Учебно-методическое пособие к лабораторным занятиям Красноярск сфу 2011 ббк 28. 072 М 545

1. 
   Как определить концентрацию и качество исходного нативного образца ДНК?
   
2. 
   Чем отличаются от исходного образца ДНК денатурированная и ренатурированная ДНК ?
   
3. 
   Какие процессы влияют на спектры поглощения ДНК?
   
4. 
   В чем состоит гиперхромнный эффект ДНК?
   
5. 
   Какие задачи можно решать используя абсорбционную спектроскопию ДНК?
   

Генетическая система бактерий состоит из ядерных и внеядерных структур. Аналог ядра прокариотов значительно отличается от ядра эукариотических клеток. Он представлен нуклеоидом, лишенным оболочки и включающем в себя почти всю ДНК бактерии. Бактериальная хромосома состоит из одной двунитевой молекулы ДНК кольцевой формы Молекула ДНК построена из двух полинуклеотидных цепочек. Нуклеотидные цепи антипараллельны: на каждом конце линейной молекулы ДНК расположены 5' -конец одной цепи и 3' -конец другой цепи. Наследственная информация у бактерий хранится в форме последовательности нуклеотидов ДНК, которая определяет последовательность аминокислотных остатков в молекуле белка. Каждому белку соответствует свой ген, т.е., дискретный участок на ДНК, отличающийся числом и специфичностью последовательности нуклеотидов. Бактериальная хромосома содержит до 4000 отдельных генов. Размеры бактериальной хромосомы у различных представителей царства Procaryotae варьируют от 3 х 10 ⁸ до 2,5 х 10 ⁹  Д.

На первой стадии выделения нуклеиновых кислот ставится задача отделить их от клеточных компонентов и удалить связанный с ними белок. Оболочки бактериальных клеток разрываются под действием поверхностно-активных соединений, таких, как додецилсульфат натрия (ДСН). Можно применять также фермент лизоцим.

После разрушения клеток и удаления клеточных обломков путем центрифугирования необходимо отделить нуклеиновые кислоты от белка. Для этого используют фенол или смесь хлороформа с изоамиловым спиртом. Белок также можно удалить с помощью протеаз.

При выделении ДНК наиболее серьезная проблема состоит в том, чтобы избежать механического повреждения ее молекул, а также разрушения под действием нуклеаз. Длинные тонкие нити молекул ДНК легко рвутся даже при простом встряхивании раствора. Распад ДНК могут вызвать дезоксирибонуклеазы, активируемые ионами двухвалентных металлов. Поэтому ДНК выделяют в присутствии хелатообразующих агентов и ДСН.

Наличие нативной ДНК в выделенном препарате можно определить с помощью электрофореза, а также спектрофотометрическим способом. Основная полоса поглощения ДНК расположена при 260 нм. Одна единица оптической плотности соответствует концентрации ДНК приблизительно 50 мкг/мл. Отношения поглощений при 260 и 280 нм, а также при 260 и 230 нм показывают чистоту образца ДНК.

Препарат считается чистым, если отношение 260 нм/280 нм составляет 1,8 – 2,0 и отношение 260 нм/230 нм составляет 1,8 – 2,2.

Цель работы. Приобрести навыки выделения ДНК из бактериальной биомассы.

Задачи работы:

выделить ДНК из биомассы бактерий Wautersia eutropha;

оценить наличие полученной ДНК спектрофотометрическим методом;

оценить наличие полученной ДНК с помощью электрофореза в агарозном геле.

1. 
   Глюкоза.
   
2. 
   1 М Трис НCl, pH 8,0.
   
3. 
   ЭДТА.
   
4. 
   1% CuSO₄.
   
5. 
   Дистиллированный этиловый спирт.
   
6. 
   3 М ацетат натрия (СH₃COONa).
   
7. 
   Тритон Х-100.
   
8. 
   SDS.
   
9. 
   Насыщенный фенол, рН 8,0.
   
10. 
    Хлороформ.
    
11. 
    Изоамиловый спирт.
    
12. 
    Трис-ацетатный буфер 50 мМ с рН 7,8.
    
13. 
    Концентрированный буфер для нанесения проб (0,25% бромфенолового синего, 0,25% ксиленцианола, 30% глицерина в Н₂О.)
    
14. 
    Агароза.
    

1. 
   Охлаждаемая центрифуга Eppendorf 5804 R со сменными роторами.
   

2. 
   Термостат Eppendorf ThermoStat plus.
   
3. 
   Спектрофотометр SmartSpec Plus Вio-Rad.
   
4. 
   Источник питания Вio-Rad PowerPac HV (1-400 Bт, 0,01-500 мА, 20-5000 В)
   
5. 
   Камера для горизонтального электрофореза (гель 7х10) Мini-Sub Cell GT, Bio-Rad.6.
   
6. 
   Гель-документирующая система Bio-Rad Gel Doc XR c компьютером.
   

1. 
   Приготавливают экстракционный раствор: 50мМ глюкозы, 25мМ Трис НCl, pH 8,0, 10мМ ЭДТА, 0,1% Тритон Х-100, 1% SDS.
   
2. 
   Гомогенизируют 1 г биомассы бактерий в 10 мл экстракционного раствора.
   
3. 
   К гомогенату добавляют 1 мл 3 М ацетата натрия.
   
4. 
   Добавляют равный объем нейтрализованного фенола. Быстро перемешиваем.
   
5. 
   Центрифугируют при 5000 об/мин 40 минут при 0⁰С.
   
6. 
   Отбирают верхнюю фракцию. Измеряют ее объем. Добавляют равный объем охлажденного изопропанола или двукратный объем охлажденного дистиллированного этилового спирта. Перемешивают и помещают в холодильник на 30 минут.
   
7. 
   Центрифугируют при 5000 об/мин 40 минут при 0⁰С. Аккуратно удаляют надосадочный раствор. Остаточные капли удаляют с использованием фильтровальной бумаги.
   
8. 
   Полученный осадок промывают охлажденным 70% этиловым спиртом. Остаточные капли удаляют фильтровальной бумагой.
   
9. 
   Подсушивают осадок (ДНК) примерно 1 час на воздухе.
   
10. 
    Готовят буфер хранения: 10мМ Трис НCl, pH 8,0, 5мМ ЭДТА.
    
11. 
    Растворяют ДНК в 1 мл буфера хранения. Затем полученный раствор убираем в морозильник.
    

1. 
   Разморозить раствор ДНК. Измеряют в нем концентрацию ДНК и белка спектрофотометрическим и биуретовым способами.
   
2. 
   Взять 500 мкл исходного раствора и добавить к нему 5 мкл РНК-зы в концентрации 100мг/мл. Перемешать и поставить в термостат на 37⁰С на 30 минут.
   
3. 
   После инкубации добавить 50 мкл ацетата натрия, перемешать, добавить равный объем смеси хлороформ- изоамиловый спирт (24:1). Перемешать и центрифугировать при 5000 об/мин 10 минут при 0⁰С.
   
4. 
   Отобрать верхнюю фракцию. Измерить ее объем. Добавить равный объем охлажденного изопропанола или двукратный объем охлажденного дистиллированного этилового спирта. Перемешать и поместить в холодильник на 30 минут.
   
5. 
   Отцентрифугировать при 5000 об/мин 20 минут при 0⁰С. Аккуратно удалить надосадочный раствор. Остаточные капли удалить с использованием фильтровальной бумаги.
   
6. 
   Осадок промыть охлажденным 70% этиловым спиртом. Остаточные капли удалить фильтровальной бумагой.
   
7. 
   Подсушить осадок ДНК примерно 1 час на воздухе.
   
8. 
   Растворить ДНК в 300 мкл мл буфера хранения.
   
9. 
   Измерить концентрацию ДНК по поглощению при 260 нм. Определить качество ДНК спектрофотометрическим способом.
   
10. 
    Провести электрофорез в агарозе геле полученного образца ДНК.
    
11. 
    Сделать вывод о качестве полученного препарата ДНК.
    

1. 
   Назовите особенности устройства генома бактерий.
   
2. 
   Назовите основные стадии выделения ДНК из бактерий.
   
3. 
   Каких проблем следует избегать при выделении ДНК?
   
4. 
   На чем основаны принципы методов выделения ДНК из бактерий?
   
5. 
   В чем состоит принцип определения ДНК спектрофотометрическим методом?
   
6. 
   Каковы критерии чистоты препаратов ДНК?
   
7. 
   Перечислите основные этапы выделения ДНК из биомассы бактерий.
   
8. 
   Перечислите основные этапы очистки препаратов ДНК.
   
9. 
   Какие операции нужно совершить после выделения и очистки ДНК из биомассы бактерий?
   

Эндонуклеазы рестрикции, рестриктазы (от лат. restrictio — ограничение) — группа ферментов, относящихся к классу гидролаз, катализирующих гидролиз фосфодиэфирных связей чужеродных ДНК в большинстве прокариотических (бактерии и сине-зеленые водоросли) и некоторых других организмах и выполняющие тем самым "иммунную" функцию. Это ферменты, «узнающие» определенные последовательности (сайты рестрикции) в двухцепочечной ДНК. Их выделяют преимущественно из прокариотических клеток.

В отличие от экзонуклеаз, рестриктазы расщепляют нуклеиновые кислоты не с конца молекулы, а в середине. При этом каждая рестриктаза узнаёт определённый участок ДНК длиной от четырёх пар нуклеотидов и расщепляет нуклеотидную цепь внутри участка узнавания или вне его.

К 2007 году выделено более трех тысяч эндонуклеаз рестрикции. Более шестисот рестриктаз доступны в виде коммерческих препаратов и повседневно используются в лабораториях для модификации ДНК и решения генно-инженерных задач.

Ферменты рестрикции являются эффективным инструментом исследования. Они позволяют превращать молекулы ДНК очень большого размера в набор фрагментов длиной от нескольких сотен до нескольких тысяч оснований. С помощью метода электрофореза в агарозном геле фрагменты ДНК, различающиеся по размеру, можно легко разделить, а затем исследовать каждый фрагмент отдельно.

Короткие фрагменты мигрируют намного быстрее, чем длинные. При сравнительно высокой концентрации агарозы большие фрагменты вообще не могут проникнуть в гель. В процессе миграции рестрикционные фрагменты не деградируют, их можно вымывать в виде биологически активных двуцепочечных молекул. При окрашивании гелей красителями, связывающимися с ДНК, выявляется набор полос, каждая из которых отвечает рестрикционному фрагменту, молекулярную массу которого можно определить, проведя калибровку с помощью ДНК с известными молекулярными массами.

Для каждого фермента рестрикции существуют оптимальные условия реакции, которые приводятся в описании, прилагаемом фирмой-изготовителем. Основные переменные параметры – это температура инкубации и состав буфера. К температурному режиму предъявляются достаточно жесткие требования, тогда как различия между буферами чаще всего лишь незначительны.

Чтобы не готовить отдельный буфер для каждого фермента, удобно разделить ферменты на три группы:

ферменты, лучше всего функционирующие при высокой ионной силе;

ферменты, для которых желательны средние значения ионной силы;

ферменты, функционирующие предпочтительно в буферах с низкой ионной силой.

В соответствии с таким делением можно готовить только три исходных буфера: с низкой, средней и высокой ионной силой.

Обычно все буферные растворы, используемые для проведения реакций рестриктирования, готовят в виде исходных растворов 10-кратной концентрации, которые можно хранить при 4⁰ С в течение 1-2 недель или при –20⁰ С неопределенно долгое время. Реакционная смесь обычно содержит 0,3 – 1,2 мкг ДНК в объеме 20 мкл или менее.

Цель работы. Приобрести навыки рестрикционного анализа ДНК.

Задачи работы:

подобрать стандартный образец ДНК с известной последовательностью нуклеотидов;

выбрать две подходящие рестриктазы для проведения расщепления данного образца ДНК, функционирующие при одинаковой ионной силе;

выбрать буфер, при котором лучше всего функционируют обе рестриктазы;

подобрать подходящую концентрацию и объем ДНК и провести реакции в трех вариантах;

провести электрофорез продуктов реакции ДНК;

1. 
   Буферные растворы для проведения реакций рестрикции фирмы «Сибэнзим».
   
2. 
   Стандартные образцы ДНК фирмы «Сибэнзим» (ДНК фага λ, ДНК фага Т 7, плазмидная ДНК).
   
3. 
   Рестриктазы, поставляемые фирмой «Сибэнзим» (Kpn I, BamH I, EcoR I, Hind III, и так далее).
   
4. 
   50-кратный ТАЕ буфер для электрофореза фирмы «Литех».
   
5. 
   Концентрированный буфер для нанесения проб (0,25% бромфенолового синего, 0,25% ксиленцианола, 30% глицерина в Н₂О).
   
6. 
   Агароза НПО « Вектор Бест».
   

1. 
   Спектрофотометр SmartSpec Plus Вio-Rad.
   
2. 
   Источник питания Вio-Rad PowerPac HV (1-400 Bт, 0,01-500 мА, 20-5000 В)
   
3. 
   Камера для горизонтального электрофореза (гель 7х10) Мini-Sub Cell GT, Bio-Rad.
   
4. 
   Гель-документирующая система Bio-Rad Gel Doc XR c компьютером.
   
5. 
   Термостат Eppendorf ThermoStat plus.
   
6. 
   Пробирки 0,2 мл «Eppendorf».
   

1. 
   Выбрать из имеющихся в наличии стандартов образец ДНК с известной последовательностью нуклеотидов.
   
2. 
   Учитывая известную последовательность нуклеотидов в выбранном образце ДНК, подобрать две рестриктазы, функционирующие при одинаковой ионной силе, для проведения расщепления данного образца ДНК.
   
3. 
   Выбрать буфер, подходящий для работы обеих рестриктаз.
   
4. 
   Разведением в стерильной дистиллированной воде довести концентрацию ДНК в растворе до необходимой (50-60 мкг/мл).
   
5. 
   Внести в стерильную пробирку фирмы Эппендорф 18 мкл раствора ДНК концентрации 50-60 мкг/мл и перемешать.
   
6. 
   Добавить 2 мкл соответствующего буфера 10-кратной концентрации и перемешать, слегка постукивая по пробирке пальцем.
   
7. 
   Добавим 1 ед. рестриктазы и перемешаем, слегка постукивая по пробирке пальцем.
   
8. 
   Запишем объем и состав реакционной смеси.
   
9. 
   Проведем реакции в трех вариантах в течении 1 часа при оптимальной температуре расщепления для используемых ферментов; в качестве отрицательного контроля поставим пробу ДНК без добавления ферментов.
   
10. 
    Подвергнем продукты реакции и маркерные ДНК электрофорезу в
    1 %-ном агарозном геле.
    
11. 
    Рассмотрим гель в проходящем ультрафиолетовом свете; зафиксируем полученное изображение и оформим результаты, используя гель-документирующую систему.
    
12. 
    Оценим качество рестрикции ДНК (полноту расщепления пробы) и размер полученных рестриктов.
    
13. 
    Оценим размеры рестриктов, полученных в каждой из реакций, сравним с ожидаемыми и сделаем выводы.
    

1. 
   Что представляют собой эндонуклеазы рестрикции?
   
2. 
   В чем состоит функция рестриктаз в клетках?
   
3. 
   Для каких целей в биохимии используются эндонуклеазы рестрикции?
   
4. 
   На чем основаны принципы использования эндонуклеаз рестрикции?
   
5. 
   Каковы оптимальные условия реакций рестрикции?
   
6. 
   Какие буферы используются для проведения реакций рестрикции?
   
7. 
   Какие задачи необходимо решать при проведении рестрикционного анализа ДНК?
   
8. 
   Перечислите основные этапы проведения рестрикционного анализа ДНК.
   
9. 
   Какие операции нужно совершить после для проведения реакций рестрикции?
   
10. 
    Как оценить размер полученных рестриктов?
    
11. 
    Как оценить качество рестрикции (полноту расщепления пробы)?
    
12. 
    Какую информацию можно получить при расщеплении ДНК определенной молекулярной массы двумя рестриктазами одновременно?
    
13. 
    В чем суть проблемы при использовании метода расщепления ДНК двумя рестриктазами одновременно?
    

Полимера́зная цепна́я реа́кция (ПЦР) — экспериментальный метод биохимии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов ДНК в биологическом материале.

Помимо амплификации (увеличения числа копий) ДНК, ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с нуклеиновыми кислотами (введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК) и широко используется в биологической и медицинской практике, например, для диагностики заболеваний (наследственных, инфекционных), для установления отцовства, для клонирования генов, выделения новых генов.

В основе метода ПЦР лежит природный процесс - комплементарное достраивание ДНК матрицы, осуществляемое с помощью фермента ДНК-полимеразы. Эта реакция носит название репликации ДНК.

Естественная репликация ДНК включает в себя несколько стадий:

1) Денатурация ДНК (расплетение двойной спирали, расхождение нитей ДНК);

2) Образование коротких двухцепочечных участков ДНК (затравок, необходимых для инициации синтеза ДНК);

3) Синтез новой цепи ДНК (комплементарное достраивание обеих нитей).

Суть метода заключается в специфической амплификации ДНК с помощью полимеразы, осуществляющей избирательный синтез взаимно комплементарных цепей ДНК, начиная с двух праймеров (затравок). Праймеры комплементарны противоположным цепям ДНК в участках, ограничивающих выбранную область ДНК, и ориентированы З'-концами навстречу друг другу и в сторону той последовательности, которую необходимо амплифицировать. Длина амплифицируемого фрагмента определяется расстоянием между праймерами. Используя в качестве матрицы любые образцы ДНК, содержащие амплифицируемую последовательность, можно увеличить количество копий изучаемого фрагмента ДНК в сотни миллионов раз. Такое увеличение, позволяющее визуализировать заданный фрагмент ДНК на электрофореграмме, а также использовать продукт амплификации для дальнейшего изучения с помощью других методов, можно считать главным достоинством метода ПЦР.

Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты: ДНК-матрица, праймеры, термостабильная ДНК-полимераза, дезоксинуклеозидтрифосфаты, ионы Mg²+, буферный раствор, обеспечивающий необходимые условия реакции — рН, ионную силу раствора.

ДНК-матрица – образец ДНК, содержащий тот участок, который требуется амплифицировать. Праймеры – короткие синтетические олигонуклеотиды длиной 18—30 оснований, затравки, необходимые для инициации синтеза ДНК. После гибридизации матрицы с праймером (отжиг), последний служит затравкой для ДНК-полимеразы при синтезе комплементарной цепи матрицы. Термостабильная ДНК-полимераза — фермент, который катализирует реакцию полимеризации ДНК. Полимераза для использования в ПЦР должна сохранять активность при высокой температуре длительное время, поэтому используют ферменты, выделенные из термофилов — Thermus aquaticus (Taq-полимераза), Pyrococcus furiosus (Pfu-полимераза), Pyrococcus woesei (Pwo-полимераза) и другие. Дезоксинуклеозидтрифосфаты (dATP, dGTP, dCTP, dTTP). Ионы Mg2+, необходимые для работы полимеразы. Буферный раствор, содержит соли, бычий сывороточный альбумин.

Обычно при проведении ПЦР выполняется 20—35 циклов, каждый из которых состоит из трех стадий:

Денатурация

Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94—96° C (или до 98° C, если используется особенно термостабильная полимераза) на 0,5—2 мин., чтобы цепи ДНК разошлись. Эта стадия называется денатурацией, так как разрушаются водородные связи между двумя цепями ДНК. Иногда перед первым циклом (до добавления полимеразы) проводят предварительный прогрев реакционной смеси в течение 2—5 мин. для полной денатурации матрицы и праймеров. Такой приём называется горячим стартом, он позволяет снизить количество неспецифичных продуктов реакции.

Отжиг

Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Эта стадия называется отжигом. Температура отжига зависит от состава праймеров и обычно выбирается на 4—5° С ниже их температуры плавления. Время стадии — 0,5—2 мин. Неправильный выбор температуры отжига приводит либо к плохому связыванию праймеров с матрицей (при завышенной температуре), либо к связыванию в неверном месте и появлению неспецифических продуктов (при заниженной температуре).

ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве затравки. Это — стадия элонгации. Полимераза начинает синтез второй цепи от 3'-конца праймера, который связался с матрицей, и движется вдоль матрицы в направлении от 3' к 5'. Температура элонгации зависит от полимеразы. Часто используемые полимеразы Taq и Pfu наиболее активны при 72° C. Время элонгации зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины амплифицируемого фрагмента. Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований. После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты. Эта стадия длится обычно 7-10 мин.

Ключевым фактором успешности процесса, является, пожалуй, правильный выбор последовательности праймеров. Можно использовать программы, значительно упрощающие поиск подходящих регионов ДНК или даже выбирающие пару праймеров автоматически (например, "Oligo" от «Мolecular Bioligy Insights»).

ПЦР проводят в амплификаторе — приборе, обеспечивающем периодическое охлаждение и нагревание пробирок, обычно с точностью не менее 0,1° C. Современные амплификаторы позволяют задавать сложные программы, в том числе с возможностью последующего хранения амплифицированных молекул при 4° C. Существуют также приборы с автоматической крышкой и отделением для микропланшет, что позволяет встраивать их в автоматизированные системы.

Чтобы избежать испарения реакционной смеси, в пробирку добавляют высококипящее масло, например, вазелиновое. Если используется амплификатор с подогревающейся крышкой, этого делать не требуется.

Цель работы. Приобрести навыки проведения полимеразной цепной реакции.

Задачи работы:

выбрать образцы растительной или бактериальной ДНК и подобрать к ним подходящие пары праймеров;

подобрать подходящую программу амплификатора для получения набора паттернов, характерных для данных образцов ДНК;

рассчитать и приготовить реакционную смесь;

провести полимеразную цепную реакцию по подобранной программе;

провести электрофорез продуктов амплификации;

зафиксировать и оформить результаты электрофореза с использованием гель-документирующей системы.

Реактивы:

1. 
   ДНК, выделенная из бактерий или растений.
   
2. 
   Праймеры фирмы «Сибэнзим».
   
3. 
   Термостабильная ДНК-полимераза, поставляемая фирмой «Сибэнзим»
   
4. 
   Раствор дезоксинуклеозидтрифосфатов фирмы «Сибэнзим»
   
5. 
   Раствор MgCl₂.
   
6. 
   10-кратный реакционный буфер.
   
7. 
   Стерильная дистиллированная вода.
   
8. 
   Агароза НПО « Вектор Бест».
   
9. 
   50-кратный ТАЕ буфер для электрофореза фирмы «Литех».
   
10. 
    Маркеры молекулярной массы фирмы «Сибэнзим».
    
11. 
    Концентрированный буфер для нанесения проб (0,25% бромфенолового синего, 0,25% ксиленцианола, 30% глицерина в Н₂О).
    

1. 
   Бокс – ламинар БАВнп-01-«Ламинар-С».
   
2. 
   Амплификатор MJ Mini («BIO-RAD»).
   

3. 
   Автоматические пипетки «Eppendorf», стерильные наконечники с фильтрами.
   
4. 
   Камера для горизонтального электрофореза (гель 7х10) Мini-Sub Cell GT, Bio-Rad.
   
5. 
   Гель-документирующая система Bio-Rad Gel Doc XR c компьютером;
   
6. 
   Стерильные центрифужные пробирки 1,5 мл и ПЦР пробирки 0,2 мл «Eppendorf».
   

7. 
   Центрифуга Mini Spin «Eppendorf».