Учебно методические материалы по подготовке к лабораторным и семинарским занятиям по курсу вирусологии

РКЭ вначале овоскопируют, на скорлупе отмечают границу воздушной камеры. Её поверхность обрабатывают спиртом и обжигают. Стерильными ножницами срезают скорлупу на 2...3 мм выше границы воздушной камеры, Разрывают подскорлупную и хорион-аллантоисную оболочки, асептически извлекают эмбрион и помещают его в чашку Петри. Затем у эмбриона удаляют лапки, крылья, голову и обязательно внутренние органы. Оставшуюся часть (кожно-мышечный мешок) промывают буферным раствором Хенкса с антибиотиками. После трехкратного отмывания эмбрион измельчают ножницами на кусочки размерами 2...3 мм. Измельченную ткань 3 раза отмывают в растворе Хенкса с антибиотиками от слизи и элементов крови и переносят в колбу для трипсинизации. Ткань в колбе заливают двойным объемом 0,25%-ного раствора трип­сина, подогретого до 37 °С, и вносят стериль­ный магнит. Колбу ставят на магнитную ме­шалку. Раствор трипсина и механическое воздействие вращающегося магнита способствуют растворению межкле­точного вещества, разделению клеток и пере­ходу отдельных из них в раствор. Первый этап трипсинизации продолжается 3...5 мин. Затем отделившиеся клетки вместе с трипси­ном сливают в центрифужные пробирки и помещают в кювету со льдом, чтобы ограни­чить дальнейшее воздействие трипсина на клетки. К оставшейся ткани добавляют вто­рую порцию трипсина, и колбу снова поме­щают на магнитную мешалку. Скорость вращения регулируют так, чтобы не наступало вспенивания содержимого колбы. Трипсинизацию проводят 3-4 раза, до полного истощения ткани, кото­рое определяют по белесоватому оттенку кусочков и их разбуха­нию. После окончания трипсинизации полученную взвесь клеток 10...15 мин подвергают центрифугированию при 1000 об/мин. Надосадочную жидкость сливают, а осадок клеток ресуспензируют в питательной среде (1:10), подогретой до 37 °С, и сливают в колбу через 3-4 слойный марлевый фильтр. После перемешивания суспензии клеток берут две ее пробы по 0,5 мл. К каждой из них добавляют по 0,5 мл 0,1%-го кристаллвиолета в 0,1N растворе лимонной кислоты. После перемешивания каплю суспензии помещают в счетную камеру Горяева и подсчитывают клетки, имеющие хорошо заметное ядро и неповрежденную ци­топлазму. Клетки подсчитывают не менее как в трех больших квадратах камеры. Из полученных данных находят среднее арифметическое. Количество клеток в 1 мл определяют по фор­муле

а х 4000 х б

Х = --------------------

в

где а — среднее количество клеток в малом квадрате; б — степень разведения; в — количество подсчитанных малых квадратов.

Для культивирования клеток в каждую пробирку засевают 1-15 мл суспензии; во флаконы емкостью 100 мл — 20 мл, 250 мл— 40 мл, 1л — 100 мл клеточной взвеси. Флаконы и пробирки плотно закрывают стерильными резиновыми пробками.

На пробирках восковым карандашом проводят продольную черту, укладывают их чертой вверх ящики с наклонным дном (угол 6°) и помещают в термостат при 37 °С.

Клетки фиксируются на внутренней поверхности пробирки. Через 24...48 ч образуется сплошной слой клеток, располагающихся 1 один ряд (монослой).

1. Отобрать хорошо развитые куриные эмбрионы в возрасте 7...10 дней.

2. Вскрыть эмбрионы и получить кожно-мышечный мешок.

3. Провести трипсинизапию кожно-мышечной ткани куриного эмбриона.

4. Провести центрифугирование и подсчет клеток в камере Горяева.

5. Подготовить взвесь клеток в ростовой питательной среде в концентрации 200 тыс./мл, используя результаты подсчета 1 камере Горяева и рекомендуемую выше формулу.

6. Провести разлив клеточной взвеси по пробиркам.

Примерный план занятия (2 ч)

1. Контрольный опрос.

2. Объяснения преподавателя.

3. Демонстрация преподавателем каждого этапа трипсинизации.

4. Самостоятельная работа студентов: подготовить рабочее место для трипсинизации; подготовить куриные эмбрионы для трипсинизации; провести трипсинизацию, получить суспензия клеток необходимой концентрации и разлить ее по пробиркам.

5. Подведение итогов занятия.

6. Задание к следующему занятию.

Методические указания

При выполнении трипсинизации студентов делят на 2 подгруппы (в зависимости от наличия на кафедре материальных средств). Самая главная подготовка к этому занятию — обеспечение стерильной посудой, инструментами, средами, растворами которые должны быть заранее подготовлены.

При отсутствия условий регулярного получения культур клеток можно приготовить фиксированные препараты. Для этого надо предварительно получить культуру клеток в пробирках, отмыть клетки раствором Хенкса и залить 70°-ным спиртом. Такие препараты могут сохраняться много месяцев при комнатной температуре. Главное, что обеспечивает успех получения первичных культур клеток, — это полная стерильность инструментов, посуды и материала, а также сохранение стерильности при манипу­ляции с ними.

Вопросы домашнего задания

1. 
   Клеточные и гуморальные механизмы противовирусной защиты.
   
2. 
   Перевиваемые культуры клеток.
   
3. 
   Техника заражения клеточного монослоя.
   
4. 
   Формы цитопатогенного действия (ЦПД).
   

Одним из методов получения перевиваемых клеток являет­ся отбор клеток первичной культуры с повышенной активностью роста. Отбор осуществляют при регулярной смене среды. Для поддержания отобранных клеток в жизнеспособном состоянии , питательную среду каждые 3...4 дня заменяют свежей. Обычно работа по получению перевиваемых клеток продолжается в тече­ние многих месяцев.

В результате подбора специальных питательных сред, ре­жима культивирования удается адаптировать отдельные клетки к определенной питательной среде и перевивать их очень долго. Клетки, которые приобрели способность к длительному пассированию вне организма, получили название перевиваемых. Таким образом, перевиваемые клетки — это такие клетки, которые перевиваются из одного сосуда в другой при условии замены питательной среды с сохранением потенциальной возможности к дальнейшему размножению.

К перевиваемым клеткам из нормальных тканей относят: штамм L (мышиные фибропласты, 1943), СОЦ (из сердца обезьяны циномольгус, 1957), С-18 (из эмбриональной почки поросенка, 1960), ФК (фибробласты крысы, 1954) и др.

Перевиваемые клетки из опухолевой ткани включают: НеLа (клетки рака шейки матки женщины, 1952), Нер-2 (клетки кар­циномы гортани человека, 1955), Нер-3 (клетки лимфоиднов карциномы человека, 1955) и др.

Разновидностью перевиваемых клеток являются диплоидные клетки. Это морфологически однородные культуры, стабили­зированные в процессе культивирования in vitro, имеющие ограниченный срок жизни (не более 50 пассажей), сохраняющие правильный диплоидный набор хромосом, свойственный исход­ной ткани, свободные от посторонних вирусов и микробов и не обладающие онкогенной активностью.

Необходимо отметить, что для некоторых зоопатогенных вирусов наиболее употребимы определенные виды перевиваемых клеток (табл.2), например, ВНК-21 для вируса ящура, РК-15— для вируса чумы свиней, диареи крупного рогатого скота, ПЭК - для вируса ринотрахеита, ТБ — для вируса герпеса и т.д. Поэто­му ряд видов культур клеток надо уметь сохранять в условиях лаборатории. Основным способом длительного сохранения пере­виваемых клеток является их глубокое замораживание (до минус 70 °С) в присутствии глицерина, сыворотки крови с последую­щим хранением ампул в жидком азоте (минус 196 °С). Все это способ­ствует длительному (до 5...6 месяцев) сохранению клеток.

Перевиваемые клетки имеют следующие преимущества пе­ред первично-трипсинизированными:

1. Они обычно не загрязнены посторонней микрофлорой, как это часто наблюдается в первичных культурах.

2. Большинство их обладает более широким спектром чув­ствительности к вирусам, чем соответствующие первичные куль­туры. Это зависит от происходящих в них физиологических из­менений.

3. Для изготовления перевиваемых клеток требуется мень­ше средств и труда по сравнению с приготовлением первичных культур.

4. Эти клетки чаще, чем первичные культуры, используют­ся для выделения вирусов из материалов, содержащих бактерии, поскольку менее чувствительны к высоким концентрациям анти­биотиков (результат адаптации при пассировании в питательной среде с антибиотиками).

5. Для перевиваемых клеток характерна вирусологическая стерильность (отсутствие спонтанного вирусоносительства).

Вместе с тем, перевиваемые клетки имеют и ряд недостат­ков, которые в известной степени ограничивают их применение. Они склонны к малигнизации, т.е. злокачественному перерожде­нию, независимо от происхождения, требуют постоянного пассирования с использованием свежей среды, подвержены неспецифической дегенерации (изменяется морфология и снижается чувствительность к вирусам).

Таблица 3.

Характеристика основных свойств перевиваемых линий клеток, полученных из органов различных животных

Перевивание клеток производят в следующем порядке:

1. Снятие клеточного монослоя. Растущие клетки довольно прочно прикрепляются к поверхности стекла под слоем питательной среды. Снять их можно механическим путем (соскабливанием). Однако, это грубый прием, ведущий к значительному повреждению клеток. Чаще применяют 0,02%-ный раствор версена. Диспергирующее действие версена объясняется связыванием им двухвалентных катионов, в частности магния и кальция, т.е. тех ионов, которые способствуют прикреплению клеток к стеклу и обеспечивают целостность клеточной культуры. Под действием версена клетки отделяются от стекла, округляются и образуют взвесь. Из сосудов с развившимся клеточным монослоем сливают питательную среду, добавляют 0,5...1 мл подогретого до 37° (раствора версена и выдерживают в термостате 20...30 мин при периодическом покачивании.

2. Отделение клеток. Взвесь клеток в версене помещают в центрифужные пробирки и центрифугируют при 800...1000 об/мин в течение 7...10 мин. Надосадочную жидкость сливают, а осадок клеток ресуспендируют в небольшом количестве питательной среды. Подсчет клеток проводят в камере Горяева так же, как и при получении первичных культур.

3. Посев клеток. После подсчета исходную клеточную взвесь разводят ростовой питательной средой до необходимой концентрации. Приготовленную взвесь вносят при помешивании на магнитной мешалке или пипетированием в пробирки или матрасы и закрывают резиновыми пробками. Посевная доза клеток 1 пробирки 80... 100 тыс/мл, матрасы, флаконы — 25...30 тыс/мл . На пробирках восковым карандашом проводят продольную черту (чертой кладут вверх), засеянные клетки культивируют в термостате при 37 °С в течение 3...4 суток до образования сплошного монослоя. Полученный монослой сохраняет при 37 °С жизнеспособность в течение 5...10 суток в зависимости от вида клеток и состава питательной среды. В течение этого срока клетки можно отделить от стекла, подвергнуть транспортировке или использовать для длительного хранения.

Транспортируют клеточные культуры чаще всего авиапочтой в герметически закрытых сосудах. При этом следует избегать резких колебаний температуры, особенно замерзания или перегревания. По мере старения клеток производят пассаж - переносят их в пробирки со свежей питательной средой.

а) контроль монослоя в норме (4-6 пробирок). В этом случае из пробирок удаляют ростовую питательную среду и заменяют ее поддерживающей;

б) контроль монослоя, инфицированного эталонными штам­мами вирусов (4-6 пробирок). При этом пробирки с культурой клеток заражают известными (эталонными) вирусами;

в) контроль монослоя, контактировавшего с экстрактом аналогичной ткани, не зараженной вирусом. Для этого берут не­зараженную ткань, аналогичную той, где предполагается наличие вируса. Из нее готовят материал и заражают 4-6 пробирок с культурой клеток.

Все пробирки помещают в ящик с наклонным дном (угол 6°) так, чтобы монослой оказался под питательной средой (чертой вверх) и инкубируют в термостате при 37 °С. Клетки ежедневно микроскопируют под малым увеличением микроскопа (объектив х8 или х10), сравнивая культуры, зараженные вирусом, с кон­трольными.

Формы ЦПД. При взаимодействии вирусов с клетками в по­следних наблюдаются различные морфологические изменения, которые обусловливаются рядом факторов, особенно степенью чувствительности клеток культуры к вирусу и условиями среды.

Контакт вирусов с восприимчивыми клетками сопровожда­ется острой или латентной инфекцией и неопластической транс­формацией последних. При инфекции отмечаются деструктивные изменения в зараженных клетках, часто приводящие к их гибе­ли. Все морфологические изменения, возникающие под воздейст­вием вируса, называют цитопатическим действием (эффектом), сокращенно ЦПД (ЦПЭ). При латентной инфекции репродукция вируса в зараженных клетках не приводит их к гибели, и внешне они не отличаются от нормальных (не зараженных).

Первоначальный этап взаимодействия вирусов с клеткой — это изменение некоторых звеньев обмена веществ, которые можно выявить определенными гистохимическими реакциями. Одним из ранних проявлений такого взаимодействия является увеличение размеров ядра (дезинтегративное набухание). Эта реакция неспе­цифична, поскольку она не зависит от биохимического состава и размера вирусов, их биологических свойств. Данное явление ха­рактерно для вирусов, вызывающих как острую, тек и хрониче­скую инфекцию.

Второй этап — специфический. Одна из его особенностей — проявление характерного ЦПД вируса. При этом некоторые виру­сы (аденовирусы и др.) поражают ядра клеток, другие — цитоплазму (вирус гриппа и др.), третьи же разрушают и ядро, и цитоплазму.

При исследовании под микроскопом клеточного монослоя отмечают следующие морфологические изменения при остров инфекции:

а) округление клеток. Они принимают шаровидную форму, отделяются от стекла и свободно плавают в культуральной жид­кости;

б) появление в цитоплазме пораженных клеток мелкой зер­нистости;

в) увеличение в размерах этой зернистости и появление внутриклеточных включений;

г) очаговые скопления округлившихся клеток в виде гроз­дьев винограда;

д) образование гигантских многоядерных клеток — симпластов, синцитиев;

е) появление в монослое клеток "стерильных пятен", т.е. участков без клеток;

ж) полное "сползание" клеток со стекла.

При латентной инфекции вирус в клетках размножается, но не вызывает их видимого разруше­ния. Клетки остаются жизнеспо­собными, однако интенсивность клеточного деления понижается, со временем изменяется их морфоло­гия.

При неопластической трансфор­мации у пораженных клеток образуются плотные фо­кусы трансформации различной величины и формы белого цвета.

1. Просмотреть под микроскопом монослой первичнотрипсинизированных и перевиваемых клеток в норме (не зара­женных вирусом).

2. Отработать методику заражения клеточного монослоя вируссодержащим материалом.

3. Изучить формы ЦПД вирусов в клеточном монослое под микроскопом, на таблицах и слайдах.

1. Контрольный опрос.

2. Объяснения преподавателя.

3. Демонстрация методики заражения культур клеток; ос­новных форм ЦПД (на фото, слайдах, препаратах).

4. Самостоятельная работа студентов.

5. Подведение итогов занятия.

6. Задание к следующему занятию.

Методические указания

Для занятия необходимо иметь: а) заранее полученные культуры клеток (куриные фибробласты в норме и зараженные вирусом). Эти культуры будут использованы студентами как для изучения форм ЦПД и нормы клеток, так и для постановки реакции гемадсорбции; б) фиксированные окрашенные микро. препараты культур клеток в норме и с различными формами ЦПД.

При отсутствии регулярного получения культур клеток можно приготовить фиксированные препараты. Для этого надо получить культуру клеток. В пробирках с хорошим монослоем слить среду, отмыть клетки раствором Хенкса и залить 70°-ным спиртом. Такие препараты могут сохраняться много месяцев при комнатной температуре и быть использованы студентами для изучения клеток в норме и с ЦПД.

Вопросы домашнего задания

1. Клеточные и гуморальные механизмы противовирусного иммунитета.

2. Виды лабораторных животных и методы их заражения.

3. Правила вскрытия животных.

4. Взятие крови, получение сыворотки и плазмы, эритроци­тов, лейкоцитов.
ЗАНЯТИЕ 12. Заражение, культивирование вирусов в организме лабораторных животных и выделение.

Цель занятия: освоить различные методы заражения и ме­тодику вскрытия трупов лабораторных животных, отработать технику взятия материала для вирусологического исследования, научиться получать различные компоненты крови.

Оборудование и материалы: лабораторные животные (кро­лики, белые мыши, морские свинки), шприцы и инструменты для заражения животных и взятия крови, вируссодержащий ма­териал, трупы лабораторных животных, пенициллин, стрептомицин, стерильные инструменты для вскры­тия, раствор Хенкса, пробки резино­вые, пенициллиновые флаконы, стерильные марлевые салфетки, колбы с бусами, пробирки, колбочки на 50 мл, воронка, пробирки центрифужные, физио­логический раствор, штативы, центрифуга, таблицы по теме.

Издавна лабораторных животных применяют для индика­ции вирусов в патматериале, т.е. для постановки биопробы. С этой целью суспензией патматериала заражают лабораторных животных и учитывают реакцию на заражение. В вирусологиче­ской практике для диагностики бешенства ставят биопробу на мышатах, инфекционного бронхита кур — на цыплятах, ящура — на морских свинках, болезни Ауески — на кроликах и т.д. (табл.4).

Таблица 4.

Восприимчивость лабораторных животных к вирусам

Обычно признаки присутствия вируса в организме животно­го малоспецифичны и не позволяют сделать вывод о том, какой это вирус. Однако, бывают случаи, когда биопроба сопровождает­ся характерной клинической картиной, специфичной для опреде­ленного заболевания. Тогда положительная биопроба позволяет сделать вывод не только о присутствии вируса в патматериале, но и его видовой принадлежности. Например, при зуде у кролика на месте введения патматериала, расчесов и разгрызаний — зараже­ние вирусом болезни Ауески.

В настоящее время лабораторных животных используют для:

1) обнаружения вируса в патматериале;

2) первичного выделения вируса из патматериала;

3) накопления вирусной массы;

4) поддержания вируса в активном состоянии;

5) титрования вируса;

6) в качестве тест-объекта в реакции нейтрализации;

7) получения гипериммунных сывороток.

При выполнении биопробы необходимы лабораторные жи­вотные различных видов — белые мыши, крысы, хомяки, мор­ские свинки, хорьки, собаки, обезьяны, кролики, куры. Лабора­торные животные должны быть получены из хозяйства, благополучного по инфекционным и инвазионным заболеваниям; они должны быть клинически здоровыми и иметь достаточный вес; во внимание обязательно принимают возраст животных (в некоторых случаях к вирусу наиболее чувствительны новорож­денные, в других — можно использовать взрослых).

Животных перед заражением выдерживают в карантине 2...3 недели. За ними проводят клинические наблюдения и лабо­раторные исследования для исключения инфекционных и инва­зионных болезней. Помещение, где содержатся животные, долж­но иметь отдельный изолированный вход, достаточно света, хорошую вентиляцию. Животных, зараженных вирусами, необ­ходимо содержать в отдельном помещении.

Существуют и способы индивидуальной метки. Для крупных животных и кур используют металлические бирки со штампованным номером. Их надевают на корень уха (кроликам), вставляют в ушную раковину по типу серьги (морским свинкам), надевают на ногу (курам).

Для метки белых мышей и крыс чаще всего применяют нанесение цветных пятен на непигментированную шерсть. Насыщенный раствор пикриновой кислоты лучше других красителей удерживается на шерсти и коже животных. Цветные метки ставят в местах, соответствующих определенному порядковому номеру животного. Так, если его тело разделить условно на три продольные части (левый бок, спина, правый бок), то нанесе­ние цветных меток начинают с левого верх­него угла, т.е. лопатки; это будет соответст­вовать 1. Двигаясь назад, левый бок соответствует 2, левое бедро — 3, далее за­тылок — 4, спина — 5, область репицы — 6, правое плечо — 7, правый бок — 8, правое бедро — 9. Используя два цвета красителей, можно дать одним из них обозначения еди­ниц, другим — десятков.

Исследуемым материалом рекомендуется заражать сразу нескольких животных раз­ными способами, но с учетом тропизма ви­руса. Поскольку при первичном заражении животное может не заболеть, через 5...7 дней здоровых на вид животных убивают, а их органы используют для заражения следующей группы животных. Обычно делают обычно три "слепых" пассажа.

Вируссодержащий материал может быть введен лаборатор­ным животным различными методами. Выбор метода заражения определяется тропизмом вируса. Зная тропизм, мате­риал вводят в органы, содержащие чув­ствительные к этому вирусу клетки. На­пример, вирус гриппа вводят интраназально, вирус бешенства — интрацеребрально.

Применяют следующие методы зара­жения.

Кроликов и морских свиной, заражают путем прокола кости в области подглазничной борозды. Кожу при этом смещают от середины к борозде, чтобы она после инъекции, приняв естественное положение, закрыла отверстие в черепе. Иглу при инъекции держат наклонно по отношению к средней линии, исключая тем самым попадание ее в глазницу. Доза материала 0,3...0,5 мл.

После заражения животные должны быть помещены в клет­ки, на которые навешивают этикетки с указанием вируса или номера экспертизы, количе­ства зараженных животных, да­ты заражения. В рабочем жур­нале записывают номер экспертизы исследуемого мате­риала, количество и характери­стику зараженных животных, их маркировку, метод введения и дозу вируса. За животными устанавливают наблюдение, обращая внимание на их внешний вид, подвижность, прием пищи и т.п. Следует отметить, что гибель животных в первые дни после заражения может быть связа­на с травмой или токсическим действием исследуемого материа­ла.

В последующие дни после заражения, ведут ежедневные наблюдения за животными, контролируя их клиническое состояние. Так, при размножении вируса в клетках респираторного тракта наблюдаются кашель, хрипы, одышка, при размножении вируса в клетках мозга — судороги, парезы, параличи и т.д. Од­нако, клинические признаки большей частью носят неспецифический характер и на этом этапе исследований нет возможности прийти к заключению, какой именно вид вируса вызвал заболе­вание. Для этого необходимо провести идентификацию обнаруженного вируса с помощью серологических реакций.

Перед вскрытием труп животного дезинфицируют: мелких животных погружают в 2,5%-ный раствор фенола на 10...15 мин, крупных - опрыскивают дезраствором. Вскрытие проводят со строгими соблюдением асептики и личной профилактики. Разрез кожи делают по белой линии живота. Кожу препарируют и оттягивают в стороны. Коленные складки и подмышечные ямки обнажают для исследования лимфатических узлов. После этого труп животного дезинфицируют повторно, меняют инструменты и вскрывают брюшину и грудную полости. Разрез делают так, чтобы не повредить желудок и кишечник. Затем удаляют мышцы живота и брюшину, обнажая при этом сердце, почки, печень, селезенку и снова меняют инструменты.

В зависимости от заболевания у трупа асептически берут патматериал. Чаще всего это кусочки паренхиматозных органов, кровь, ткани головного и спинного мозга, различные транссудат и экссудаты, моча и др. Материал помещают в стерильную посуду и замораживают. В обязательном порядке проводится посев на сахарные МПА и МПБ в целях исключения бактериальной флоры.

После вскрытия и взятия материала труп, остатки корма, подстилку подвергают автоклавированию или сжигают.

Для удаления эритроцитов кровь обрабатывают гипотониче­скими растворами. Хорошие результаты дает 0,83-0,84%-ный раствор хлористого аммония, способный лизировать эритроциты, не разрушая лейкоциты. Раствор готовят на трис-НС1-буфере рН 7,6 или дистиллированной воде, фильтруют и добавляют к крови в соотношении 9:1. Лизис эритроцитов наступает в течение 2...3 мин. Более эффективны свежеприготовленные растворы, по­догретые до 37 °С. После лизиса эритроцитов суспензию центри­фугируют при 500 об/мин в течение 5 мин так, чтобы осели лей­коциты, а тени эритроцитов и комплексы гемоглобина остались в надосадочной жидкости, которую сливают. Лейкоциты отмывают 2 раза раствором Хенкса и используют в дальнейшей работе.

1. Отработать методику заражения под кожу (белая мышь, морская свинка), внутривенно (кролик), внутрибрюшинно (белая мышь).

2. Освоить методику вскрытия трупов зараженных лабора­торных животных (белая мышь, морская свинка).

3. Освоить методы получения крови и ее компонентов.

1. Контрольный опрос.

2. Объяснения преподавателя.

3. Демонстрация приемов фиксации животных; методов экспериментального заражения кроликов и белых мышей; мето­дов умерщвления лабораторных животных: техники вскрытия трупов лабораторных животных; техники получения крови от лабораторных животных.

4. Самостоятельная работа студентов.

5. Подведение итогов занятия.

6. Задание к следующему занятию.

Методические указания

Из лабораторных животных удобнее использовать кроликов белых мышей, которые по сравнению с морскими свинками бо­лее выносливы, но, в противоположность белым крысам, не аг­рессивны. Животных используют только для отработки методов их экспериментального заражения, применяя стерильный физраствор.

При вскрытии белых мышей их помещают в кювету на слой воска, поверх которого кладут лист бумаги. Прикрепляют труп мыши препаровальными иглами. После вскрытия труп заворачивают в эту же бумагу и переносят в автоклавную.

Вопросы домашнего задания

1. Противоопухолевый иммунитет.

2. Понятие о титре, цель и методы титрования вирусов.

ЗАНЯТИЕ 13. Принципы титрования вирусов и антисывороток

Цель занятия: отработать различные методики титрования вирусов.

Оборудование и материалы: тексты задач по титрованию вирусов для каждого студента.

Краткие теоретические сведения

При работе с вирусами постоянно возникает необходимость определения его количества в том или ином материале. Без этого невозможны экспериментальное заражение вирусами живых лабораторных систем, производство вакцин и диагностических препаратов, оценка активности противовирусных вакцин, получение иммунных сывороток и др.

Титр вируса — это количество вирусных частиц в единице объема материала. Однако, количество вируса невозможно выразить в обычно применяемых единицах (объем, масса), поэтом прибегают к измерению в единицах действия или единицах активности (инфекционные единицы). В практике нашли применение два типа единиц количества вируса: 1) инфекционные единицы локальных повреждений, вызываемые вирусами и оцениваемые по единичному эффекту; 2) инфекционные единиц 50%-го действия вирусов на чувствительные живые объекты.

Определение титра вируса по инфекционным единицам локальных повреждений. Из локальных повреждений, вызываемы вирусами, известны бляшки в зараженных культурах клеток (островки мертвых клеток в слое живых) и оспины — некротические узелки на ХАО куриных эмбрионов. В этих случаях говорят о бляшкообразующих единицах (БОЕ) и оспинообразующих единицах (ООЕ). Одна БОЕ равна дозе вируса, способной образовать одну бляшку, а одна ООЕ — одну оспину.

Методика определения сводится к следующему. Точными объемами исследуемого вируссодержащего материала заражают несколько культур клеток в матрасах или куриных эмбрионов в ХАО. Затем подсчитывают количество бляшек в каждом матрасе и количество оспин в каждом курином эмбрионе. Рассчитывают среднее арифметическое. Оно точно равно количеству БОЕ или ООЕ вируса. Поскольку объем заражающей дозы точно известен, нетрудно рассчитать, сколько БОЕ или ООЕ приходится на еди­ницу объема вируссодержащего материала. Это и будет титром вируса в материале.

Например, вируссодержащим материалом в разведении 10^-3 заразили 5 эмбрионов и получили 10, 13, 6, 9 и 10 оспин. Сред­нее арифметическое суммы составит 9,6. Титр вируса в ООЕ оп­ределяют по формуле:

а 9,6

V n 0,2 х 10^-3

где а— среднее количество подсчитанных оспин; V— объем ви­руссодержащего материала, использованного для заражения; п — степень разведения вируссодержащего материала. Следовательно, исходя из наших расчетов, в 0,2 мл вируссодержащего материала в разведении 10^-3 содержится 48000 ООЕ.

Этот пример титрования вирусов является упрощенным, так как он не учитывает случаев высокой концентрации вируса в ма­териале, при которой бляшки или оспины могут сливаться между собой, и их невозможно будет сосчитать. Обычно счету поддаются бляшки и оспины, количество которых не превышает 50 на матрас или ХАО. Поскольку титр вируса в исследуемом материале обычно не известен (он подлежит определению),то неизвестно, в каком разведении надо брать материал для заражения, чтобы избежать слияния бляшек или оспин.

В этом случае готовят десятикратные разведения вируссо­держащего материала (10^-1, 10^-2, 10^-3 и т.д.) и каждым разведением заражают равные группы культур клеток или куриных эмбрионов Подсчитывают количество бляшек или оспин, рассчитывают среднее арифметическое. Титр вируса находят, по формуле:

a₁ + a₂ + … +a_n

T = ------------------------------------

V ( n₁ + n₂ + … + n_n )

Но, в зависимости от вида объекта и характера его поражения, название эффективной дозы может изменяться. Если виру вызывает гибель зараженных лабораторных животных, титр обозначают символом ЛД₅₀ (летальная доза 50% использованных для заражения животных). Если же вирус вызывает только определенные признаки болезни, титр обозначают ИД₅₀ (инфекционная доза для 50% зараженных животных). При титровании в куриных эмбрионах и гибели их титр обозначают как ЭЛД₅₀ (эмбриональная летальная доза); при учете лишь патологоанатомических изменений в курином эмбрионе — ЭИД₅₀ (эмбрион-инфицирующая доза); в случае проявления ЦПД в культуре клеток — ТЦД₅₀ (тканевая цитопатическая доза).

Титр вируса выражают в количестве инфекционных доз приходящихся на единицу объема. Например, 10^3.48 ТЦД_50/0.2мл; 10^4.5 ЕИД_50/0.2мл; 10^7.45 ЛД_50/0.2 мл.

Титрование вирусов по 50%-му инфекционному действию - наиболее универсальный прием, пригодный практически для любого вируса, если подобрать к нему живую систему (тест-объект). Однако, этот метод довольно трудоемкий, длительный и требую статистических расчетов. В настоящем практикуме мы приводим два метода титрования вирусов по 50%-му эффекту.

1. Метод Рида и Менча основан на принципе кумуляции (накопления). Предполагается, что если чувствительные объекты погибают после заражения небольшими дозами вируса, они обязательно погибнут и при введении им более концентрированных и наоборот, объекты, остающиеся в живых после введения вируссодержащего материала в небольшом разведении, не погибнут, если их заразить этим же материалом в максимальном разведении. Принцип кумуляции позволяет искусственно увеличивать число исследуемых объектов и тем самым повысить точность эксперимента.

При определении титра вируса по Риду и Менчу поступают следующим образом. Из исследуемой суспензии готовят ряд последовательных десятикратных разведений вируссодержащего материала (10^-1, 10^-2, 10^-3, ..., 10^-10). Делают это по двум причинам: а) удобство в расчетах; б) инфекционное действие вируса убывает прямо пропорционально его разведению. Вируссодержащим материалом в каждом разведении заражают группу чувстви­тельных объектов (в каждой группе не менее 4-6) с целью удобст­ва статистической обработки. За зараженными объектами устанавливают регулярное (не реже одного раза в сутки) наблю­дение и фиксируют результат. Изменения в первые 48 ч после заражения трудно признать результатом действия вируса, особен­но в высоком разведении, их считают неспецифическими и в рас­чет не принимают.

В табл.5 представлена схема титрования вируса. Вируссо­держащий материал использован в 8 разведениях, каждым разве­дением заражено 4 животных (доза 0,2 мл).

При заражений вируссодержащим материалом в разведении 10^-7 не наблюдалось гибели животных, следовательно, леталь­ность здесь равна 0, и выживших мышей будет 4. Но к ним надо прибавить животных, оставшихся живыми после введения вирус­содержащего материала в разведениях 10^-6, 10^-5 и т.д. Таким образом, кумулятивное число выживших животных при зараже­нии вируссодержащим материалом в разведении 10^-7 окажется равным 12. Активностью вируссодержащего материала в разведе­нии 10^-8 пренебрегаем, так как эффект в данном случае аналогичен таковому при исследовании вируссодержащего мате­риала в разведении 10^-7.

Рассуждая подобным образом, находим значение кумуля­тивной летальности. Оно составляет при разведении вируссодер­жащего материала 10^-2 12 животных. Показания, полученные при использовании вируссодержащего материала в разведении 10^-1, по той же причине можно во внимание не принимать.

Вируссодержащий материал в разведении, давшем эффект выше 50%, обозначают буквой В, ниже 50% — буквой А, процент летальности соответственно — b и a. Расчет производят по формуле:

где В - доза вируса, дающая эффект более 50%; А — доза вируса, дающая эффект менее 50%; b, а — эффект дозы соответственно В и А, % ; d — интервал между двумя соседними дозами.