Учебно-методическое пособие к лабораторным работам по общей химии ставрополь 2005 (07. 07)

Ингибиторы нашли широкое применение в этимологии при исследовании природы множественных форм ферментов и изоферментов, отличающихся не столько электрофоретической подвижностью, сколько различием реакций на один и тот же ингибитор.

При помощи ингибиторов, избирательно включающихся в отдельные стадии многоступенчатого метаболического процесса, могут быть точно установлены последовательность химических реакций и природа участвующих ферментов. В частности, этим путем при применении йодацетата, фторида и др. ингибиторов был расшифрован гликолитический путь окислительно-восстановительных превращений глюкозы до молочной кислоты в мышечной ткани, насчитывающий 11 стадий с участием 11 ферментов и 10 промежуточных метаболитов. На ингибировании ферментов основан механизм действия многих токсинов и ядов на организм. Так, известно, что при отравлениях синильной кислотой смерть наступает вследствие полного торможения дыхательных ферментов (цитохромоксидазы), в особенности клеток мозга. Токсическое влияние на организм человека и животных некоторых инсектицидов обусловлено торможением активности холинэстеразы - фермента, играющего первостепенную роль в деятельности нервной системы. Рациональная химиотерапия - осознанное применение лекарственных препаратов в медицине. Она должна опираться на точное знание механизма их действия на биосинтез ферментов. Иногда метод лечения болезней человека включает применение избирательных ингибиторов. Так, ингибитор трипсина и хемотрипсина, трасилол широко используется при лечении острого панкреатита. Избирательное ингибирование ферментов некоторых природных и синтетических соединений (так называемых антиметаболитов) в настоящее время служат основой для разработки эффективных методов синтеза химиотерапевтических препаратов. Обычно различают обратимое и необратимое ингибирование. Если молекула ингибитора вызывает стойкие изменения или модификацию функциональных

групп фермента, то такой тип ингибирования называется необратимым.

Чаще, однако, имеет место обратимое ингибирование, поддающееся коли­чественному изучению на основе уравнения Михаэлиса-Ментен. Обратимое ин­гибирование в свою очередь разделяют на конкурентное и неконкурентное, в зависимости от того, удается или не удается преодолеть торможение фермента­тивной реакции путем увеличения концентрации субстрата. Во втором случае повышение концентрации субстрата не изменяет степень ингибирования фер­мента.

Конкурентное ингибирование может быть вызвано веществами, имеющи­ми структуру, похожую на субстрат, но немного отличающуюся. Так, торможе­ние активности сукцинатдегидрогеназы малоновой кислотой, является приме­ром такого ингибирования. Этот фермент катализирует окисление путем дегид­рирования янтарной кислоты в фумаровую в соответствии со схемой (рис. 12).

Если в среду добавить малоновую кислоту (ингибитор), то в силу структурного сходства ее с истинным субстратом - янтарной кислотой (наличие двух таких же ионизированных карбоксильных групп), она будет реагировать с активным центром с образованием фермент-ингибиторного комплекса (рис. 13). Однако при этом перенос водорода от малоната не происходит. Так как структуры субстрата - янтарной кислоты и ингибитора - малоната все же несколько сближаются, они конкурируют за связывание с активным центром, и степень торможения будет определяться соотношением концентраций малоната и сукцината, а не абсолютной концентрацией ингибитора.

Метод конкурентного торможения нашел широкое применение в меди­цинской практике. Известно, например, что для лечения некоторых инфекционных заболеваний, вызываемых бактериями, применяют сульфаниламидные препа­раты. Оказалось, что эти препараты имеют структурное сходство с параамино-бензойной кислотой, которую бактериальная клетка использует для синтеза фолиевой кислоты, являющейся составной частью ферментов бактерий. Благодаря этому структурному сходству сульфаниламид, например, блокирует действие фермента путем вытеснения парааминобензойной кислоты из комплекса с ферментом, синтезирующим фолиевую кислоту, что ведет к торможению роста бактерий.

-оос

_D

СИ

-оос

В пробирку собрать 1 мл слюны (ротовую полость предварительно ополоснуть чистой водой). Разбавить ее 4 мл дистиллированной воды и внести 1 мл крахмала. Тщательно перемешать и поставить пробирку на водяную баню с t = 40-45°С на 15-20 минут. Далее в пробирку внести 2 мл фелинговой жидкости (по 1 мл Фелинг 1 и Фелинг 2) и нагреть до кипения.

Объяснить механизм процесса и положительный результат фелинговой пробы. В выводе сопоставить результаты работ 3.1.1. и 3.1.2.

(С₆Н₁₀О₅)_п (крахмал) + пН₂0 —> пС₆Н₁₂0₆ (глюкоза).

Сделайте общий вывод по обоим опытам: сравните действие неорганических и биологических катализаторов.

3.2. Термолабильность ферментов

Слюну разводят в 5 раз (к 1 мл собранной слюны добавляют 4 мл дистиллированной воды и перемешивают). В чистую пробирку отливают 2-3 мл разведенной слюны и кипятят ее в течение 5-8 минут, после чего охлаждают.

В 3 пробирки наливают по 10 капель 1% раствора крахмала. В 1 пробирку добавляют 10 капель слюны, разведенной в 5 раз, во вторую - 10 капель прокипяченной слюны, в 3 пробирку - 10 капель дистиллированной воды (в качестве контроля).

Все пробирки нумеруют и помещают в термостат или водяную баню с t=38°C на 10 минут. После этого содержимое пробирки делят на 2 части и проделывают качественные реакции на крахмал (с йодом) и на продукты расщепления (реакция Троммера).

Полученные данные занести в таблицу, и сделать вывод: какая температура является оптимальной для амилазы слюны.

Таблица № 5

№

Субстрат

Фермент

Темпе­ратура

Реакция на крахмал (цвет)

Реакция Троммера

Выводы

Приложение

Реакция Троммера: (реакция медного зеркала) - качественная реакция на альдегидную группу. Ее дают моносахариды, дисахариды, имеющие альдегидную группу. Эти продукты образуются при действии амилазы на крахмал.

Уравнение реакции: СН₂ОН-(СНОН)₄- СНО+Си(ОН)₂^ СН₂ОН- (СНОН)₄- СООН+CuOHl +н₂о Гидроксид меди (I) СиОН - осадок желтого цвета.

2СиОН —> Си₂0 (кирпично-красного цвета) + Н₂0. Недостаток реакции Троммера: нельзя добавлять избыток гидоксида меди (II), так как в этом случае при нагревании может образоваться оксид меди (II) черного цвета, который затушует кирпично-красное окрашивание: Cu(OH)₂ -> CuOl (черного цвета) + Н₂0.

3.3. Специфичность ферментов

В две пробирки приливают по пять капель слюны, разведенной в пять раз (приготовление см. в работе 3.2.). В первую пробирку добавляют десять капель 1%-ного раствора сахарозы, во вторую пробирку десять капель крахмала. Обе пробирки помещают на десять минут в термостат или водяную баню при темпе­ратуре 38 С, после чего в обеих пробирках проделывают реакцию Троммера на углеводы (см. предыдущую работу). Результаты опыта заносят в таблицу, делают вывод о специфичности амилазы слюны.

1. 
   Дайте понятия катализа, видов катализа, теорий катализа.
   
2. 
   Приведите строение ферментов, дайте понятие "активных центров" био­катализаторов.
   
3. 
   Укажите особенности ферментативного катализа. Изложите гипотезу Фи­шера.
   
4. 
   Что подразумевается под удельной активностью фермента? Приведите единицу активности.
   
5. 
   От каких факторов зависит скорость ферментативных реакций?
   
6. 
   Напишите уравнения Михаэлиса-Ментен и Бриггса-Холдейна.
   
7. 
   За счет чего с термодинамической точки зрения ферменты ускоряют про­цесс?
   
8. 
   Как проявляется термолабильность ферментов?
   
9. 
   Какова зависимость активности ферментов от рН среды? Как выглядит графическая кривая этой зависимости?
   

10. 
    Укажите роль активации и ингибирования в ферментативных процессах?
    
11. 
    Как используется метод конкурентного торможения в медицинской прак­тике?
    
12. 
    Напишите уравнения реакций действия каталазы на субстрат Н₂0₂ в кро­ви по стадиям. Укажите стадию, определяющую порядок реакции. Запишите ки­нетическое уравнение.
    

чий в коллигативных свойствах, зависящих от числа кинетических единиц в растворе; представления о законах, описывающих эти явления (Рауля, Вант-Гоффа, Сеченова), с необходимостью их использования в биологических про­цессах и медико-биологических исследованиях.

2.1. Коллигативные свойства растворов слабых электролитов.

1. 
   Закон Рауля и его следствия.
   
2. 
   Диффузия, осмос, осмотическое давление, законы Фика и Вант-Гоффа.
   

1. 
   Закон разведения Оствальда.
   
2. 
   Изотонический коэффициент. Теория Дебая-Хюккеля. Активность, коэффициент активности. Ионная сила.
   

1. 
   Изоосмия, осмолярность, осмоляльность.
   
2. 
   Роль осмоса в биологических системах. Плазмолиз и деплазмолиз. Контроль на входе: фронтальный опрос (устно), решение задач, тестовый (письменно).
   

1. 
   Наблюдение явления осмоса (демонстрационная работа).
   
2. 
   Рост искусственной клетки Траубе.
   
3. 
   Гемолиз и плазмолиз эритроцитов.
   

1. Общая химия. Биофизическая химия. Химия биогенных элементов: Учеб. для мед. спец. вузов. / Ю. А. Ершов, В. А. Попков, А. С. Берлянд и др. Под ред. Ю. А. Ершова-М.: Высшая школа, 2003. Гл. 2, 3, с. 61-95.

Основные законы и соотношения теории растворов строго соблюдаются лишь для модельных систем, называемых идеальными растворами.

Реальные растворы не являются идеальными и в своем поведении могут лишь приближаться к модели идеального раствора, например, разбавленные ра­створы неэлекролитов. В таких растворах концентрация растворенного вещества чрезвычайно мала, и молекулы находятся на относительно большом расстоянии, и их взаимное влияние можно исключить. Только для таких, очень разбавленных растворов, удалось вывести количественное соотношение между свойствами растворов и их концентрацией.

Свойства растворов, зависящие от концентрации кинетически самостоя­тельных единиц и независящие от их природы, называют коллигативными.

Основным из них является понижение давления насыщенного пара раство­рителя над раствором, описываемое законом Рауля. Остальные свойства, а имен­но: повышение температуры кипения и понижение температуры замерзания ра­створов, явления диффузии, осмоса и осмотического давления вытекают из него как прямое следствие.

Самопроизвольный процесс переноса вещества, в результате которого ус­танавливается равновесие и распределение концентраций вследствие беспоря­дочного теплового движения молекул, атомов, ионов в газах, жидкостях или твер­дых телах, называется диффузией.

С точки зрения термодинамики причиной этого процесса является переме­щение вещества от более высокого химического потенциала к низкому, т. е. mfcj) >m(c₂), при с^с^

При условии равенства концентраций во всех точках пространства явление диффузии прекращается. При этом химические потенциалы становятся одинако­

выми.

Диффузия играет важную роль в биологических системах. Всякая живая клетка окружена мембраной, которая служит для защиты и регуляции внутрикле­точной среды. Вещества проходят через мембраны по двум основным механиз­мам: путем обычной диффузии, не связанной с затратой химической энергии -пассивный транспорт и за счет энергетически активированного переноса на ос­нове гидролиза АТФ или переноса электронов по дыхательной цепи митохонд­рий, что подразумевает активный транспорт.

Для описания диффузии веществ через клеточные мембраны пользуются не математическим выражением закона Фика: An/At = -DS• (Ас/Ах), а более простым уравнением (т. к. концентрационный градиент (Ас/Ах) клеточной мембраны определить трудно):

Am/At = -PS(C_rC₂), [1] где С и С₂ - концентрации по разные стороны мембраны; Р - коэффициент проницаемости, зависящий от свойств мембраны.

Диффузия может происходить также, если на границе раствора и чистого растворителя (или двух растворов различной концентрации) поместить полупроницаемую мембрану, способную пропускать только молекулы растворителя. Свойствами полупроницаемых мембран обладают многие природные пленки (стенки кишечника, протоплазма и др.)

Явление преимущественно одностороннего проникновения растворителя (диффузию) через полупроницаемую мембрану из растворителя в раствор или из раствора с меньшей концентрацией в раствор с большей концентрацией называется осмосом.

С точки зрения термодинамики движущей силой осмоса является стремление системы к выравниванию концентраций; так как при этом энтропия системы возрастает (DS>0), энергия Гиббса системы (DG) соответственно уменьшается, химические потенциалы выравниваются. Поэтому осмос можно представить как направленный самопроизвольный проход молекул растворителя через мембрану, разделяющую растворы с различными значениями химического потенциала растворителя.

Осмос можно наблюдать в специальных приборах - осмометрах (рис. 14, с. 68). Основной его деталью является осмометрическая ячейка (1), отделенная от сосуда (4) с чистым растворителем полупроницаемой мембраной (2), пропуска­ющей только молекулы растворителя. Ячейку с концентрированным раствором

погружают в сосуд с растворителем - менее концентрированным раствором. В начальный момент времени химический потенциал воды во внутреннем сосуде осмометра меньше химического потенциала воды во внешнем сосуде. По исте­чении некоторого времени часть воды перешла во внутренний сосуд; разность химических потенциалов воды в системах, разделенных мембраной, уменьши­лась. Вода проникает через перегородку, оказывая на нее определенное давление - осмотическое давление. Процесс переноса молекул воды будет продолжаться до тех пор, пока гидростатическое давление не уравновесит осмотическое. Осмо­тическое давление можно определить, измерив гидростатическое давление стол­бика воды в трубке (3):

p = h*r,

где р - осмотическое давление; h - высота подъема жидкости; г - плотность раствора.

Таким образом, осмотическое давление численно равно силе, приходящейся на еди­ницу поверхности, которую нужно приложить к поверхности полупроницаемой мембраны, чтобы предотвратить проникновение молекул воды в раствор с меньшим ее химическим по­тенциалом.

Несмотря на различный механизм воз­никновения осмотического и газового давле­ния, Вант-Гофф установил, что осмотическое давление сильно разбавленных ра­створов подчиняется законам идеальных газов, причем тем точнее, чем ниже концентрация растворенного вещества.

Закон Вант-Гоффа гласит: "Осмотическое давление разбавленного раство­ра равно давлению, которое проявляло бы растворенное вещество, если бы оно было газообразным и занимало объем, равный объему раствора". Уравнение для описания осмотического давления для растворов неэлектролитов можно за­писать так:

p = (m/MV)-RT = C-RT, [2]

где р - осмотическое давление, кПа;

С - молярная концентрация, моль/л;

R - универсальная газовая постоянная, равная 8,31 (кПа-л)/(моль-К); Т - абсолютная температура, К.

Таким образом, для осмотического давления в истинных растворах низко­молекулярных веществ имеет значение только число растворенных частиц, а не их масса, размеры и форма.

Опыт показал, что у растворов, проводящих электрический ток (электроли­ты), более высокое, чем по закону Вант-Гоффа, осмотическое давление, они ки­пят при более высокой температуре и замерзают при более низкой, чем это сле­дует из закона Рауля. Существенным является тот факт, что концентрация кинети­чески самостоятельных частиц в растворах электролитов всегда больше, чем это следует из аналитической концентрации. С тем, чтобы свойства растворов элект­ролитов удовлетворительно описывались уравнениями, выражающими следствие из закона Рауля, Вант-Гоффом был введен поправочный эмпирический коэффи­циент, называемый сейчас изотоническим или коэффициентом Вант-Гоффа (i):

p=iCRT, [3]

Изотонический коэффициент находят как отношение между наблюдаемы­ми для электролитов (опытными) и вычисляемыми для неэлектролитов (расчет­ными) значениями следующих величин:

i = p /р = DT /DT = DT /DT [4]

опыт. расч. зам.опыт. зам.расч. кип.опыт. кип.расч. ^{L J}

Коэффициент Вант-Гоффа учитывает ионизацию веществ и взаимодействие ионов и молекул в растворе. Значение i для раствора данного электролита увели­чивается по мере разбавления, стремясь в пределе к целому значению, равному числу ионов, возникающих при диссоциации структурной единицы электролита.

Для неэлектролитов, растворенных в воде, i равно 1 (i =1).

Для сильных электролитов i=v, где v число ионов, которое образуется при диссоциации.

Например, для раствора натрия хлорида i->2, так как NaCl^Na⁺+Cl~ и

2+

v=2; изотонический коэффициент кальция хлорида i -> 3, так как СаС1₂^ Са +2С Г и v=3. Если соль подвергается гидролизу, то часть ионов взаимодействует с во­дой и i^v. В этом случае неободимо учитывать степень гидролиза соли.

Для слабых электролитов, ионизирующих в одну ступень, связь изотони­ческого коэффициента с а выражается уравнением:

i = l+a(n-l). [5]

Итак, несмотря на практически полную ионизацию, опытные значения ос­мотического давления, понижения температуры замерзания и повышения тем­пературы кипения у растворов сильных электролитов меньше, чем значение ве­личин, полученные для 100% ионизации.

В 1923 году Дебай и Хюккель выдвинули теорию, согласно которой в растворах сильных электролитов каждый ион окружен со всех сторон ионами противоположенного знака, вследствие чего движение ионов ограничено. Ионы сильного электролита в растворе взаимодействуют между собой благодаря наличию значительных электростатических сил, в результате чего ионы одного знака образуют вокруг иона другого знака так называемую ионную атмосферу. Необходимо также учитывать сольватацию ионов. Ионная атмосфера и сольватная оболочка замедляют движение ионов в растворе и являются причиной кажущейся неполной ионизации. Кроме того, в растворах сильных электролитов при высоких концентрациях может происходить ассоциация ионов. Для учета этих влияний состав растворов электролитов следует характеризовать не аналитической концентрацией, а эффективной концентрацией, называемой активностью (Льюис, 1907).

Между активностью и аналитической концентацией ионов существует связь:

a = f-C, [6]

где f - коэффициент активности, зависящий от концентрации (обычно f < 1); а - активность, моль/л; С - концентрация электролита, моль/л.

В разбавленных растворах сильных электролитов f = 1, тогда а = с.

Активность иона зависит от напряженности существующего в растворе электрического поля, которое количественно характеризуется ионной силой ра­створа I:

1 = 0,5£С-2²., [7]

где с_{ - молярная концентрация иона в растворе, моль/л; Z - заряд иона.

Ионная сила - величина аддитивная: каждый электролит вносит свой вклад в величину I независимо от других. Для разбавленных растворов коэффициент активности можно рассчитать по уравнению Дебая-Хюккеля:

\gf=-0,5z²^I [8]

Поскольку в растворах слабых электролитов ионная сила низкая, для них, как и для разбавленных расторов сильных электролитов, а^с.

Все биологические жидкости представляют собой водные растворы с боль­шим значением ионной силы, которая создается сильными электролитами.