Сұраншиев Ж.Ә. «Ветеринарлық вирусология» пэоәК
Гемагглютинацияны тежеу реакциясы
жүктеу/скачать 4.8 Mb. Pdf көрінісі
|
- Бұл бет үшін навигация:
- ГАТР көмегімен антиденелердің титрін анықтау әдісі.
| Гемагглютинацияны тежеу реакциясы (ГАТР)
антиденелердің гемагглютинациялаушы вирустардың гомологты антигендерімен әрекеттескен жағдайда антиген-антидене кешенін түзетіндігіне негізделген, бұл кезде вирус тек инфекциялық белсенділігін ғана емес, сонымен бірге гемагглютинациялаушы қасиетін де жоғалтады. Бұл реакцияда байланысқа түспеген вирустың индикаторы ретінде агглютинациялаушы белсенділік көрсететін жануардың сол түрінен алынған эритроциттері қолданылады. Оң реакцияның белгісі болып гемагглютинация құбылысының байқалмауы (тежелуі немесе кешігуі) табылады. ГАТР вирустар мен олардың штамдарының идентификациясында, ретроспективті балауында, постинфекциялық иммунитетті анықтауда, жануарлардың иммунологиялық күйлерін айқындауда қолданылады. Зерттеуге алынған материалда гемагглютинациялаушы вирус антигенінің қандай мөлшерде екендігі немесе антиденелердің қандай титрінде болатындығы белгісіз болғандықтан, аталмыш материалдарды реакцияны қояр алдында екі есе сұйылтып алады. Сәйкесінше реакцияға қажетті екінші стандартты телімді компонент (референс) ретінде тұрақты жұмыс сұйылтымындағы қан сарысуы немесе тұрақты жұмыс дозасындағы вирус алынады. Референс-вирус үшін стандартты гемагглютинациялаушы титрі 4 гемагглютинация-лаушы бірлікке (ГАБ) тең болып табылады. ГАТР көмегімен антиденелердің титрін анықтау әдісі. ГАТР микроәдісі иммунологиялық реакциларға арналған 96-шұңқыршалы планшеттерде жүргізіледі. 1. Зерттеуге алынған қан сарысуы сынамасынан екі еселенген сұйылтым дайындайды. Ол үшін №1-ден №5-ке дейінгі шұңқыршаларға 50,0 мкл-ден физиологиялық ерітінді (рН 7,2) құяды, одан кейін №1 шұңқыршаға 50,0 мкл зерттеуге алынған қан сарысуын қосып, араластырғаннан кейін, одан 50,0 мкл алып келесі №2, одан №3, №4 және №5 шұңқыршаларға үлестіру арқылы сұйылтады да, соңғы №5 шұңқыршаны аралсатырғаннан кейін 50,0 мкл алып тастайды. Сәйкесінше, шұңқыршалардағы қан сарысуының сұйылтымдары: 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32 болады. 2. Қан сарысуларының әрбір сұйылтымдары бар шұңқыршалардың барлықтарына 4 ГАБ референс-вирусты 50,0 мкл-ден қосады. 3. Зерттеуге алынған қан сарысуы сынамаларымен қатар №6,7,8,9,10,11 шұңқыршаларда келесі бақылау сынамалары қойылады: №6 шұңқыршаға (зерттеуге алынған қан сарысуларының құрамында гемагглютининдердің болуын бақылау) – 50,0 мкл физиологиялық ерітініді және 50,0 мкл сұйылтылмаған қан сарысуы енгізіледі; №7 шұңқыршаға (эритроциттердің өздігінен агглютинациялануын бақылау) – 100,0 мкл физиологиялық ерітінді құяды; №8, 9, 10, 11 шұңқыршаларға (вирустың жұмыс дозасын – 4 ГАБ бақылау) – 50,0 мкл физиологиялық ерітінді, сосын №8 шұңқыршаға 50,0 мкл 4 ГАБ титріндегі вирусты енгізіп араластырады да, одан 50,0 мкл алып №9 шұңқыршаға енгізіп араластырады және одан 50,0 мкл алады да, №10 шұңқыршаға, одан кейін №11 шұңқыршаға құйып, араластырады. Соңында №11 шұңқыршадан 50,0 мкл алып тастайды. 4. Бөлме температурасында 30-40 минут инкубациялайды. 5. Барлық шұңқыршаларға 50,0 мкл-ден 1,0%-ды эритроциттердің суспензиясын енгізеді. 6. Бөлме температурасында 15-20 минут инкубациялайды. 7. Гемагглютинация бойынша нәтижесін есептейді. 8. Зерттеуге алынған қан сарысуларының құрамындағы антиденелердің титрлерін анықтайды. Гемагглютинацияның толығымен тежелуін қамтамасыз ететін қан сарысуының ең жоғарғы сұйылтымы ГАТР-дағы антиденелер титрі ретінде алынады (10-кесте). 10-кесте. ГАТР-да қан сарысуларын титрлеу схемасы Шұңқырша № 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Реакция компоненттері Қан сарысуы сұйылтымы SХ Бақылау 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 Эр. SX АГ (вирус) ГАБ 2 1 1/2 1/4 1. Физиологиялық ерітінді (мкл) 50,0 50,0 50,0 50,0 50,0 100,0 50,0 50,0 50,0 50,0 50,0 2. Зерттеуге алынған қан сарысулары SХ 50,0 50,0-ден ауыстыру - 50,0 - - - - 3. Вирус Т = 4 ГАБ 50,0 50,0 50,0 50,0 50,0 50,0 50,0-ден ауыстыру 30–40 минут бөлме температурада қалдыру 4. 1,0%-ды эритроцит суспензиясы 50,0 50,0 50,0 50,0 50,0 50,0 50,0 50,0 50,0 50,0 50,0 15–20 минут бөлме температурада қалдыру 5. Нәтижені есепке алу - - - +++ +++ - - +++ ++ + - Сонымен 10-кесте көрсеткіші бойынша SX қан сарысуының құрамындағы антиденелердің титрі 1:8 болды. ГАТР қою барысында реакцияда алынған вирустың титрі неғұрлым төмен болса, зерттеуге алынған қан сарысуының концентрациясының да біршама төмен болатындығын есте ұстаған жөн. 4 ГАБ болатын вирус титрі – ең төмен болып есептеледі, өйткені вирусқа тең көлемде қан сарысуын қосқан жағдайда титр 2 ГАБ-ке төмендейді. Бұл әрбір шұңқыршаға вирус пен қан сарысуының жалпы мөлшеріне тең көлемде эритроцит суспензиясын қосқанда, вириондардың саны эритроциттердің 100% агглютинациялануы үшін жеткілікті болады (вирустың 1 ГАБ-і 50% эритроциттерді агглютинациялайды). Егер вирус титрі 4 ГАБ-тен төмен алынса, онда гемагглютинация феноменінің байқалмау қауіпі бар болады, өйткені вириондардың саны эритроциттердің 50%-ының агглютинациялауына қажетті мөлшерінен аз болуы мүмкін. Антиденелердің титрін анықтау дәлдігіне қан сарысу сұйылтымдарының да жоғары болуы айтарлықтай әсер етеді. Қан сарысуының сұйылтымы неғұрлым төмен болса, антиденелер титрінің мәні соғұрлым дәлірек болады. Сондықтан қан сарысуларының екі еселенген сұйылтымдарын қолдану қабылданған. Антиденелерді анықтау және олардың титрлерін айқындау үшін зерттеуге алынған қан сарысуы сынамалары вирустардың гемагглютинациялаушы қасиетін басуға қабілеті бар термолабильді және термостабильді телімсіз ингибиторлардан алдын ала босатылады. Термолабильді ингибиторлардан арылту үшін қан сарысуларды 56-62°С аралығында су моншасында қыздырады: ірі қара мал, жылқы, теңіз шошқасы және т. б. қан сарысулары – 56°С; әтеш, қаз, үйрек қан сарысулары – 58°С; егеуқұйрық, тышқан, қоян қан сарысулары – 60°С; қой, ешкі қан сарысулары – 62°С температурада. Термостабильді ингибиторлардан босату үшін қан сарысуға сорбенттердің (риванол, калий иодаты, бентонид, каолин, белсендірілген көмір) бірін қосады немесе олар арқылы (алдын ала 1:10 қатынасында дистильденген суда сұйылтылған) көмір қышқыл газын өткізеді. Бұл жағдайда газ көпіршіктері қан сарысуларынан 3-5 минут аралығында өтіп, оларды лайландырады. Содан кейін қан сарысуын 2000-2500 айналымда 10-20 минут центрифугалап, тұнба сұйықтығын алады (ингибиторлар тұнбада қалады). Изотонияны қалпына келтіру үшін сұйылтылған қан сарысуына 0,1 көлемде физиологиялық ерітінді қосылады. ГАТР артықшылықтарына оның телімділігі мен сезімталдығы, реакцияны қою техникасының қарапайымдылығы және ауруды ертерек балау мүмкіндігі жатады. Алайда, бұл экспресс-әдістер қатарына жатқызылмайды, өйткені реакцияны қоймас бұрын гемагглютинациялаушы вирусты тамшылы ГАР-мен анықтап алу қажет. жүктеу/скачать 4.8 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|