Составить отчет по проведенной работе

1. 
   На чем основан принцип метода гельпроникающей хроматографии?
   
2. 
   Какие гели применяются для гель-фильтации?
   
3. 
   Каковы основные параметры гель-фильтрационной колонки?
   
4. 
   Перечислите основные этапы гель-фильтрации белков.
   
5. 
   Какие операции нужно совершить после прохождения гель-фильтрации для получения результатов и их оформления?
   

Разделение белков на основе их различной растворимости является классическим биохимическим методом. Так фракционирование солями основывается на избирательном разделении белков вследствие их различной растворимости в растворах солей. Соль подбирается в соответствии со следующими требованиями: она должна обладать достаточной растворимостью, которая не меняется значительно в зависимости от температуры, при добавлении соли не должен заметно меняться рН раствора, она легко отделяется от белка и не оказывает денатурирующего действия. Наиболее часто употребляемой солью для фракционирования белков является сульфат аммония. Обычно проводят фракционное осаждение белков возрастающими концентрациями сульфата аммония.

При описании методов выделения количество сульфата аммония выражают в процентах насыщения и часто употребляют выражения вроде "фракция, осажденная между 55 и 60% насыщения". Правильно рассчитать количество соли, которое нужно добавить к данному объему раствора, чтобы получить указанный процент насыщения, не простое дело. Поскольку при растворении соли меняется объем жидкости, количество соли, которое нужно добавить к данному объему жидкости, не пропорционально требуемому проценту насыщения. Обычно пользуются специальной номограммой, с помощью которой можно определить количество соли, необходимое для перехода от одной степени насыщения к другой, или расчетными таблицами.

Высаливание при добавлении необходимого количества сульфата аммония для осаждения всех белков является эффективным способом концентрирования, при условии, что образец, который нужно сконцентрировать, не слишком разбавлен. Для получения раствора, приблизительно 85%-ного насыщения удобно растворить 60 г сульфата аммония в 100 мл. При такой концентрации немногие белки имеют растворимость выше 1 мг/мл. Но если исходная концентрация белка в растворе ниже 1 мг/мл, то перед высаливанием следует повысить ее.

Осаждение белков органическими растворителями также важную роль при фракционировании белковых экстрактов. Чаще всего используют такие растворители как этанол и ацетон, реже - изопропанол, метанол, диоксан. Основной механизм процесса: по мере возрастания концентрации органического растворителя снижается способность воды к сольватации заряженных гидрофильных молекул фермента. Происходит снижение растворимости белков до уровня, при котором начинается агрегация и осаждение.

Важным параметром, влияющим на осаждение, является размер молекулы белка. Чем больше молекула, тем ниже концентрация органического растворителя, вызывающая осаждение белка. Используемый растворитель должен полностью смешиваться с водой, не реагировать с белками и обладать хорошим осаждающим действием. Одно из преимуществ фракционирования с помощью органических растворителей заключается в том, что его можно проводить при температуре ниже нуля, так как все смешивающиеся с водой растворители образуют смеси, замерзающие при температуре значительно ниже 0°С. Это очень важное свойство, так как в ходе фракционирования необходимо поддерживать низкую температуру.

провести высаливание белков сыворотки крови сульфатом аммония;

провести разделение белков сыворотки крови путем осаждения сульфатом аммония и этанолом;

проанализировать на наличие белка полученные фракции;

1. 
   Сухой порошок сульфата аммония (NH₄)₂SO₄
   
2. 
   Насыщенный раствор сульфата аммония.
   
3. 
   10 % NaOH.
   
4. 
   1% CuSO₄.
   
5. 
   Дистиллированный этиловый спирт.
   
6. 
   3М ацетат натрия (СH₃COONa).
   

1. 
   Спектрофотометр SmartSpec Plus Вio-Rad.
   
2. 
   Перистальтический насос ЛАБ-НП-1.
   

1. 
   К 2 мл сыворотки крови с помощью перистальтического насоса добавить 2 мл насыщенного раствора (NH₄)₂SO₄. При получившемся 50 %-ном насыщении сульфатом аммония в осадок выпадут глобулины сыворотки.
   
2. 
   Через 15 минут осадок отфильтровать. Белок с фильтра смыть дистиллированной водой (10 мл) в отдельную пробирку (фракция 1).
   
3. 
   К фильтрату добавить сухой порошок (NH₄)₂SO₄ до полного насыщения. При этом альбумины сыворотки крови начнут выпадать в осадок.
   
4. 
   Через 15 минут осадок (альбуминовую фракцию) отфильтровать. Белок с фильтра смыть дистиллированной водой (10 мл) в отдельную пробирку (фракция 2).
   
5. 
   В фильтрат от альбуминовой фракции добавить 10 мл дистиллированной воды и поместить в отдельную пробирку (фракция 3).
   
6. 
   С содержимым всех трех пробирок провести биуретовую реакцию на белок (биуретовый реактив приготовить, смешивая 10 % NaOH и 1% CuSO₄ в соотношении 10:1).
   
7. 
   Определить концентрацию белка в разных фракциях.
   
8. 
   Записать полученные результаты.
   

1. 
   К 6,3 мл сыворотки крови с помощью перистальтического насоса добавить 2,7 мл дистиллированного спирта (содержащего 96 % этанола), охлажденного до -10⁰С. Полученный раствор охладить до -5⁰С. При получившемся 25 %-ном содержании этанола в осадок выпадут глобулины сыворотки.
   
2. 
   Через 15 минут осадок отфильтровать. Белок с фильтра смыть дистиллированной водой (10 мл) в отдельную пробирку (фракция 1).
   

3. 
   Довести рН фильтрата до 4,8 путем добавления 3 М ацетата натрия (рН 4). Затем добавить к фильтрату охлажденный до -10⁰С дистиллированный спирт (96 % этанола) до концентрации 42%. Полученный раствор охладить до -5⁰С.
   
4. 
   Через 15 минут осадок (альбуминовую фракцию) отфильтровать. Белок с фильтра смыть дистиллированной водой (10 мл) в отдельную пробирку (фракция 2).
   
5. 
   В фильтрат от альбуминовой фракции добавить 10 мл дистиллированной воды и поместить в отдельную пробирку (фракция 3).
   
6. 
   С содержимым всех трех пробирок провести биуретовую реакцию на белок.
   
7. 
   Определить концентрацию белка в разных фракциях.
   
8. 
   Записать полученные результаты.
   

1. 
   На чем основано разделение белков путем их осаждения?
   
2. 
   Какие реактивы применяют для разделения белков путем их осаждения?
   
3. 
   На чем основан принцип фракционирования белков сульфатом аммония
   
4. 
   Перечислите достоинства и недостатки разных способов разделения белков путем их осаждения.
   
5. 
   Каковы основные этапы фракционирования белков сыворотки крови сульфатом аммония?
   
6. 
   Перечислите основные этапы фракционирования белков сыворотки крови этанолом.
   
7. 
   Какие операции нужно совершить после фракционирования белков сыворотки крови для получения результатов и их оформления?
   

Электрофорез относится к биохимическим методам, применяемым для разделения молекул ДНК по размерам. В начале 70-х годов было показано, что с помощью гель-электрофореза можно определить длину и чистоту молекул ДНК. Этот метод прост, так как каждый нуклеотид в молекуле нуклеиновой кислоты обладает отрицательным зарядом, который под действием приложенного электрического поля заставляет молекулы двигаться к положительному электроду. Чтобы разделить молекулы ДНК, исходя из их размера, электрофорез проводят в гелях. Были разработаны специальные гели, с помощью которых удается разделить фрагменты ДНК длиной до 500 нуклеотидов, отличающиеся всего лишь на несколько нуклеотидов.

Поскольку поры в полиакриламидном геле для больших молекул ДНК слишком малы, то для разделения молекул ДНК по размеру были разработаны специальные гели на основе агарозы (полисахарида, выделяемого из морских водорослей). Оба эти метода разделения ДНК широко используются для аналитических и препаративных целей.

В 80-х годах была предложена модификация гель-электрофореза в агарозном геле, названная электрофорезом в пульсирующем электрическом поле или пульс-электрофорез. С ее помощью удается разделять очень большие молекулы ДНК. Обычный гель-электрофорез не позволяет разделить молекулы размером более 20000 пар оснований ввиду постоянства электрического поля, которое придает молекулам змеевидную конфигурацию. Обладающие такой конфигурацией молекулы движутся в гелях с постоянной скоростью вне зависимости от длины молекул. Если же направление электрического поля будет часто меняться, скорость движения молекул будет определяться их способностью переориентировываться согласно этому изменению. Такой процесс у больших молекул занимает значительно больше времени, вследствие чего они будут отставать. Электрофорез проводится в камере, заполненной буферным раствором. Буфер необходим для повышения ионной силы раствора, в котором будет происходить разделение молекул ДНК. Он же используется для приготовления агарозного геля.

Электрофорез в агарозном геле – стандартный метод, используемый для разделения, идентификации и очистки фрагментов ДНК. С помощью этой простой техники можно быстро разделить такие смеси фрагментов ДНК, которые не могут быть разделены другими способами, например центрифугированием в градиенте плотности. Кроме того, при разделении в геле прямо следят за положением ДНК, так как полосы ДНК в геле можно окрашивать флуоресцирующим в ДНК красителем – бромистым этидием в низкой концентрации. Просматривая прокрашенный гель в ультрафиолетовом свете, можно заметить даже 1 нг ДНК.

Скорость миграции ДНК через агарозный гель при электрофорезе определяется следующими пятью главными параметрами: размером молекул ДНК, конформацией ДНК, концентрацией агарозы, напряженностью электрического поля, используемым буфером.

Электрофорез является одним из методов определения количества и качества ДНК. Этот метод позволяет определить приблизительную концентрацию ДНК. Она определяется сравнением исследуемой ДНК со стандартными разведениями ДНК-маркера известной молекулярной массы, концентрация которого известна. После электрофореза и окрашивания геля сравнивают интенсивность свечения полос ДНК в исследуемых и эталонных образцах.

Цель работы. Приобретение навыков разделения молекул ДНК и определения их концентрации путем проведения электрофореза в агарозном геле.

Задачи работы:

провести электрофорез выделенной ДНК бактерий в агарозном геле;

оценить молекулярную массу и количество ДНК электрофоретическим путем;

оформить результаты электрофореза с использованием гель-документирующей системы.

1. 
   Для электрофореза применяются трис-ацетатные, трис-боратные или трис-фосфатные буферы в концентрации 50 мМ с рН от 7,5 до 7,8. Чаще всего их готовят в виде 20-тикратных концентрированных растворов и хранят при комнатной температуре.
   
2. 
   Концентрированный буфер для нанесения проб (содержит 0,25% бромфенолового синего, 0,25% ксиленцианола, 30% глицерина в Н₂О.)
   
3. 
   Агароза.
   
4. 
   Пробы ДНК (0,2-0,4 мкг ДНК в объеме 5 – 10 мкл).
   

1. 
   Источник питания Вio-Rad PowerPac HV (1-400 Bт, 0,01-500 мА, 20-5000 В)
   
2. 
   Камера для горизонтального электрофореза (гель 7х10) Мini-Sub Cell GT, Bio-Rad.
   
3. 
   Гель-документирующая система Bio-Rad Gel Doc XR c компьютером.
   

1. 
   Добавляют необходимое количество порошка агарозы в рассчитанный объем электрофорезного буфера. Объем буфера вычисляют, умножив площадь формы для агарозы для геля на его толщину. Если площадь формы для агарозы равна 70 см², а толщина 0,5 см, то объем буфера составит 35 см³. Для приготовления 2 %-го агарозного геля в этом случае надо взять 0,7 г агарозы.
   
2. 
   Нагревают взвесь в бане с кипящей водой или в микроволновой печи до тех пор, пока агароза не образует равномерную суспензию. Суспензию довести до начала кипения, затем осторожно удалить из микроволновой печи и охладить до 60⁰ С.
   
3. 
   Заливают полученную суспензию в форму для агарозы.
   
4. 
   Устанавливают гребенку в форму для агарозы. Необходимо, чтобы между дном лунки от гребенки и основанием геля оставался слой агарозы толщиной 0,5-1,0 мм, т.е. чтобы дном лунки служил агарозный гель.
   

5. 
   После того как гель полностью затвердеет (через 30-45 мин.), осторожно удаляют гребенку и помещают гель в электрофорезную кювету.
   
6. 
   Добавляют достаточное количество электрофорезного буфера, так чтобы гель был закрыт слоем буфера толщиной 1 мм.
   
7. 
   Смешивают пробы ДНК с буфером для нанесения пробы, содержащим глицерин и красители (бромфеноловый синий и ксиленцианол) в соотношении 5 : 1. С помощью автоматической микропипетки вносят смесь в лунки геля под электрофорезный буфер. Обычно буфер для нанесения проб готовят в виде раствора 6-10-кратной концентрации.
   
8. 
   Подсоединяют электроды к источнику напряжения. Напряженность при проведении разделения в агарозных гелях составляет 1-3 В/см. Красители как и ДНК перемещаются каноду. Бромфеноловый синий передвигается со скоростью равной скорости фрагмента ДНК из 300 пар оснований, а ксиленцианол со скоростью равной скорости фрагмента ДНК из 1500 пар оснований.
   
9. 
   По окончанию разделения вынимают подложку с гелем из кюветы и помещают гель вместе с подложкой в красящий раствор (1 мкг/мл бромистого этидия). После 15 мин. прокрашивания вынимают подложку вместе с гелем и промывают в воде в течение 4 мин.
   
10. 
    Жидкость с подложки удаляют с помощью фильтровальной бумаги и перекладывают подложку в камеру трансиллюминатора гель-документирующей системы.
    
11. 
    Рассматривают гель в проходящем ультрафиолетовом свете. Фиксируют полученное изображение и оформляют результаты, используя гель-документирующую систему.
    

1. 
   На чем основано электрофоретическое разделение ДНК?
   
2. 
   На чем основано электрофоретическое определение концентрации ДНК?
   
3. 
   Как рассчитывается объем агарозного геля?
   
4. 
   Перечислите основные этапы проведения электрофореза ДНК.
   
5. 
   Какие операции нужно совершить после прохождения электрофореза ДНК для получения результатов и их оформления?
   

В процессе выделения ДНК происходят нарушения ее целостности. Длинные молекулы ДНК рвутся на более мелкие. Часть молекул ДНК теряет двухспиральную структуру. Происходит накопление олигонуклеотидов и мононуклеотидов

Спектры поглощения нуклеотидов расположены в ближнем ультрафиолетовом диапазоне. У всех нуклеотидов кроме цитидина максимумы поглощения наблюдаются около 260, у цитидина около 270 нм.

Коэффициенты молярной экстинкции нуклеотидов зависят от длины волны, свойств растворителя и природы нуклеотида. Так при 259,5 нм при pH 7 аденин имеет коэффициент молярной экстинкции (ε_макс) равный 13400 М^–1.см^–1.

Спектр поглощения ДНК обусловлен наложением спектров ее мономеров (нуклеотидов). Максимум поглощения ДНК в водных растворах при физиологических значениях рН наблюдается при 260 нм (λ_макс). Однако поглощение ДНК при 260 нм существенно меньше, чем суммарное поглощение ее мономеров. При распаде нативной ДНК до мононуклеотидов происходит увеличение поглощения – гиперхромнный эффект (гиперхромизм).

Гиперхромнным эффектом ДНК называется увеличение оптической плотности (примерно на 40%) раствора эквимолярной смеси свободных нуклеотидов или денатурированной ДНК по сравнению с оптической плотностью раствора нативной ДНК. На основании оценки гиперхромизма возможно определение степени денатурации и ренатурации ДНК. Гиперхромизм в применении к спектру полимера предполагает, что удвоенная мощность осциллятора перехода в мономере больше, чем полная мощность осциллятора соответствующего перехода в димере.

Нуклеотиды, входящие в состав двухцепочечной молекулы ДНК, поглощают ультрафиолет в той же области, что и свободные нуклеотиды, однако интенсивность поглощения двухцепочечной молекулы ДНК меньше, чем в случае эквивалентного количества свободных нуклеотидов. Это обусловлено взаимодействием пар оснований в структуре двойной спирали.

Интенсивность поглощения около 260 нм в спектре ДНК резко изменяется при нагревании выше некоторой критической температуры, величина которой зависит от свойств исследуемой ДНК. При достижении этой критической температуры поглощение возрастает приблизительно на 40 % в температурном интервале, составляющем всего лишь несколько градусов.

Это можно объяснить тем, что в денатурированном состоянии ароматические кольца могут свободно вращаться, в связи с чем взаимная ориентация дипольных моментов переходов соседних групп исчезает.

В меньшей степени уменьшение оптического поглощения по сравнению с мономерными компонентами характерно для всех полинуклеотидов и олигонуклеотидов, для которых не характерны необратимые изменения при обычных условиях денатурации. При увеличении длины цепи олигонуклеотида гиперхромизм быстро достигает предельного значения у цепочки в 5-6 остатков. Это было показано и при изучении синтетических олигонуклеотидов. Гипохромизм важен не только сам по себе, как чрезвычайно интересное оптическое явление.Этот феномен, дает нам в руки простой и удобный метод, который можно использовать в химии нуклеиновых кислот для качественной и количественной оценки процессов денатурации, ренатурации, обратимого образования гомополимерных комплексов или образования гибридных спиралей ДНК – РНК. Он также применяется для установления генетической связи между ДНК из различных организмов или из различных клеток одного и того же организма. Все, что требуется для проведения такой оценки - это спектрофотометр или какой-нибудь другой прибор, с помощью которого можно измерять поглощение света в области 260 нм.

Гиперхромизм является признаком денатурации (переходе от двухспиральной структуры ДНК к односпиральной). Поэтому изучение гиперхромного эффекта является критерием качества препаратов ДНК.

При выделении ДНК для дальнейшего ее биотехнологического использования важно оценить не только чистоту полученного препарата от сопутствующих примесей, но и его нативность.

измерить концентрации ДНК в представленных растворах спектрофотометрическим методом;

оценить качество представленных растворов ДНК спектрофотометрическим методом;

оценить гиперхромный эффект представленных растворов ДНК.

1. 
   1 М Трис НCl, pH 8,0.
   
2. 
   ЭДТА.
   

1. Спектрофотометр SmartSpec Plus Вio-Rad.

2. Аналитические весы Ohaus.

3.Термостат Eppendorf ThermoStat plus.

4.Автоматические пипетки Eppendorf.

1. Приготовить ТЕ буфер: Трис НCl, pH 8,0, 5мМ ЭДТА.

2. Приготовить разведения растворов ДНК в 10 и 100 раз в ТЕ буфере.

3. Определить их поглощение при 260нм. Если величина поглощения (D) соответствует промежутку от 0,3 до 0,8 оптических единиц, то продолжить дальнейшие исследования. Если нет, то приготовить более подходящие разведения.

4. Определить поглощение исследуемых растворов при 230, 280 и 320нм. Препарат считается чистым, если отношение 260 нм/280 нм составляет 1,8–2,0 и отношение 260 нм/230 нм составляет 1,8 – 2,2. Меньшие значения этих отношений характерны для загрязненных образцов ДНК. Поглощение при 320 нм характерно при наличии в растворе частичек пыли.

5. Определить концентрации ДНК в чистых препаратах учитывая, что одна единица оптической плотности соответствует концентрации ДНК приблизительно 50 мкг/мл. Для стандартных растворов с известной концентрацией сверить полученные результаты с расчётными.

6. Снять спектры исследуемых растворов в диапазоне 230-500 нм. Определить коэффициенты молярной экстинкции стандартных растворов с известной концентрацией при 260 нм и сравнить с литературными данными.

7. Разделить исследуемые растворы пополам по двум пробиркам. Закрыть их плотно колпачками из фольги и поместить в термостат при 94 С. Через 15 минут одну половину исследуемых растворов быстро остудить на водяной бане, термостат отключить от питания и вторую половину оставить медленно остывать.

8. После охлаждения второй половины растворов до комнатной температуры (19-25⁰С) измерить спектры поглощения этой части в диапазоне 230-500 нм.

9. Подогреть охлажденную на ледяной бане первую половину растворов до комнатной температуры и измерить спектры поглощения этой части в диапазоне 230-500 нм.

10.По полученным величинам оптической плотности при 260 нм рассчитать величину гиперхромного эффекта для нативной (исходной) и ренатурированной (медленно остывшей) ДНК каждого образца:

ГЭ = (D₁-D₂)/D₁^.100,

где D₁ и D₂ – оптические плотности для денатурированной (быстро охлажденной) и нативной (или ренатурированной) ДНК соответственно.

11.Составить отчет. В нем должны присутствовать сведения о качестве исходных образцов ДНК. Также должны присутствовать графики спектров исходной (нативной), денатурированной и ренатурированной ДНК и сравнительный анализ этих спектров в виде таблицы

Номер опыта	Образец ДНК	λмакс. Длина волны при максимуме поглощения	D Оптическая плотность	Концентрация ДНК
1	Нативная
2	Ренатурированная
3	Денатурированная

12.В выводах нужно осветить следующие моменты:

а) Отличаются ли спектры исходной, денатурированной и ренатурированной ДНК? Если отличаются, то почему?

б) Произошла ли полная ренатурация (восстановление исходной структуры) ДНК в результате медленного охлаждения?

в) Отличаются ли коэффициенты поглощения исходной, денатурированной и ренатурированной ДНК одного и того же образца при λ_макс? Если отличаются, то почему?