80 и ВНК 21/13 в биореакторах по отработанным оптимальным параметрам в отделах вирусологии и молекулярной биологии в 2001-2004 гг. были получены данные, представленные в таблице 4.

Таблица 4

Результаты накопления вирусов при их культивировании

В работе использовали производственные штаммы Pasteurella multocida А-1231, В-681 и Д-Т-80, Haemophilus (Actinobacillus) pleuropneumoniae №5870 и ГУ-19, Streptococcus zooepidemicus П-2082 и Streptococcus suis "Касли", Salmonella typhimurium № 415 и Salmonella choleraesuis № 370. Питательные среды для выращивания вакцинных штаммов готовили по дей­ствующим инструкциям на монопрепараты, а их выращивание осуществляли по разработанным нами режимам культивирования в лабораторных фермен­терах АНКУМ-2М, оснащенных системами автоматического контроля и регу­лирования основных параметров культивирования (температура, рН, еН и рО₂).

В процессе работы культуры пастерелл, гемофильных бактерий и стреп­тококков исследовали по следующим показателям: морфология, культуральные свойства, оптическая плотность.

Культуры гемофильных бактерий инактивировали формалином в ко­нечной концентрации 0,2% при температуре 18-22°С в течение 5-6 суток и концентрировали до концентрации 20 млрд.м.т/мл методом центрифугирова­ния.

Культивирование пастерелл (P. multocida серовариантов А (шт. 1231), В (шт.681) и Д (шт. Т-80)) проводили реакторным способом на Щел­ковском биокомбинате в соответствии с режимом, разработанным сотрудни­ками отдела микробиологии ВНИТИБП.

Штамм P. multocida 115-й, получен­ный из ВГНКИ, культивировали в усовершенст­вованной питательной среде на основе перевара Хоттингера (ПХ).

Концентрация культур производственных штаммов по окончании про­цесса выращивания (10-12 час) была 22 ± 2 млрд.м.т./мл.

Культуры пастерелл инактивировали формалином в конечной концен­трации 0,3% при температуре 37°С в течение 24 часов и концентрировали ме­тодом центрифугирования на центрифуге ОТР 101 - К1 при q = 12000.

В таблице 5 и на рисунке 1 представлена динамика накопления H.pleuropneumoniae (шт. 5870 и ГУ-19) в процессе культивирования.

Таблица 5

Динамика накопления гемофилъных бактерий в процессе

культивирования (n = 3)

12

10

8

6 2-

2

0

Рис. 1. Динамика накопления гемофил штамм ГУ-19 (1) и штамм 5870 (2) в процессе культивирования.

Результаты исследований отражены в табл. 6, из которой видно, что при управляемом по еН, рН, рО₂ и концентрации глюкозы культивировании длительность фазы приспособления как по оптической плотности, так и по количеству живых бак­терий значительно короче, максимальная удельная скорость роста выше, чем при культивировании по методике выращива­ния пастерелл, предложенной ВНИВИП (контроль). Макси­мальное накопление жизнеспособных бактерий при управляе­мом выращивании наблюдалось через 8 ч роста (по методике ВНИВИП - через 10-12 ч) и составило в среднем: 38,4 млрд/см³, что почти в З раза выше максимального накоп­ления, полученного при контрольном режиме выращивания (13,7 млрд/см³). Изучение морфологии и ультраструктуры пастерелл по­зволило сделать вывод о наличии коррелятивных связей между режимом, продолжительностью культивирования и анатомическими особенностями микробных клеток в по­пуляции.

Культуральные и биохимические свойства были типичными для пастерелл штамма 115: при росте в бульоне наблюдалось равномерное помутнение среды, на агаре - мелкие просвечи­вающие колонии. На средах

Таблица 6

Показатели процесса периодического культивирования пастерелл штамма № 115

Условия культивирования	Показатели
	Продолжительность фаз роста, ч				Максимальная удельная ско-рость роста, ч-1		Максимальное накопление, млрд/см3
	лаг-фаза
	оп	живые микр.кл.	оп	живые микр.кл.	оп	живые микр.кл.	оп	живые микр.кл.
Усовершенствованная питательная среда на основе ПХ и экпериментальный режим Среднее значение Контроль (методика ВНИВИП) Среднее значение	1,00 0,25 0,60 0,55 0,60 2,25 2,35 2,30	1,00 1,00 2,00 1,75 1,44 2,40 1,90 2,15	3,25 3,25 3,05 3,05 3,15 3,50 2,90 2,15	3,50 3,00 2,70 2,00 2,80 4,10 3,55 3,82	1,20 1,38 1,23 1,35 1,29 0,92 1,15 1,03	1,68 1,47 1,73 1,61 1,62 1,15 1,15 1,15	1,25 16,50 20,50 16,40 16,16 4,75 4,80 4,81	42,10 42,10 48,90 20,60 38,40 16,50 10,90 13,70

Гисса отмечалась ферментация глюкозы, сахарозы, сорбита, маннита без образования газа и отсутствие ферментации лактозы. Пастереллы образовывали индол и сероводород.

С целью повышения продуктивности процесса получения бактери­альной массы использовали непрерывное (хемостатное) культивирование.

Условия культивирования - температуру, рН и рО₂ поддерживали на оптимальных, ранее определенных нами уровнях.

При другом режиме выращивания (скорость разбавления - 0,7 1/час и So= 3 г/л) культура пастерелл была ''растущей", более крупной, чем при скорости разбавления 0,4 1/час, в основном, эллипсоидной формы.
Во всех исследованных режимах непрерывного культивирования рост пастерелл был лимитирован глюкозой, а биохимические свойства со­ответствовали паспортным данным.

После 4 ч культивирования сальмонелл шт. ТС-177 по ранее действовавшей НТД наблюдалась фаза замедления роста. После подключения мембранного биологического реактора (МБР) концентрация жизнеспособных сальмонелл возрастала еще на протяжении 8 ч. Выращивание культивирования позволяло продлить рост и увеличить накопление жизнеспособных сальмонелл в 3-4 раза.

После этого в МБР поддерживался оптимальный режим культивирования, что позволило еще на 4 ч продлить активную фазу роста и увеличить концентрацию жизнеспособных сальмонелл еще более чем в 7 раз. Коэффициент разбавления питательной средой при этом поддерживался в пределах 0,5-0,7 1/ч.

2.2.6. Современные оборудование и методы очистки и концентрирования питательных сред, антигенов, вирусов и микроорганизмов

Использовались высокоэффективные аппараты для разделения, очистки и концентрирования полидисперсных жидких систем методами сепарирования, центрифугирования, фильтрования и ультрафильтрования. Использованы новые жидкостные сепараторы и осадительно-фильтрующие центрифуги на бесприводной основе с высокими технико-экономическими показателями. Теоретически и практически подтверждено, что применение фильтрующих перегородок в роторе и осадительно-фильтрующей центрифуги и сепаратора-разделителя позволяет улучшить качество разделения жидких биологических систем.

При проведении физико-химических исследований структуры вирусов, создания диагностикумов, получения специфических антисывороток, проведения генно-инженерных работ необходимы очищенные и концентрированные препараты.

С целью определения оптимальных условий очистки и концент­рирования культурального вируса бешенства был испытан ряд мето­дов.

Определяли условия осаждения вируса ПЭГ с молекулярной массой 1000, 3000, 6000 и 20000 Дальтон в различных концентрациях: 2,5, 5,0, 7,5 и 10,0.

Для концентрирования вируса применяли метод ультрафильтрации, позволяющий свести к минимуму необходимость использовать дорогостоящее оборудование. Он дает возможность работать с большими объемами вирусного материала. Метод основывается на отделение вируса от культуральной жидкости с помощью полупроницаемых мембран с определенной степенью пористости.

Наиболее широко применяемым способом получения вирусов в чистом виде является центрифугирование дифференциальное, равновесное и в градиенте плотности. При высокоскоростном центрифугировании 90 тыс.g. полное осаждение вируса происходило за 6 часов.

Для концентрирования вируса бешенства использовали равновесное центрифугирование на «подушке» сахарозы(55%), хлористого цезия (22%) и глицерина (80%). Проводили центрифугирование при 161 тыс.g на ультрацентрифуге в течение 4 ч.

На основании полученных результатов была составленна схема получения очищенных и концентрированных препаратов вируса бешенства. По предлагаемой схеме очистки и концентрирования вируса бешенства удается получить высокоочищенный на 99,99% вирус.

Для получения очищенных и концентрированных препаратов вируса ИРТ КРС были испытаны те же принципы выделения вирусов из суспензий.

Результаты получены аналогичные как при выделении вируса бешенства.

В работе был использован вирус бешенства, штамм «Щелково-51», репрдуцированный в культуре клеток ВНК-21/13. Вирус инактивировали при различной температуре, фенолом и -пропиолактоном.