Тема 11. Использование в вирусологии культур клеток. Культивирование вирусов в культуре клеток

1. Подготовка куриных эмбрионов

а) овоскопирование

б) дезинфекция

в) извлечение, измельчение

г) промывание в растворе Хенкса.

2. Трипсинизацию проводят на магнитной мешалке в течение 10 минут подогретым до 35°С 0,25% раствором трипсина. Колбу помещают на тающий лед. Оставшиеся кусочки заливают новой порцией трипсина и трипсинизируют до истощения ткани.

3. Отделение клеток от трипсина.

Взвесь клеток в трипсине центрифугируют 10 минут при 1000 об/мин. Клеточный осадок ресуспендируют в небольшом количестве ростовой питательной среды.

4. Подсчет клеток.

Определяют количество клеток в 1 мл суспензии в камере Горяева. Считают клетки в 10 больших квадратах, среднее умножают на 22 000. Подсчет клеток необходим для того, чтобы получить хороший монослой. Для клеток куриного эмбриона оптимальная доза 250-500 тысяч клеток в 1 мл суспензии.

5. Посев клеток.

Вносят в каждую пробирку по 1 мл клеточной суспензии в ростовой среде. Пробирки закрывают резиновыми пробками, помещают на подставку под углом 5-7° и ставят в термостат при +37°.

Рост клеток будет заметен через 12-14 часов после посева, но хороший монослой образуется только через 2-3 дня. Ежедневно культуры просматривают под малым увеличением микроскопа для определения характера роста.

Метод холодной трипсинизации (рис. 28) используют для диспергирования тканей почек, полученных от поросят, телят, ягнят, кроликов, собак, хомяков, а также почек взрослых животных и других тканей. Метод включает следующие этапы:

а) корковый слой почки срезают и измельчают на кусочки размером 2 – 5 мм, ткань многократно (3–4 раза) промывают раствором Хенкса до полного освобождения от эритроцитов;

б) отмытые кусочки ткани переносят в трипсинизационную колбу и добав­ляют 0,25%-ный раствор трипсина, в котором перемешивают ткань 10 – 30 мин. После осаждения кусочков ткани надосадочную жидкость сливают и выбрасы­вают;

в) в колбу добавляют свежий раствор трипсина и помещают ее на магнитную мешалку. Скорость вращения регулируют так, чтобы не было разбрызгивания и вспенивания жидкости. Перемешивание продолжают в течение ночи (12–16 ч) при 4-6°С;

г) утром суспензию фильтруют через 2 – 3 слоя марли или сетку из нержаве­ющей стали в центрифужные флаконы;

д) клетки осаждают центрифугированием при 400 –600 об/мин 20 – 30 мин. Трипсин удаляют;

а) изучение техники получения первичных трипсинизированных культур по методике.

б) получение первично-трипсинизированных культур клеток из куриных эмбрионов.

Подведение итогов занятия.

Задание к следующему занятию.

Контрольные вопросы:

1. Методика получения первично трипсинизированных культур клеток по методу Дюльбекко и Фогт.

2. Сущность трипсинизации, техника проведения.

3. Для чего посуду закрывают резиновыми пробками.

.

Тема 12. Использование в вирусологии культур клеток. Заражение культур клеток. Индикация вируса

Цель занятия: ознакомление с методикой заражения клеточных культур вируса. Изучение методов индикации вирусов в культурах клеток.

Оборудование и материалы: микроскопы, культуры клеток с предыдущего занятия, фиксированные культуры клеток, фотографии, мультимедийное оборудование, презентации MS Office Power Point по теме занятия.
Методика проведения занятия и методические указания по теме.

Объяснение преподавателя.

12.1 Подбор культур клеток. Не всякая клетка чувствительна к любому вирусу. Вирус к первичной культуре обычно успешно адаптируется при условии, если культура получена из органов животного, естественно восприимчивого к данному вирусу. Однако адаптация вируса к перевиваемым клеткам более сложна, а в ряде случаев неосуществима. Для культивирования некоторых вирусов до сих пор неизвестно ни одной клеточной системы. Для культивирования вируса используют обычно молодые клетки, т. е. в первый день формирования монослоя, а в некоторых случаях (для парвовирусов свиней) клетки заражают при их посеве, так как вирус интенсивно размножается при наличии делящихся клеток (когда они находятся в стадии логарифмического роста).

12.2 Заражение клеток. Для этого отбирают пробирки (или матрасы) со сплошным клеточным монослоем, просматривая их под малым увеличением микроскопа. Ростовую питательную среду сливают, клетки 1–2 раза промывают раствором Хенкса, чтобы удалить сывороточные антитела и ингибиторы. В каждую пробирку вносят по 0,1–0,2 мл вируссодержащего материала и покачиванием распределяют его равномерно по слою клеток. В таком виде пробирки (матрасы) оставляют от 1 до 2 ч при 22 или 37 °С для адсорбции вируса на поверхности клеток. Затем вируссодержащий материал удаляют из пробирок (матрасов) и наливают поддерживающую среду (в пробирку 1–2 мл, в матрасы около 10 % его объема). При выделении вируса из патологического материала некоторые пробы (фекалий и др.) могут оказывать токсическое действие на клетки, поэтому после адсорбции вируса монослой клеток отмывают 1–2 раза раствором Хенкса (или питательной средой) и затем наливают поддерживающую среду.

Все пробирки выдерживают монослоем вниз 1-2 часа при комнатной температуре (для адсорбции вирусов на клетках).

На следующий день заменяют питательную среду. При необходимости ставят контроль на токсичность вируссодержащей суспензии.

Для каждой пробы материала обычно используют не менее 4–10 пробирок с культурой клеток. Для контроля оставляют 4–6 пробирок с незараженной культурой клеток, в которых заменяют ростовую среду на поддерживающую.

В культурах клеток, зараженных вирусом, питательную среду можно не менять в течение 7 дней, а рН среды (6,9–7,4) поддерживать с помощью 7,5%-ного раствора бикарбоната натрия. При более длительном культивировании инфицированных клеток (аденовирусы и др.) среду меняют.

Все пробирки (матрасы) после заражения клеток ежедневно исследуют под малым увеличением микроскопа, сравнивая культуры клеток, зараженные вирусом, с контрольными.

В термостате адсорбировавшиеся на клетках вирусные частицы проникают внутрь их и начинается их репродукция. Новые вирусные частицы покидают (полностью или частично) клетки, в которых они образовались, проникают в непораженные клетки, репродуцируются в них, переходят в новые клетки и поражают их. Так продолжается до тех пор, пока есть живые неповрежденные клетки. В результате этого процесса практически все клетки в матрасе или пробирке поражаются вирусом, хотя абсолютно все почти никогда не поражаются.

Вирус накапливается в основном в культуральном жидкости, но часть вирионов может оставаться и внутри не разрушенных вирусом клеток. Чтобы оставшийся в клетках вирус освободить, клетки тщательно разрушают или многократным замораживанием – оттаиванием (2–3 раза), или с помощью ультразвука.

12.4 Индикация (обнаружение) вируса в культуре клеток. Существуют следующие основные методы индикации вируса в культуре клеток: по цитопатическому эффекту или цитопатическому действию (ЦПЭ, ЦПД); по положительной реакции гемадсорбции (РГАд); по образованию бляшек; по обнаружению внутриклеточных включений; по выявлению вирусов в реакции иммунофлуоресценции (РИФ); по обнаружению интерференции вирусов; по подавлению метаболизма клеток (цветная проба); электронной микроскопией и др.

ЦПД. Наиболее широко и часто о размножении вируса в культуре клеток судят по цитопатическому эффекту или цитопатическому действию. ЦПД называются любые изменения клеток в культуре клеток под влиянием размножающегося в них вируса. Физиологические изменения клеток установить довольно сложно, а морфологические изменения обнаруживаются довольно легко. Для этого достаточно положить на предметный столик микроскопа пробирку или матрас слоем клеток вверх и, используя малое увеличение (объектив х8–10, окуляр х7–10), осмотреть слой. Полезно сравнить клетки, зараженные вирусом, с такими же клетками в пробирке, не подвергавшимися заражению. В этом случае практически любые наблюдаемые в микроскоп отличия зараженной культуры клеток от контрольной можно считать проявлением ЦПД. Эти отличия могут захватывать весь монослой или отмечаться только в виде небольших очажков измененных клеток в слое нормальных клеток. Интенсивность ЦПД выражается тем, какая часть клеточного монослоя изменена вирусом. Хотя общепринятой системы оценки интенсивности ЦПД нет, ее часто оценивают в крестах или баллах. Так, если изменению (по сравнению с контролем) подвергся весь монослой в пробирке или матрасе, ЦПД оценивают на четыре креста, если ³/₄– на три, если ¹/₂– на два креста, ¹/₄– на один крест. Но эти оценки весьма условны.

Наиболее существенно различаются между собой три формы ЦПД: фрагментация клеток, округление клеток, симпластообразование.

В зависимости от вируса и вида клеток расположение эритроцитов может быть трояким:

– эритроциты адсорбированы только по периферии клеточного пласта в виде «ожерелья» (вирус африканской чумы свиней);

– эритроциты расположены на слое клеток очагами или скоплениями (вирус гриппа);

– эритроциты расположены на слое клеток диффузно (вирус парагриппа).

Каждый вирус способен адсорбировать эритроциты крови животных определенных видов.

1) Студенты проводят микроскопию клеточных культур (живая культура клеток, фиксированная).

2) Изучают методы обнаружения вирусов в зараженных клеточных культурах (по ЦПД, по гемадсорбции эритроцитов на монослое, по обнаружению бляшек, по обнаружению телец-включений).

Метод образования бляшек. Этот метод обнаружения вирусов технически сложнее других и применяется главным образом для титрования вирусов.

Дальбекко и Фогт в 1954 г. впервые предложили методику получения бляшек под агаром в культуре куриных фибробластов с вирусом западного лошадиного энцефаломиелита. В последующие годы многие авторы с успехом применяли этот метод при изучении различных вирусов – ящура, везикулярного стоматита, ньюкаслской болезни, чумы птиц, полиомиелита, Коксаки и др. Метод бляшек стали широко применять в вирусологии для получения чистых популяций вируса, особенно при изучении их генетических свойств. Методику получения бляшек, предложенную Дальбекко и Фогт, модифицировали, и в настоящее время есть целый ряд отличных друг от друга методов, связанных с изучением различных вирусов.

Метод бляшек основан на образовании вирусом в однослойных культурах, залитых агаровой средой, содержащей витальный краситель – нейтральрот, негативных колоний или бляшек.

Бляшки представляют собой обесцвеченные участки культуры, состоящие из погибших под действием вируса клеток. Кроме агара в целях предотвращения переноса вируса на другие места можно использовать крахмал и метилцеллюлозу. Некоторые вирусы дают бляшки без покрытия слоем агара, например вирус чумы крупного рогатого скота, осповакцины, некоторые представители вирусов герпеса и др. На клетки, промытые средой или раствором Хенкса, наносят вирус в определенных разведениях и обеспечивают контакт вируса с клетками при периодическом покачивании в точно установленный отрезок времени (1–2 ч) при 37–38 °С. Неадсорбировавшийся вирус удаляют путем промывания раствором Хенкса или отсасывают пастеровской пипеткой, затем на слой клеток наносят специальное агаровое покрытие. Выбор среды покрытия определяется видом клеток и вируса.

После застывания (30–60 мин) с поверхности агара сливают конденсированную влагу, флаконы переносят в термостат и инкубируют клетками вверх. Время инкубации и температура должны быть оптимальными для бляшкообразования, вызываемого данным вирусом. Наблюдение за появлением бляшек проводят в течение нескольких дней. За это время вирусы, адсорбировавшиеся на клетках, проникают в последние, проходят цикл репродукции, выходят из клеток и поражают соседние клетки. В сплошном слое живых клеток возникают островки мертвых, погибших вследствие репродукции в них вируса клеток. Раствор красителя окрашивает только живые клетки. Поэтому в матрасе на ровном красновато-розовом фоне появляются бесцветные пятна, которые и называются негативными пятнами Дальбекко или бляшками. Каждая бляшка соответствует островку мертвых клеток.

Цветная проба. Цветную пробу для лабораторных исследований впервые предложили Солк, Янгнер и Уорд в 1954 г. Предпосылкой для разработки данного метода явились наблюдения Эндерса, Уэллера и Роббинса, которые отметили, что в незаряженных тканевых культурах под влиянием продуктов метаболизма рН среды сдвигается в кислую сторону, что улавливается по пожелтению фенолрота, добавленного в питательную среду. В то же время жидкость в тканевых культурах, зараженных вирусом, убивающим живые клетки, сохраняла свой красный цвет.

Наиболее отчетливые результаты дают вирусы с высокой скоростью размножения при культивировании их на медленнорастущих клетках.

Так как метод цветной пробы не отличается высокой достоверностью, его в практике используют редко.

Обнаружение внутриклеточных включений. При многих вирусных заболеваниях в клетках (в цитоплазме или ядре) различных органов и тканей появляются особые образования, называемые тельцами-включениями. Их классифицируют по локализации в клетке, составу нуклеиновой кислоты, тинкториальным свойствам и гомогенности. Вирусные тельца-включения хорошо обнаруживаются в препаратах, окрашенных гематоксилин-эозином. Для этого фиксированные на покровных стеклах клетки промывают в дистиллированной воде и погружают на 5–15 мин в раствор гематоксилина (гематоксилин Майера, Эрлиха, Карацци и др.).

Обнаружение вирусов в реакции иммунофлуоресценции. В том случае, если размножение вируса в культуре клеток не сопровождается цитопатическим эффектом, гемадсорбцией, его присутствие можно обнаружить с помощью флуоресцирующих антител. Этот метод широко используют при диагностике классической чумы свиней, парвовирусной инфекции свиней и других болезней.

Обнаружение вирусов с помощью иммунопероксидазной реакции (иммуноферментного анализа). Методика изложена в специальном разделе

Обнаружение вирусов с помощью электронного микроскопа. Методика изложена в специальном разделе.

Метод, основанный на интерференции вирусов. Построен на том, что некоторые вирусы в культуре клеток снижают способность размножаться в ней других вирусов. Например, вирус чумы свиней снижает инфекционную активность вируса ящура, вирус ньюкаслской болезни – вируса везикулярного стоматита и т. д.
Подведение итогов занятия.

Задание к следующему занятию.

Контрольные вопросы:

1. Методы индикации вирусов в зараженных клеточных культурах.

2. ЦПД, классификация.

3. Технику заражения клеточных культур.

4. Индикацию вирусов методом бляшек.

5. Сущность реакции гемадсорбции.

Антитела могут взаимодействовать с гомологичными антигенами не только m vivo, но и in vitro.

Обычно источником антител служит сыворотка крови (serum), и поэтому реакции взаимодействия антител с антигенами in vitro называются серологическими. Одной из простейших серологических реакций является реакция торможения (задержки) гемагглютинации (РТГА, РТЗА). Она основана на том, что антитела при встрече с гомологичным вирусом (антигеном) нейтрализуют не только его инфекционную, но и гемагглютинирующую активность, так как блокируют рецепторы вирионов, ответственные за гемагглютинацию, образуя с ними комплекс антиген + антитело.

13.2 Принцип РТГА состоит в том, что в пробирке смешивают равные объемы сыворотки крови и суспензии вируса и после экспозиции определяют, сохранился ли в смеси вирус, путем добавления суспензии эритроцитов. Агглютинация эритроцитов указывает на наличие, а отсутствие гемагглютинации – на отсутствие вируса в смеси. Исчезновение вируса из смеси вирус + сыворотка расценивается как признак взаимодействия антител сыворотки и вируса.

Но антитела с антигенами взаимодействуют в строго определенных количественных соотношениях. Поэтому, для того чтобы определенное количество вируса было лишено гемагглютинирующей способности, требуется определенный минимум антител, а так как один из компонентов РТГА всегда неизвестен, приходится реакцию ставить в ряду пробирок с различными дозами антител и одинаковыми дозами вируса или наоборот. Это достигается тем, что берут или разные разведения сыворотки и одно и то же разведение вируса, или разные разведения вируса и одно и то же разведение сыворотки.

РТГА позволяет решать следующие задачи: определять титр антител к гемагглютинирующему вирусу в сыворотке; идентифицировать неизвестный гемагглютинирующий вирус по известным сывороткам; установить степень антигенного родства двух вирусов.

Достоинства РТГА: простота техники, быстрота, не требуется стерильной работы, специфичность, дешевизна. Недостаток: РТГА возможна только с гемагглютинирующими вирусами.

Принцип титрования антител в РТГА состоит в следующем:

– готовят ряд последовательных (обычно 2-кратных) разведений исследуемой сыворотки в одинаковых объемах (чаще по 0,25 или 0,2 мл);

– к каждому разведению добавляют такие же объемы гомологичного вируса в титре 4 ГАЕ;

– смеси выдерживают определенное время при определенной температуре (для вируса ньюкаслской болезни 40–60 мин при комнатной температуре);

– ко всем смесям добавляют равные объемы 1%-ной суспензии отмытых эритроцитов;

– после экспозиции оценивают гемагглютинацию в каждой смеси в крестах.

В реакции предусматриваются контроли сыворотки, вируса и эритроцитов.

То наивысшее разведение сыворотки, которое еще полностью тормозит гемагглютинацию, принимается за показатель титра антител в этой сыворотке.

Определить в РТГА титр антител к вирусу ньюкаслской болезни в сыворотке крови кролика.

1. Что такое антигены и антитела?

2. Что такое серологические реакции и для чего они используются?

3. В чем принцип и использование РТГА?

4. Что вы знаете о модификации РТГА?