Учебное пособие «История и методология биологии и биофизики»

Изучение экспрессии генов у вирусов эукариот дало фундаментальную информацию о молекулярной биологии самих эукариот — существование кэп-структуры мРНК и ее роль в трансляции РНК, наличие полиадениловой последовательности на 3'-конце мРНК, сплайсинг и роль энхансеров в транскрипции впервые выявлены при изучении вирусов животных.

1972 г. — Берг публикует сообщение о создании рекомбинантной молекулы ДНК. Возникает новый раздел молекулярной биологии — генная инженерия. Применение технологии рекомбинантных ДНК позволяет получать белки, имеющие важное значение в медицине (инсулин, интерферон, вакцины). 1975 г. — Келер и Мильштейн получают первые линии гибридов, продуцирующих моноклональные антитела (МКА). На основе МКА разрабатываются самые специфичные тест-системы для диагностики вирусных инфекций. 1976 г. — Бламберг за открытие HBsAg получает Нобелевскую премию. Установлено, что гепатит A и гепатит B вызываются разными вирусами.

Открыты вирусы: 1970 г. — вирус гепатита B; 1973 г. — ротавирусы, вирус гепатита A; 1977 г. — вирус гепатита дельта.

1985 г. — Мюллис получает Нобелевскую премию за открытие полимеразной цепной реакции (ПЦР). Это — молекулярно-генетический метод диагностики, позволивший, кроме того, усовершенствовать технологию получения рекомбинантных ДНК и открыть новые вирусы. Открыты вирусы: 1983 г. — вирус иммунодефицита человека; 1989 г. — вирус гепатита C; 1995 г. — с использованием ПЦР открыт вирус гепатита G.

Накопившиеся данные позволили прийти к выводу, что вирусы не являются организмами, пусть даже мельчайшими, так как любые, даже минимальные организмы типа микоплазм, риккетсий и хламидий имеют собственные белоксинтезирующие системы. Согласно определению, сформулированному академиком В.М. Ждановым, вирусы являются автономными генетическими структурами, способными функционировать только в клетках с разной степенью зависимости от клеточных систем синтеза нуклеиновых кислот и полной зависимостью от клеточных белоксинтезирующих и энергетических систем, и подвергающимися самостоятельной эволюции.

С точки зрения паразитологии, вирусы — облигатные внутриклеточные паразиты. Паразитизм (от греческого parasitos — нахлебник) — состояние симбиоза, при котором один организм (паразит) живет за счет другого, нанося ему вред. При этом паразит физически и физиологически зависит от хозяина. Внутриклеточный паразитизм — это высшая стадия облигатного паразитизма, суть которого заключается в абсолютной зависимости метаболизма паразита от организма хозяина и характеризуется полной невозможностью размножения паразита за пределами клетки. Однако уровень паразитизма вирусов качественно иной, чем у внутриклеточных паразитов-микроорганизмов. Вирусы — это генетические паразиты. Крайним проявлением генетического паразитизма является способность ряда вирусов интегрировать в геном клетки хозяина. С этой точки зрения вирусы могут быть определены как особая неклеточная форма жизни, которой присущ строгий внутриклеточный паразитизм на молекулярном и молекулярно-генетическом уровнях.

Таким образом, вирусы представляют собой многообразную и многочисленную группу неклеточных форм жизни, не являющихся микроорганизмами, и объединенных в царство Vira. Вирусы изучаются в рамках вирусологии, которая представляет собой самостоятельную научную дисциплину, имеющую свой объект и методы исследования.

Вирусологию разделяют на общую и частную, а вирусологические исследования — на фундаментальные и прикладные. Предметом фундаментальных исследований в вирусологии является архитектура вирионов, их состав, особенности взаимодействия вирусов с клеткой, способы переноса наследственной информации, молекулярные механизмы синтеза элементов и процесс их объединения в целое, молекулярные механизмы изменчивости вирусов и их эволюция. Прикладные исследования в вирусологии связаны с решением проблем медицины, ветеринарии и фитопатологии.

4.3.5. Принципы организации вирусов
В результате применения рентгеноструктурного анализа и электронной микроскопии в сочетании с методами оптической дифракции удалось расшифровать строение простых и сложных вирусов и бактериофагов.

Уже в 1958 г. Р. Франклин и К. Холмс показали, что ВТМ представляет собой полые палочкообразные цилиндрические образования. Дальнейшие исследования А. Клуга, Д. Каспара и других (1958—1960) дали новые сведения о макромолекулярной организации ВТМ. Работы Р. Маркхема и К. Смита с вирусом желтой мозаики турнепса положили начало установлению структуры так называемых малых сферических растительных вирусов. Оказалось, что у этих вирусов РНК заключена внутри сферы, построенной из белковых субъединиц (Г. Никсон, А. Гиббс, 1960). Идея о подобной организации малых сферических вирусов впервые была высказана в 1956 г. Ф. Криком и Дж. Уотсоном; П. Уилди, У. Рассел и Р. Хорн (1960) обнаружили, что аналогичной организацией обладают и некоторые простые вирусы животных. Работы Э. Мерцера, С. Бреннера, Д. Кинга и М. Муди способствовали выяснению организации бактериальных вирусов.

В онтогенетическом цикле вируса выделены две стадии — внеклеточная и внутриклеточная и, соответственно, две формы его существования — вирион и вегетативная форма. Вирион — это целая вирусная частица, в основном состоящая из белка и нуклеиновой кислоты, часто устойчивая к воздействию факторов внешней среды и приспособленная для переноса генетической информации из клетки в клетку. Вегетативная форма вируса существует в едином комплексе вирус-клетка и только в их тесном взаимодействии.

Внеклеточная форма вируса — вирион, предназначенная для сохранения и переноса нуклеиновой кислоты вируса, характеризуется собственной архитектурой, биохимическими и молекулярно-генетическими особенностями (рис.4.3.7). Термин «архитектура вирионов» появился в начале 1960-х гг. Под архитектурой вирионов понимают ультратонкую структурную организацию этих надмолекулярных образований, различающихся размерами, формой и сложностью строения. Для описания архитектуры вирусных структур разработана номенклатура терминов.

Вирионы – обычно симметричные тела, состоящие из повторяющихся элементов – капсомеров. В основе строения вирионов, определяемого взаимодействиями белков между собой и с нуклеиновыми кислотами, лежат законы термодинамики, определяющие правильную кристаллообразную структуру вирионов. Эти структуры образуются в результате самосборки. Возможные ошибки во время этого процесса исправляются также в результате действия законов термодинамики. Кроме того, законы термодинамики объясняют и реконструкцию исходной структуры вириона при смешивании его отдельных составных частей.

Рис. 4.3.7. Разнообразие форм и размеров вирусов. Схематическое изображение некоторых вирусов растений (a), животных (б) и бактериофагов (в)
Вирионы построены «с величайшей экономией» и обладают одним из двух типов симметрии: кубической или спиральной (рис.4.3.8, 4.3.9). По спиральному типу симметрии построено большинство вирусов, поражающих растения, человека (вирусы гриппа и свинки). По кубическому типу симметрии – многие вирусы человека и животных (аденовирусы, вызывающие респираторные заболевания, вирус полиомиелита, ящура и др.).

Рис. 4.3.8. Полиэдрическая симметрия вирусов (икосаэдр:20 треугольных граней, 12 вершин, 30 ребер)

Рис. 4.3.9. Вирус табачной мозаики – пример вируса со спиральной симметрией
Сложные вирусы – вирусы гриппа и парагриппа, рабдовирусы, вирус оспы и бактериофаги (вирусы, поражающие бактерии). Вирус оспы – гигант среди вирусов.

Как уже отмечалось, вирусы могут проходить через самые микроскопические поры, задерживающие бактерии, за что, и были названы фильтрующимися агентами. Свойство фильтруемости вирусов обусловлено размерами, исчисляемыми нанометрами (нм), что на несколько порядков меньше, чем размеры самых мелких микроорганизмов. Размеры вирусных частиц, в свою очередь, колеблются в относительно широких пределах. Самые мелкие просто устроенные вирусы имеют диаметр чуть больше 20 нм (парвовирусы, пикорнавирусы, фаг Qβ), вирусы средних размеров — 100-150 нм (аденовирусы, коронавирусы). Наиболее крупными признаны вирусные частицы осповакцины, размеры которых достигают 170x450 нм. Длина нитевидных вирусов растений может составлять 2000 нм.

Представители царства Vira характеризуются разнообразием форм (рис.4.3.7). По своей структуре вирусные частицы могут быть простыми образованиями, а могут представлять собой достаточно сложные ансамбли, включающие несколько структурных элементов. Условная модель гипотетического вириона, включающего все возможные структурные образования, представлена на рисунке 4.3.10.

Существует два типа вирусных частиц (ВЧ), принципиально отличающихся друг от друга:

1) ВЧ, лишенные оболочки (безоболочечные или непокрытые вирионы);

2) ВЧ, имеющие оболочку (оболочечные или покрытые вирионы).

В настоящее время на основании особенностей жизненного цикла бактериофаги разделяют на две группы:

1) вирулентные бактериофаги — фаги, жизненный цикл которых завершается лизисом клетки хозяина и выходом зрелых фаговых частиц;

2) умеренные или лизогенизирующие бактериофаги — фаги, способные после проникновения в бактериальную клетку переходить в состояние профага и длительное время реплицироваться совместно с бактериальным геномом, передаваясь очередному поколению бактерий.

Существуют два основных типа взаимодействия фагов с бактериями — литический и лизогенный, осуществляемый, соответственно, вирулентными и умеренными фагами.

Уже достаточно давно, ранее открытия антибиотиков, бактериофаги применяют в качестве антибактериальных лечебных препаратов (рис.4.3.13). Уступая антибиотикам в спектре антибактериальной активности, технологически, бактериофаги обладают рядом характеристик, которые позволили им сохраниться в перечне лекарственных средств до настоящего времени. В первую очередь, их отличает высокая специфичность и избирательность действия. Они поражают только один вид болезнетворных бактерий, не влияя на нормальную микрофлору человека. Бактериофаги не взаимодействуют с клетками человека, что обуславливает отсутствие противопоказаний к их применению и побочных реакций от их использования.

В Нижегородском НИИ эпидемиологии и микробиологии совместно с сотрудниками кафедры молекулярной биологии и иммунологии ННГУ им. Н.И. Лобачевского и Нижегородского предприятия по производству бактерийных препаратов под руководством академика РАМН И.Н. Блохиной разработаны фаговые препараты, направленные против большинства бактериальных возбудителей острых кишечных и гнойно-воспалительных инфекций: дизентерийный, сальмонеллезный, колипротейный, клебсиеллезный, стафилококковый, синегнойный бактериофаги. Все перечисленные препараты являются поливалентными, то есть способными разрушать клетки большинства вариантов соответствующего вида бактерий.

Исходно фаговые препараты представляли собой суспензию фаговых частиц в питательной среде. Благодаря разработке методов концентрирования фага были созданы новые формы — фаги в таблетках и свечах. Дальнейшее совершенствование технологий производства бактериофагов позволило увеличить активность фагов, приступить к выпуску комплексных форм, эффективных в отношении нескольких видов бактерий, расширить области применения фаговых препаратов.
4.3.7. Вирусы как возбудители заболеваний человека
«Империя вирусов – империя зла». На протяжении тысячелетий злодеяния вирусов (оспа, бешенство, грипп, полиомиелит, рак, энцефалиты, корь, свинка и другие заболевания человека; ящур, лейкозы, инфекционная анемия, псевдобешенство и др. – у животных; морщинистая и полосчатая мозаика картофеля, мозаика и стрик томата, мозаика табака и свеклы, желтуха свеклы, закукливание злаков и т.д.) оставались безнаказанными. Первые успехи в борьбе с вирусами пришли относительно недавно.

В клетке, инфицированной вирусом, вследствие его размножения нарушается обмен веществ. Это, как правило, приводит к зависящим от типа вируса изменениям структуры и функций клетки, состояния самой клетки, ее вида и условий окружающей среды. Возможны следующие варианты: 1) потеря способности к размножению, росту, что приводит к медленной гибели; 2) перерождение нормальной клетки в раковую; 3) слияние нескольких клеток в одну большую многоядерную клетку – симпласт.

Вирусы могут вызывать либо хроническую, либо острую инфекцию. В первом случае вирус, проникший в клетку, не выдает своего присутствия. Соответственно и инфицированная клетка по виду не отличается от нормальной. Вирус может интегрироваться в ДНК клетки и при делении передаваться ее потомству. Следовательно, клетка при делении воспроизводит вирус. Интегрированный вирус невозможно обнаружить и выделить из клетки.

Такие вирусные болезни, как оспа, грипп, полиомиелит, желтая лихорадка, подпадают под действие Международных санитарных правил или подлежат Международному надзору.

В 1886 г. Бьюст (John Brown Buist) обнаружил возбудителя оспы. В 1906 г. Э. Пашен предложил окрашивать вирионы специальной краской, позволяющей наблюдать их в световом микроскопе. Вирусы оспы довольно крупные и первыми были рассмотрены под микроскопом. Окрашенные вирионы получили название «тельца Пашена». Вирус оспы содержит двухцепочную линейную ДНК, размножается в цитоплазме клеток, образуя характерные включения (рис.4.3.14).

В прошлом оспа была самым опасным и распространенным заболеванием. Столетиями она свирепствовала в Азии, откуда в VI в. н.э. сарацины завезли ее в Европу. В XVI - XVIII вв. произошел наиболее убийственный «расцвет» оспы, тогда от этой болезни умирал каждый третий ребенок. В Европе в отдельные годы оспой заболевало до 12 млн человек, 1,5 млн человек умирало.

В 1796 г. в Беркли была открыта новая страница истории борьбы с оспой, связанная с именем английского врача Эдварда Дженнера (см. главу 4.4), который положил начало оспопрививанию. Однако не все в методе английского врача было безупречно. Для прививки использовали так называемую «гуманизированную лимфу», т.е. содержимое оспенных пузырьков человека, зараженного коровьей оспой. Прививку делали с ручки на ручку – от одного привитого ребенка к другому. В этом-то и была слабая сторона метода Дженнера. Кроме того, при оспопрививании существовала возможность заражения кожными болезнями.

В дальнейшем были разработаны новые методы получения вакцины против оспы. Для ее производства отбирали здоровых телят определенной масти и заражали их оспой. Перед заражением на боках и животе телят выбривали шерсть, тщательно мыли и дезинфицировали выбритые участки кожи. Через несколько дней созревали оспенные пузырьки, в которых накапливались вирусы. После сбора и специальной обработки оспенного материала получали готовую вакцину в виде прозрачной вязкой жидкости.

Большая заслуга нашего соотечественника М.А. Морозова состояла в разработке метода получения сухой вакцины против оспы. Преимущества ее очевидны: сухая вакцина более стойкая, имеет более длительный срок годности. Позже была создана новая сухая вакцина, получаемая при заражении вирусом оспы куриных эмбрионов.

В 1979 г. Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) констатировала полное исчезновение вируса натуральной оспы в природе (сохранились лишь образцы в Центре контроля и предотвращения болезней в Атланте (США) и Российском научном центре вирусологии и биотехнологии в Кольцово) и рекомендовала прекратить вакцинацию населения. В 1999 г. все вирусы оспы в лабораториях должны были быть уничтожены, но сохранены фрагменты ДНК. Тем не менее, ВОЗ имеет запас в 500 тыс. доз вакцины против оспы и будет его поддерживать.

В 1903 г. Рамленже доказал вирусную природу бешенства. Вирус бешенства относится к семейству рабдовирусов (возбудители бешенства, везикулярного стоматита у крупного рогатого скота и лошадей, а также других заболеваний у животных, от насекомых до млекопитающих, и растений). Вирион имеет пулевидную форму. Вирион окружен белково-липидной оболочкой, содержащей единственный гликопротеин, который является видоспецифичным антигеном, и содержит спиральный нуклеокапсид с единственной РНК, а также собственную РНК-полимеразу.

В природе бешенством болеют все теплокровные животные, в том числе и птицы. Инфекция передается при укусе больным животным. После укуса вирус распространяется по нервным стволам, достигает головного и спинного мозга, где, в основном, и происходит его размножение (рис.4.3.15). В цитоплазме нейронов мозга (чаще всего в нейронах аммонова рога) образуются включения, так называемые тельца Бабеша–Негри, содержащие специфический антиген. Затем вирус попадает в слюнные железы и за 1–3 суток до начала болезни начинает выделяться со слюной.

До конца XIX в. ничто не могло спасти человека от бешенства. Единственный способ, рекомендованный римскими целителями, – прижигание ран каленым железом

Пастер долго не решался начать вакцинацию людей, хотя многое было уже изучено. Ру и Шамберлан, его верные ученики, в этот период также отказались вакцинировать людей, считая прививки преждевременными. Но неожиданный случай изменил ситуацию. К Пастеру привели девятилетнего мальчика, Жозефа Мейстера, сильно искусанного бешеной собакой (раны на руке, голенях, бедрах, некоторые настолько глубокие, что мешали ходить). Смерть ребенка была неизбежна. Несчастная мать умоляла ученого вакцинировать сына. Пришлось сделать ребенку прививку, всегда удававшуюся на собаках. Мальчик был спасен. Это произошло 6 июля 1885 г. и стало знаменательной датой в истории пастеровских прививок против бешенства. Впоследствии Жозеф Мейстер стал сотрудником Института Пастера. Вторым пациентом ученого оказался 15-летний пастух Жюпиль, искусанный бешеным волком. Курс прививок спас жизнь и ему. Весть о спасении Мейстера и Жюпеля разнеслась по всему миру. За полтора года (к концу 1886 г.) 2,5 тыс. человек избежали мучительной и в прошлом неминуемой гибели от бешенства (рис.4.3.16).

Впервые грипп упоминается в документах ХII в., а первое достоверное описание эпидемии относится к пандемии 1610 г. С тех пор описана по крайней мере 31 пандемия гриппа. В России грипп был впервые зарегистрирован в 1886–1887 гг. В 1918–1920 гг., после окончания Первой мировой войны, вирус гриппа принес страшные бедствия. Пандемия гриппа, получившая название «испанки», унесла более 20 млн. жизней (в основном детей и молодых людей) – это намного превышает число погибших на всех фронтах. Первой мировой войны (рис.4.3.17).

Вирус гриппа относится к семейству ортомиксовирусов из группы миксовирусов. Вирионы миксовирусов имеют форму от сферической до нитчатой, покрыты белково-липидной оболочкой. Максимальная длина вириона варьирует от 60 до 300 нм. Вирионы содержат спиральный нуклеокапсид с 8 сегментами минус-нитевой РНК, соответствующими 8 генам. Такая РНК комплементарна информационной РНК и не может непосредственно участвовать в синтезе белков. Поэтому в вирионе содержится также РНК-зависимая РНК-полимераза (транскриптаза) – фермент, способный синтезировать иРНК, комплементарную вирусной, по которой и осуществляется синтез вирусных белков в инфицированной клетке.

В состав оболочки вирионов А и В входят два основных белка – гемагглютинин (H) и нейраминидаза (N) (рис.4.3.18), а в оболочке вириона С нейраминидазы нет. Нейраминидаза – фермент, расщепляющий полисахариды на внешней стороне клеточной мембраны и облегчающий проникновение вируса в клетку. Гемагглютинин легко связывается с муцином – белком на поверхности эритроцита, поэтому в присутствии миксовирусов (греч. myxo – мукус, производное муцина) эритроциты склеиваются, или агглютинируют. Эта реакция геммаглютинации – простой и надежный метод выявления и количественной оценки (титрования) вируса гриппа.

Рис. 4.3.18. Строение вируса гриппа

При изучении разнообразных вирусов гриппа было обнаружено восемь видов нейраминидазы и около 20 видов гемагглютинина. Мало того, обе нейраминидазы вирусов гриппа человека и обе нейраминидазы гриппа лошадей были выявлены у птиц. Затем было открыто еще четыре нейраминидазы птичьих вирусов гриппа. Гемагглютинины вирусов гриппа человека и животных, как правило, не совпадают, но есть и исключения.

В связи с быстрой изменчивостью вируса гриппа тотальная вакцинация населения оказалась неэффективной. В настоящее время ежегодные прививки против гриппа проводятся только тем людям, деятельность которых связана с повышенным риском заражения и распространения инфекции, а также больным, ослабленным и особенно восприимчивым к гриппу. Коммерческая вакцина обычно содержит вирус типа В и несколько подтипов вируса А.

Полиомиелит. Полиомиелит (от греч. polios – серый и myelos – костный или спинной мозг) – острое инфекционное заболевание (старое название – «детский паралич»), вызываемое одним из самых мелких вирусов – полиовирусом из семейства пикорнавирусов, не имеющих оболочки (суперкапсида) и содержащих РНК. Антитела, образующиеся в человеческом организме в ответ на вирусную инфекцию, специфичны к определенным участкам на поверхности вириона. В природе встречаются три антигенно различающихся серотипа полиовируса. Уникальность каждого серотипа определяется структурой четырех антигенных сайтов, формирующих три варианта. Вирус одного серотипа не может быть нейтрализован антителами, направленными против вирусов двух других серотипов. Вирус поражает центральную нервную систему, вызывая дегенеративно-воспалительный процесс в передних рогах спинного мозга и сером веществе подкорки.

Полиомиелит – заболевание, известное с древних времен. В храме богини плодородия Астарты в Мемфисе нашли выполненное за 1580 лет до н.э. изображение жреца Румы с типичным для полиомиелита поражением нижней конечности (рис.4.3.19). В 1900 г. Митчел обнаружил у хорошо сохранившейся мумии изменения костей, характерные для полиомиелита. В Гренландии при раскопках найдены скелеты, относящиеся к 500–600 гг. до н.э. и имеющие такие же изменения костей. Гиппократ (460–377 до н.э.) описал вспышку полиомиелита на острове Фарос.

В середине ХХ в. резко возросла заболеваемость полиомиелитом в США, Канаде, странах Южной Америки, Скандинавии и Центральной Европы. Появились сообщения о заболеваниях полиомиелитом в Индии, Сингапуре, Японии, Корее и на Филиппинах. В США эпидемия почти не прекращалась в период 1942–1953 гг., ежегодно паралич поражал до 20 тыс. человек. В 1956 г. было зарегистрировано более 300 тыс. инвалидов, перенесших паралитическую форму заболевания. Практически в то время инфицированию подверглось все население страны, т.к. на каждое заболевание с развитием паралича приходится от 100 до 1000 случаев бессимптомной инфекции.

В 1949 г. американский ученый Дж.Ф. Эндерс (John Frenklin Enders, 1897-1985) со своими сотрудниками Т.Х. Уэллером (Thomas Huckle Weller, род. В 1915 г.) и Ф.Ч. Роббинсом (Frederick Chapman Robbins, 1916-2003) разработали способ культивирования возбудителя полиомиелита в искусственной питательной среде. До этих работ единственным надежным источником вирусов были нервные ткани зараженных им обезьян. Однако вакцина, полученная из таких вирусных препаратов, оказалась опасной для здоровья людей. С другой стороны, считалось, что вирус может размножаться только в нервных клетках, а культуры этих клеток получать и поддерживать было чрезвычайно трудно. Эндерс, Уэллер и Роббинс смогли найти условия, при которых полиовирус хорошо размножался в культуре клеток эмбрионов человека и обезьяны. Таким образом, можно было получать большие количества полиовируса «в пробирке». За эти работы Эндерс, Уэллер и Роббинс были удостоены Нобелевской премии в 1954 г.

В 1947 г. проблемой получения сыворотки против полиомиелита занялся Джонас Эдвард Солк (рис.4.3.21). Ему удалось доказать, что существует три серотипа полиовирусов. При введении обезьянам смеси убитых вирусов всех типов заболевания не возникает, однако вырабатываются антитела, эффективные только против одного из трех типов полиовируса. После троекратного введения вакцины в крови обнаруживаются антитела ко всем серотипам вируса.

В 1954 г. под руководством Т. Фрэнсиса (впервые выделившего вирусы гриппа А и В и разработавшего поливалентную вакцину против гриппа) были проведены крупномасштабные (более 2 млн. детей) пробные прививки вакциной Солка. На основании результатов этих испытаний Департамент здравоохранения США разрешил применение вакцины для иммунизации населения. Однако вскоре после начала вакцинации (в 1955 г.) в результате прививок 46 детей заболели полиомиелитом, и применение вакцины было приостановлено. Оказалось, что заболевание, вызванное прививками, – несчастный случай: по недосмотру работников лаборатории (Cutter Laboratories), изготовившей эту партию вакцины, в ампулы попали живые полиовирусы (рис.4.3.22). Менее чем через месяц прививки возобновились.

Настало время изготовления прививочного материала в больших количествах. Теперь не нужно было делать уколы, вирусы попадали в организм в виде таблетки, после чего легко размножались в кишечнике. В результате в организме человека вырабатывался не только системный иммунитет, но и локальный, в кишечнике, что надежно защищало не только от заболевания полиомиелитом, но и от вирусоносительства.

После тщательной проверки в 1960 г. Департаментом здравоохранения США была одобрена и разрешена к применению вакцина Сэбина, и с тех пор она стала основным методом профилактики заболевания полиомиелитом во всем мире (рис. 4.3.23). Важно подчеркнуть, что если раньше каждый больной полиомиелитом был источником инфекции, то после прививки человек не только застрахован от заболевания, но и способствует иммунизации других людей. Поскольку в кишечнике привитого человека размножаются ослабленные полиовирусы, то выделяемый им вирус не опасен для здоровья и при попадании в организм другого человека вызывает формирование иммунитета к полиомиелиту.

Окончательное признание живая вакцина получила после того, как в СССР в результате работ замечательных ученых М.П. Чумакова (рис.4.5.24) и А.А. Смородинцева были проведены массовые прививки в 1955–1959 гг., когда в нашей стране сложилась чрезвычайная обстановка по заболеваемости полиомиелитом. В короткий срок была освоена технология производства вакцины в виде конфетки-драже с живой поливакциной. В результате массовой вакцинации заболеваемость полиомиелитом в 1965 г. по сравнению с 1958 г. снизилась в 50 раз. Затем наблюдались лишь отдельные случаи заболевания или вирусоносительства. Вакцина, созданная в нашей стране, была передана для борьбы с полиомиелитом в Японию и ряд других стран.

В 1911 г. американский ученый Пейтон Раус (рис.4.3.25) обнаружил, что куриная саркома может перевиваться не только клетками, но субмикроскопическими агентами, экстрагируемыми из клеток. Хотя поначалу другие ученые не приняли открытия Рауса, многочисленные эксперименты в последующие годы доказали его правоту, и в 1966 г. Раус был удостоен Нобелевской премии по физиологии и медицине (Раус говорил, что Нобелевскую премию может получить любой ученый, если проживет достаточно долго). Во всем мире теперь эта саркома известна как саркома Рауса. В течение 25 лет после открытия Рауса было описано 18 вирусов, вызывающих саркомы у птиц.

В 1933 г. Р. Шоуп (Richard Shope) открыл вирус папилломы, поражающий кроликов в Северной Америке. У диких кроликов вирус обычно вызывает развитие доброкачественной опухоли, а у домашних кроликов вызванные им папилломы практически всегда перерождаются в злокачественные опухоли.

Впоследствии вирусы, вызывающие разнообразные виды рака у животных стали выделять все чаще и чаще. Один из видов паповавирусов, вирус полиомы, широко распространен у диких мышей, у которых он не вызывает видимых заболеваний. Однако при выращивании на культуре тканей и последующем введении в достаточном количестве новорожденным мышам, хомякам, морским свинкам или кроликам может вызывать развитие злокачественных опухолей. Название этот вирус получил за способность вызывать образование 23 видов опухолей легких, щитовидной железы, плевры, почек, надпочечников, желудка, зобной железы, молочной железы и слизистых оболочек у различных линий мышей. Вирус обладает высокой антигенной активностью, и у всех животных с опухолями всегда обнаруживаются нейтрализующие вирус антитела. Еще один онкогенный (вызывающий рак) вирус из этого семейства – вирус симиан-40 (SV40) (рис.4.3.26), был выделен впервые от африканской зеленой мартышки, в клетках которой он быстро размножался и вызывал их гибель. Этот вирус не может размножаться в клетках грызунов или человека, однако иногда приводит к их злокачественной трансформации.

Рис. 4.3.26. SV40 (Simian Virus 40, «вирус обезьян 40») – полиомавирус, геном которого представлен кольцевой молекулой ДНК, содержащей 5 генов
Мышиный лейкоз сыграл важную роль при исследовании строения и размножения онкогенных вирусов. Электронно-микроскопическое изучение вируса показало, что он имеет почти сферическую форму и состоит как бы из двух концентрических оболочек: наружной с диаметром около 90 нм и внутренней с диаметром 50 нм.

В 80-х гг. ХХ в. усиленно изучался вопрос о связи между вирусами и раком у человека. Долгое время ученые не могли доказать, что в клетках раковой опухоли есть вирусы, которые после выделения могут вызывать злокачественную трансформацию (малигнизацию) клеток человека. Однако постепенно такие данные накопились. Было показано, что в мозге больного лейкозом содержится фактор, вызывающий ускорение развития этого заболевания. Затем удалось доказать вирусную этиологию лимфогрануломатоза.

В настоящее время установлено, что к вирусам, причастным к раковым заболеваниям человека, относятся ДНК-содержащие вирусы (вирусы Эпштейна–Барр и другие герпес-вирусы, гепатита В и несколько вирусов папиллом) и ретровирусы (вирусы Т-клеточного лейкоза). Кроме того, в геномах человека и животных имеются специфические гены, так называемые протоонкогены. Сами по себе протоонкогены рака не вызывают, но при их мутациях начинается развитие заболевания. Такие мутации могут быть вызваны не только радиацией или химическими мутагенами, но и встраиванием вирусной ДНК в геном клетки в непосредственной близости от протоонкогенов. К вирусам, подозреваемым в способности вызывать рак, таким образом, относятся, например, аденовирусы, вирусы SV40 и некоторые другие.

В 1946 г. выдающийся советский вирусолог Лев Александрович Зильбер (рис.4.3.27) предложил вирусогенетическую теорию рака. Согласно этой теории, вирусы вызывают рак, но в отличие от других заболеваний вирусного происхождения рак – патологический процесс, а не инфекционный. При онкогенезе ДНК вирусного происхождения внедряется (интегрируется) как фрагмент в ДНК клетки и становится составной частью клеточного генома. Поэтому при электронно-микроскопическом исследовании опухолей далеко не всегда в их клетках можно обнаружить вирус. Эта интеграция – начальное звено в цепи процессов превращения нормальной клетки в раковую.

Большую роль в развитии рака может играть действие химических и физических канцерогенов, а также старение организма. У кур, зараженных вирусом птичьей оспы, при смазывании кожи метилхолантреном развивается рак кожи. Нанесение дегтя на кожу кролика, зараженного вирусом папилломы Шоупа, сокращает латентный период и увеличивает частоту образования опухолей.

Среди опухолеродных вирусов есть ДНК- и РНК-содержащие. Объяснение возникновения рака интеграцией вирусного и клеточного геномов, данное Л.А. Зильбером, было понятно для ДНК-содержащих вирусов. Однако его теория сталкивалась с большими трудностями в случае онкогенных вирусов, содержащих РНК, поскольку вирусная РНК не может встраиваться непосредственно в геном клетки. Между ДНК- и РНК-содержащими опухолеродными вирусами существуют кардинальные различия. При заражении клеток ДНК-содержащими вирусами происходит либо репликация, приводящая к инфекции, либо интеграция геномов, приводящая к трансформации клетки. РНК-содержащие вирусы индуцируют только трансформацию нормальной клетки в злокачественную, т.е. при заражении клетки таким вирусом должна происходить интеграция их геномов.

Только в 1970 г. американские ученые Г. Темин (Howard Martin Temin, 1934–1994) и Мицутани (Satoshi Mitsutani) и независимо от них Д. Балтимор (David Baltimore; род. в 1938 г.) разрешили эту загадку. Они доказали возможность передачи генетической информации от РНК к ДНК. Это открытие перевернуло центральную догму молекулярной биологии о том, что генетическая информация может переноситься только в направлении ДНК–РНК–белок. Пять лет понадобилось Г. Темину для обнаружения фермента, осуществляющего перенос информации от РНК к ДНК, – РНК-зависимой ДНК-полимеразы. Этот фермент получил название обратной транскриптазы. Г. Темину удалось не только получить фрагменты ДНК, комплементарные заданной цепи РНК, но и доказать что ДНК-копии могут встраиваться в ДНК клеток и передаваться потомству.

Группа РНК-содержащих вирусов, в цикле развития которых по геномной РНК с помощью обратной транскриптазы осуществляется синтез ДНК, встраивающейся затем в геном клетки хозяина, получила название ретровирусов (Retroviridae – от REversed TRanscription) (рис.4.5.28). В семейство ретровирусов входят вирусы саркомы Рауса, миелоцитоматоза, саркомы мышей Харви и Молони, лейкоза птиц, ретикулоэндотелиоза птиц, лейкоза мышей, Т-клеточного лейкоза человека, иммунодефицита человека.

У ДНК- и РНК-содержащих опухолеродных вирусов по-разному реализуется генетическая информация. ДНК-содержащий вирус, интегрированный в геном клетки, для начала самостоятельного существования должен физически «вырезаться» из генома клетки, а клетка должна вирус потерять. У РНК-содержащих вирусов «вырезания» не требуется – его заменяет транскрипция. Это связано с тем, что РНК, образующаяся при транскрипции с интегрированного в ДНК клетки генетического материала вируса, представляет собой вирусную РНК. Поэтому геном клетки, интегрировавший гены РНК-содержащих вирусов, их никогда не теряет.

Вирусная ДНК, встроившаяся в геном эукариотической клетки-хозяина, может в течение многих поколений никак себя не проявлять. Однако при определенных условиях вирусные гены могут активироваться и вызывать либо репликацию вируса, либо превращение клетки в раковую.

Многочисленные работы, проведенные в 1970–1980-х гг. показали, что у многих видов животных есть гены, похожие, но не совпадающие с генами ретровирусов. Эти гены животных и человека иногда называют эндогенными ретровирусами (HERV), или провирусами. Обычно HERV не активны и менее онкогенны для вида-хозяина, чем экзогенные. Возможно, вызывающие рак гены ряда ретровирусов когда-то, на ранних этапах биологической эволюции, закрепились в ДНК предков вида-хозяина. При репликации всей ДНК клетки онкогены передавались из поколения в поколение. По оценкам ученых HERV появились в геноме предков человека приблизительно 50 млн лет назад.

Опухолеродные вирусы, как правило, видоспецифичны, т.е. поражают животных только определенного вида. Но из каждого правила есть исключения. Например, вирусом куриной саркомы можно заразить крыс, кроликов, хомячков, обезьян, ящериц и даже змей. Группа ученых под руководством Б.А. Лапина установила, что вирус лейкоза человека может вызывать сходное заболевание у двух видов обезьян. Это привело к созданию экспериментальной модели для изучения всех стадий развития заболевания, начиная с самых первых этапов.

Онковирусы могут принимать участие в развитии иммунологических заболеваний. Так, при изучении красной волчанки методом молекулярной гибридизации было показано, что в ДНК клеток пораженных болезнью тканей имеются последовательности, комплементарные РНК вируса кори и обратная транскриптаза. Это указывало на экспрессию онковируса в клетках больных волчанкой. На основании полученных данных было высказано предположение, что на начальных стадиях заболевания происходит взаимодействие коревого вируса с латентным онковирусом. В результате обратная транскриптаза онковируса транскрибирует коревую РНК в ДНК, которая затем встраивается в геном клетки. Экспрессия этих дополнительных генов проявляется в синтезе специфических вирусных белков, часть из которых встраивается в мембраны клеток и изменяет их свойства. Эти клетки становятся чужеродными для организма и подвергаются атаке собственной иммунной системы. Онковирусы могут активироваться также при трансплантации (пересадке) тканей.

Возможно, онковирусы – нормальные компоненты организма, принимающие участие в процессах клеточного цикла, дифференциации и пролиферации. Тогда старение, действие физических и химических канцерогенов может вызвать развитие рака. Однако присутствие канцерогенов нехарактерно для естественной среды обитания, а заболевание особей, вышедших из репродуктивного периода, не может отразиться на судьбе популяции. В то же время, интегрированный в геном клетки онковирус со слабыми онкогенными свойствами может защитить клетку от родственного высокоактивного вируса.
4.3.9. Применение вирусов
Первые опыты по «приручению» вирусов были поставлены на фагах – «пожирателях» бактерий. При встрече с вирусами бактерии «тают» на глазах. Вот эту способность фагов и решили использовать для предупреждения и лечения инфекционных болезней. Но оказалось, что в организме человека фаги не так быстро и активно расправляются с бактериями, как в пробирке. Мало того, бактерии не так уж «глупы» – они быстро становятся нечувствительными к действию фагов.

Рис. 4.3.28. Жизненный цикл ретровируса

После появления антибиотиков использование фагов в борьбе с инфекционными заболеваниями стало и вовсе нецелесообразным. Способность фагов лизировать (растворять) только определенные бактерии стали применять для диагностики. Бактерии, выделенные из организма больного, выращивают на питательной среде в чашках Петри. Затем вносят туда фаги разных бактерий (холерных, дизентерийных, брюшнотифозных и т.п.), а через сутки, просматривая чашки на свет, легко определить, какой фаг вызвал растворение бактерий, т.е. определить и возбудителя болезни. Однако более точные данные, при том гораздо быстрее, получают с помощью иммунохимических методов.

Но не только фаги могут быть полезны человеку. Так, в Австралии в середине 1960-х гг. сельскому хозяйству большой ущерб наносили сильно размножившиеся дикие кролики. Отстрел кроликов оказался неэффективным. Тогда ученые применили «летающие смертоносные иглы» – комаров, «начиненных» болезнетворным вирусом. Этот вирус был безвреден для человека, а кролики были уничтожены.

Гусеницы и жуки-пилильщики наносят ущерб сельскому хозяйству не меньший, чем кролики. В борьбе с ними ученые использовали вирусы полиэдроза и гранулоза насекомых. В Калифорнии (США) при борьбе с гусеницами на полях люцерны и в Канаде при уничтожении соснового пилильщика эти вирусы распыляли с самолетов. Поля и леса были спасены.

Полезное применение нашла также способность вирусов проникать в клетку и модифицировать ее геном. Оказалось, что вирусы, а точнее их геном, можно применять для лечения или коррекции наследственных заболеваний. Использованию вирусов для этой цели предшествовали достижения молекулярной биологии и генетики в изучении тонкой структуры генов эукариот и их картирование на хромосомах млекопитающих и человека.

Генная терапия занимается лечением наследственных и ненаследственных (инфекционных) заболеваний введением генов в клетки пациентов для исправления генных дефектов или придания клеткам новых функций. Первые попытки лечения моногенных заболеваний при помощи генной инженерии были проведены в 1989 г.
4.3.10. Интерферон
Еще в начале XIX в. Дженнер, наблюдая за действием противооспенных прививок, обратил внимание на загадочный факт: больные герпесом были невосприимчивы к вакцине против оспы. Позже сходное явление было установлено для вируса желтой лихорадки. В природе существует две разновидности этого вируса: один вызывает легкую форму, другой – тяжелую. Опыты на обезьянах показали, что при введении сначала первого вируса, а затем второго животные остаются здоровыми. Контрольные обезьяны, которым вводили только второй вирус, все погибали.

Такое антагонистическое взаимодействие между вирусами ученые назвали интерференцией. Опыты по интерференции вирусов проводили на обезьянах, кроликах, морских свинках, мышах, крысах с самыми разными вирусами. Оказалось, например, что вирус оспы может интерферировать с вирусом ящура, а вирус гриппа – с вирусом желтой лихорадки. Затем выяснилось, что не все вирусы интерферируют друг с другом. Например, если обезьяне, чувствительной к полиомиелиту, ввести вирус чумы собак, а затем заразить полиомиелитом, то она не заболеет. Если же обезьяне ввести вирус оспы, а затем полиомиелита, то животное заболеет полиомиелитом и погибнет. Поиски безопасных для человека вирусов, которые могли бы интерферировать с болезнетворными вирусами, привели к важному открытию. Оказалось, что не только живые, но и убитые вирусы могут интерферировать с живыми.

Со временем число известных пар взаимно несовместимых вирусов росло, но механизм интерференции оставался неизвестным. Только в 1957 г. английские ученые А.Айзекс и Ж.Линденман открыли образование в клетках при вирусных инфекциях особого вещества, защищающего клетки от вирусов. Вспомним, в то время разразилась пандемия азиатского гриппа. Айзекс и Линденман в поисках эффективных средств защиты от заболевания обнаружили, что с вирусом гриппа интерферирует культуральная среда. Оказалось, что интерференция вызвана низкомолекулярным белком, вырабатываемым клетками при взаимодействии с вирусом. Это вещество назвали интерфероном.

В середине 1960-х гг. ученые установили, что многие клетки позвоночных, включая человека, могут производить интерферон сами по себе, но обычно синтез интерферона включается в ответ на вирусную инфекцию, химические воздействия, а также при иммунных реакциях. Обычно интерферон видоспецифичен, т.е. активен только в тех организмах, из которых получен. Стимуляцию синтеза интерферона вызывает попадание в клетку чужеродной нуклеиновой кислоты (ДНК или двухцепочечной РНК), вирусов, а также воздействие некоторых веществ.

Когда интерферон был открыт, считалось, что это одно вещество. Позже было показано, что разные клетки организма синтезируют разные виды интерферона, которые принято обозначать греческими буквами: , , . Все виды интерферона – белки с молекулярной массой 25–100 кДа (рис.4.3.29).

Интерферон 	Интерферон 	Интерферон 

Рис. 4.3.29. Структуры интерферонов человека.

Интерфероны типа I производятся почти любыми клетками (-интерферон – лейкоцитами, -интерферон – клетками тканей и фибробластами). Недавно обнаружены еще два интерферона, относящиеся к типу I. Интерфероны типа I не убивают вирусы, а повышают сопротивляемость клеток к инфекциям. При воздействии на клетку интерферона она вырабатывает специальные белки, которые подавляют различные стадии синтеза вирусных белков. Поскольку зараженная вирусом клетка выделяет интерферон в окружающую среду, у соседних клеток также повышается сопротивляемость инфекции.

В настоящее время интерфероны относят к семейству белков-цитокинов, которые выполняют сигнальные функции в клетках. Свойства интерферонов позволяли надеяться, что их можно будет эффективно использовать в борьбе с вирусами и раком. Однако в естественных условиях клетки вырабатывают интерферон в очень малых количествах. С развитием биотехнологии удалось получить рекомбинантные кишечные палочки E.coli, геном которых содержит гены интерферонов. Теперь интерфероны производятся в промышленных масштабах (рис.4.3.30).

Рис. 4.3.30. Продажный препарат интерферона
Применение интерферонов в больших дозах вызывает выраженные побочные эффекты: гриппоподобное состояние, выпадение волос, ослабление зрения, аритмии, спазмы венечных сосудов сердца, угнетение функции костного мозга, поэтому применение интерферонов показано в основном при тяжелых заболеваниях. Так, -интерферон применяют при лечении некоторых видов лейкемий, гепатитов В и С, некоторых кондилом, в больших дозах – для лечения саркомы Капоши, которая часто встречается у больных СПИДом. При некоторых формах рассеянного склероза применяют -интерферон, а -интерферон – при хроническом грануломатозе. Несмотря на побочное действие, интерфероны применяют и для лечения таких заболеваний, как грипп, различные герпесные заболевания (стоматит, опоясывающий лишай и т.п.), энцефалиты, полиомиелит, цитомегаловирусная инфекция.

Более целесообразно использование индукторов синтеза интерферонов – веществ, вызывающих усиленный синтез интерферона. Среди них обнаружены вещества, являющиеся также стимуляторами специфического иммунитета. Наиболее эффективные индукторы применяют в клинике: полудан – при тяжелых вирусных заболеваниях глаз, мегосин – при половом герпесе.