Глава 4. СТАНОВЛЕНИЕ И РАЗВИТИЕ СОВРЕМЕННОЙ БИОЛОГИИ (С СЕРЕДИНЫ XIX В. ДО НАЧАЛА XXI В.)

В первой половине XX в. были сделаны кардинальные открытия, по­зволившие построить общую схему обмена веществ, установить природу ферментов и исследовать их важнейшие свойства, значительно расширить знания о других биологически активных соединениях. В 40—50-е годы быстрыми шагами пошло развитие и усовершенствование биохимических методов исследования. В настоящее время биохимия определяется как «наука, изучающая состав организмов, структуру, свойства и локализа­цию обнаруживаемых в них соединений, пути и закономерности их обра­зования, последовательность и механизм превращений, а также их биоло­гическую и физиологическую роль».

Биохимические исследования охватывают очень широкий круг про­блем: по существу сейчас нет ни одной отрасли теоретической или при­кладной биологии и медицины, которая не была бы теснейшим образом связана с биохимией.
4.1.1. Первые попытки создать специфическую физику и химию живого
В то время как виды на протяжении их изучения постоянно подвергались классификации, наука о жизни получила новое и исключительно плодотворное направление. Химия вступила в свой революционный период, и химики начали применять технологии к живым организмам так же, как и к неживым системам. То, что эти понятия находят практическое применение, доказала теория пищеварения.

Переработка пищи животными организмами — процесс, относительно открытый для исследования. Он происходит не внутри самих животных тканей, а в пищеварительных каналах, выходящих во внешний мир. Этот процесс проходит непосредственно через ротовую полость. В XVII в. горячо обсуждался вопрос о том, является ли пищеварение физическим процессом (как полагал Борелли), при котором желудок перемалывает пищу, или химическим, при котором желудок изменяет ее химически посредством желудочных соков (как полагал Сильвиус).

Французский физиолог Рене Антуан де Реомюр (1683—1757) исследовал способы тестирования. В 1752 г. он провел эксперимент: поместил сырое мясо в малый металлический цилиндр, открытый с обоих концов, но с защитной металлической сеткой (мясо не могло вывалиться), и скормил цилиндр коршуну. Через металлическую сетку мог проникать желудочный сок. Металл цилиндра защищал мясо от любого механического воздействия. Обычно коршуны отрыгивают любое инородное тело, оказавшееся в пищеводе, аналогичным образом поступил и подопытный коршун. При анализе мясо, находившееся в цилиндре, оказалось частично разложившимся.

Реомюр не остановился на достигнутом: он скормил коршуну губку, из которой после отрыгивания были выделены пропитавшие ее желудочные соки. Их смешали с мясом. Мясо медленно, но разложилось под действием соков. Таким образом, спорный вопрос был прояснен. Пищеварение было объявлено процессом химическим, а значение в жизни химии сильно возросло в глазах человечества.

В XVIII в. ван Гельмонт начал интенсивно изучать газы. Необходимость изучения давно назрела. Английский ботаник и химик Стивен Хейлз (1677 — 1761) стал одним из основателей физиологии растений, он первым выяснил, что большой вклад в питание растений вносит двуокись углерода. В 1774 г. Джозеф Пристли (1733— 1804) открыл газ, названный кислородом и обнаружил экспериментально, что им приятно и легко дышится и что, в частности, подопытные мыши исключительно резвы, будучи помещены в кислород под колокол. Далее последовало открытие, что растения увеличивают содержа­ние кислорода в воздухе. Голландский физиолог Жан Ингенхуз (1730—1799) дополнил его открытием, что растения производят кислород и поглощают углекислый газ только на свету.

Величайшим химиком XVIII века стал француз Антуан Лоран Лавуазье (1743 — 1794). Он подчеркивал важность точных измерений и использовал их для разработки теории горения, которой с тех пор пользуются в химии. По этой теории, горение — это процесс химического соединения горючего материала с кислородом воздуха. Он также доказал состав воздуха: кроме кислорода, в него в основном входит азот — газ, не поддерживающий горения.

«Новая химия» Лавуазье положила начало практическому приложению химии. Когда под колоколом горит свеча, потребляется кислород воздуха и возрастает содержание углекислого газа. Последнее вещество образуется посредством соединения кислорода с углеродом. Как только содержание кислорода под колоколом падает до критически низкого, свеча гаснет. Аналогична ситуация с животной жизнью. Мышь, помещенная под колпак, потребляет кислород и производит углекислый газ; последний образуется в результате соединения углерода тканей с кислородом. Поскольку содержание кислорода внутри колпака падает, мышь погибает от удушья. Если оценить эту ситуацию в целом, то растения потребляют углекислый газ и производят кислород, а животные, наоборот, потребляют кислород и производят углекислый газ.

Таким образом, вместе растения и животные поддерживают химическое равновесие, и в обозримом будущем соотношение в атмосфере кислорода (21 %) и углекислого газа (0,03 %) останется стабильным.

Поскольку свеча и животное воздействовали на суммарную атмосферу под колпаком одинаково, Лавуазье резонно предположил, что дыхание является формой горения. Таким образом, когда потребляется определенное количество кислорода, выделяется определенное количество тепла — будь то свеча или мышь. Хотя измерения были, принимая во внимание возможности того века, достаточно грубыми и приблизительными, но они подтверждали теорию.

Тем самым был нанесен мощный удар по механистическому пониманию жизни: выяснилось, что в живой и неживой природе идут одни и те же химические процессы. Однако тем очевиднее становилось, что живой и неживой природой управляют одни и те же законы, на чем настаивали сторонники механистической теории.

Точка зрения Лавуазье укрепилась по мере развития физики в первой половине XIX в. В то время тепло и тепловая теория исследовались несколькими учеными, чей интерес был «подогрет» растущим значением парового генератора. Тепло можно было заставить совершать работу, с ним связаны и другие физические явления: например, падение тел, течение воды, движение воздуха, свет, электричество, магнетизм и т. д. В 1807 г. английский физик Томас Янг (1773 — 1829) предложил для представления обо всех этих явлениях термин «энергия» (от греч. «работа, совершаемая изнутри»).

Физики первой половины XIX в. занялись изучением того, каким образом одна форма энергии может трансформироваться в другую; производили точные измерения таких изменений. К 1840-м годам, по меньшей мере, трое ученых выдвинули концепцию «сохранения энергии». Это были: англичанин Джеймс Прескотт Джоуль (1818 — 1889) и немцы Юлиус Роберт фон Мейер (1814 — 1878) и Герман Людвиг Фердинанд фон Гельмгольц (1821 — 1894). В соответствии с этой концепцией, одна форма энергии свободно переходит в другую; однако общее ее количество в процессе перехода нельзя ни увеличить, ни уменьшить.

Для такого общего закона, основанного на широком разнообразии точных измерений, было бы естественным базироваться как на примерах живой природы, так и неживой. Тот простой факт, что ни одно живое существо не может поддерживать жизни, не черпая энергию из пищи, доказывал, что энергия не получается «из ничего». Растения не едят и не дышат аналогично животным, однако они черпают энергию из света.

Именно Мейер установил, что источником разных форм энергии на Земле является радиация и тепло Солнца; аналогично растениям, потребляющим энергию Солнца непосредственно, животные организмы потребляют ее же в виде пищи. Прямым источником энергии для растений и — через растения — для животных является энергия Солнца.

Эти смутные догадки росли в числе и утверждались, пока во второй половине XIX в. не было доказано, что закон сохранения энергии так же строго приложим к живой природе, как и к неживой.
4.1.2. Создание теорий химического строения, жиров, углеводов и белков
Такие вещества, которые содержатся в почве, море, воздухе, тверды, стабильны и неизменны. Вода, будучи подогретой, закипает и испаряется, но пар вновь можно остудить и превратить в воду. И железо, и соль можно перевести в жидкое состояние, как и вновь, сделать твердыми, В то же время вещества, получаемые из живых организмов — растений, — например, сахар, бумага, рас­тительное масло, — характеризуются теми же непрочностью и нежностью консистенции, которыми обладали их содержащие организмы. При нагревании они дымятся, сгорают и тем самым претерпевают необратимые изменения; дым и пепел бумаги не обратятся в бумагу вновь. Значит, можно предположить, что мы имеем дело с двумя различными вариациями материи.

Шведский химик Берцелиус (рис.4.1.1) предложил в 1807 г. вещества, получаемые из живых (либо когда-то бывших живыми) организмов, называть «органическими веществами», а иные — «неорганическими веществами». Он предположил, что, в то время как возможно конвертировать (и достаточно легко) органические вещества в неорганические, обратное изменение невозможно. Чтобы это изменение произошло, должна присутствовать некая живая сила, которой харак­теризуется лишь живая материя.

Это открытие воодушевило других ученых на то, чтобы синтезировать органические вещества из неорганических, и вскоре пришел успех. Французский химик Пьер Эжен Марселей Бертло (1827 — 1907) окончательно разрушил стену между органическими и неорганическими веществами. Он синтезировал некоторые хорошо известные органические вещества, например метиловый спирт, этиловый спирт, метан, бензол, ацетилен, из чисто неорганических веществ.

С развитием соответствующих аналитических методик в первых декадах XIX в. химики обнаружили, что органические вещества состоят главным образом из углерода, водорода, кислорода и азота. Вскоре они выявили и последовательность сочетания атомов, при котором эти вещества приобретают свойства органической субстанции.

Во второй половине XIX в. появилось уже множество синтезированных органических веществ; органическая химия не оставалась более наукой о веществах, образованных жизненными формами. Однако деление химии как науки на две части оставалось; только органическая химия стала именоваться «химией углеродных соединений». Жизнь как таковая уже не связывалась с ней.

В 1827 г. английский физиолог Уильям Прут (1785-1850) впервые назвал группы сложных органических соединений, содержащихся в живых организмах: гидрокарбонаты (углеводы), липиды (жиры), протеины (белки). Гидрокарбонаты, включающие сахара, крахмалы, целлюлозу, со­ставлены из углерода, водорода и кислорода, как и липиды (включающие жиры и масла). Гидрокарбонаты, впрочем, относительно богаты кислородом, в то время как липиды бедны им. Гидрокарбонаты либо растворимы в воде, либо растворимы первона­чально в кислотах, в то время как липиды нерастворимы в воде.

Решение проблемы строения и синтеза жиров связано с именем М. Бертло. Начав исследования глицерина и его производных, он установил в 1854 г., что глицерин является многоатомным спиртом. Берт­ло синтезировал его моно-, ди- и триацетаты. Синтезировав затем ряд аналогичных эфиров, он окончательно установил, что природные жиры представляют собой сложные эфиры жирных кислот (рис.4.1.2).

Гораздо более сложным оказалось исследование строения другой груп­пы природных веществ — Сахаров. Наибольший успех в исследованиях углеводов выпал на долю немец­кого химика Эмиля Фишера (рис.4.1.3). В 1890 г. он предложил простую номенклатуру углеводов. Используя открытый им фенилгидразин, Фишер разработал метод превращения альдогексоз в кетогексозы, например, глюкозы во фруктозу, позволивший установить различия и тождество конфигураций групп СНОН у различных гексоз.

Рис. 4.1.2. Тристеарин – пример триацилглицерола (природного жира).


Рис. 4.1.3. Эмиль Херманн Фишер (1852 — 1919)
В продуктах конденсации, полученных по Бутлерову и Лёву, Фишер открыл D, L-фруктозу, для получения которой он разработал новый ме­тод — синтез из формальдегида и глицеринового альдегида в присутствии щелочи. Фишер разработал также ряд других методов синтеза альдогек­соз, полностью подтвердивших выдвинутые им представления о строении Сахаров (Нобелевская премия, 1902).

После изучения углеводов и исследований соединений пуриновой груп­пы (аденин, гуанин, мочевая кислота, кофеин, теобромин, гипоксантин и др.) Фишер приступил к анализу аминокислот и белков.

Протеины, однако, наиболее сложные из этих трех групп, наиболее легко разрушаемые, а также являют собой саму характеристику жизни. Протеины содержат азот и серу, а также углерод, водород, кислород и, хотя обычно растворимы в воде, коагулируют и становятся нерастворимыми при общем нагре­вании. Поначалу их называли альбумино-подобными субстанциями, поскольку единственным общеизвестным примером был белок куриного яйца (по-латински «альбумин»).

Приступая к систематическому изучению белков, Э. Фишер исходил из представления, что белки построены только из аминокислот, и попы­тался доказать наиболее вероятное, с его точки зрения, амидное соеди­нение аминокислотных остатков. Он разработал метод разделения смесей аминокислот (так называемый эфирный метод) и использовал его для выделения и индентификации отдельных аминокислот из продуктов кис­лотного, щелочного или ферментативного разложения белков. После этого он перешел к решению ключевого вопроса о характере связей отдель­ных аминокислот в молекуле белка. Фишер пошел при этом по новому пути. Вместо применявшегося ранее исключительно аналитического метода исследования он использовал метод синтеза: он добивался получе­ния из аминокислот все более и более сложных соединений и пытался их идентифицировать с продуктами частичного распада белковой моле­кулы — пептонами. Разработав в течение 1902—1919 гг. несколько методов синтеза соеди­нений аминокислот, так называемых пептидов и полипептидов различного строения, среди которых был, в частности, октадекапептид, состоящий из 18 аминокислотных остатков, Фишер доказал, что основным типом связи аминокислот в молекуле белка является амидная связь между аминогруп­пой одной аминокислоты и карбоксилом другой. Эту связь Фишер назвал пептидной (рис.4.1.4). Пептидная теория удачно объяснила многие основные свойства белковых веществ — как химические и физико-химические, так и биологи­ческие.

Рис. 4.1.4. Образование пептидной связи в белках

Более того, ученым в середине XIX веке стало ясно, что сложную структуру гидрокарбонатов, липидов, протеинов можно в процессе пищеварения разложить на относительно простые «кирпичики». Эти кирпичики одни и те же для всех видов, и все отличия сосредотачиваются в способе их комбинации. В процессе потребления одним организмом других (процессе пищеварения) кирпичики складываются в сложные вещества, которые и составляют суть питания.

С химической точки зрения, жизнь во всех вариациях, несмотря на разительные внешние различия, одна и та же. А если так, то эволюционные изменения одних видов в другие — дело деталей, и эта точка зрения утвердила правдоподобность эволюционной концепции.
4.1.3. Появление калориметрии
Ю. Либих полагал, что гидрокарбонаты и липиды — горючие вещества организма, так же как они бывают горючими, будучи брошены в огонь. Это символизировало продвижение взглядов Лавуазье, выработанных полвека ранее. Лавуазье говорил об углероде и водороде, а сейчас можно было более специфично говорить о гидрокарбонатах и липидах — и те и другие состоят из углерода и водорода (плюс присоединенные радикалы кислорода).

Взгляды Либиха воодушевили других ученых на попытки определить, соответствует ли количество тепла, полученное от такого «топлива», аналогичному, если топливо будет сожжено вне тела, в окружающем пространстве. Со временем методики стали более тонкими, эксперимент усложнялся.

Устройства, которые позволяли бы измерить количество тепла, полученного от сожженных органических компонентов, были разработаны в 1860-х годах. Бертло использовал такое устройство (калориметр) для измерения тепла, произведенного сотнями реакций. В обычном калориметре горючее вещество смешивается с кислородом в закрытой камере и смесь взрывается электрическим взрывателем. Камера окружена водой. Вода поглощает тепло, полученное при взрыве, и в зависимости от повышения температуры воды можно определить количество выделившегося тепла (рис.4.1.5).

Немецкий физиолог Карл фон Войт (1831 — 1908), ученик Либиха, совместно с химиком Максом фон Петтенкофером (1818 — 1901) с помощью калориметрии показали, что у живой ткани нет иного источника энергии, чем тот, что наполняет неживую природу. Макс Рубнер (1854 — 1932), ученик Войта, доказал, что гидрокарбонаты и липиды — не единственные виды топлива для организма. Молекулы протеина также могут служить топливом после того, как от них отняли азот. В 1894 г. он показал, что количества тепла, выделяемые при поедании пищи и при обычном ее сжигании, практически одинаковы. Закон сохранения энергии выполнялся как для живой, так и для неживой природы — значит, витализм был разгромлен.

Русский химик Константин Готлиб Сигизмунд Кирхгоф (1764-1833) в 1812 г. показал, что если прокипятить крахмал вместе с разведенной кислотой, то он распадется до глюкозы — простого сахара. Этого не случится, если кислота отсутствует, и все же кислота, как таковая, не принимает участия в реакции. Четырьмя годами позже английский химик Гемфри Дэви (1778-1829) обнаружил, что платиновые провода провоцировали соединение спиртов с кислородом. Сама платина в реакции не участвовала.

Эти и другие примеры привлекли внимание Берцелиуса, который в 1836 г. предложил для таких явлений термин «катализ» (от греч. «разрушение»). Обычно спирт горит в кислороде только после нагревания при высоких температурах, когда возгораются его пары. В присутствии платинового катализатора та же реакция происходит без предварительного нагревания.

В 1833 г., незадолго до Берцелиуса, французский химик Ансельм Паузн (1795 — 1871) экстрагировал из проросшего ячменя вещество, которое могло разлагать крахмал до простых Сахаров еще быстрее, чем любая кислота. Он дал веществу наименование диастаз. И диастаз, и другие подобные ему вещества были впоследствии названы ферментами из-за преображения крахмала в Сахара: именно этот процесс являет собой ферментация зерна. Вскоре ферменты были экспериментально получены из животных организмов. Первые из них добывались из желудочных соков. Реамюр показал, что пищеварение — химический процесс, и в 1824 г. английский врач Уильям Прут (1785 — 1850) выделил из желудочного сока соляную кислоту. Она была строго неорганическим веществом. Поначалу это поразило ученых, однако в 1835 г. Шванн, один из основателей клеточной теории, получил экстракт желудочного сока, который не содержал соляной кислоты, но разлагал мясо быстрее, чем кислота. Это вещество Шванн назвал пепсином (от греч. «переваривать»); это и был истинный фермент. Постепенно были открыты и другие ферменты; стало совершенно очевидным, что ферменты — это и есть катализаторы процессов, идущих в живых тканях; химики не могли ранее синтезировать некоторые вещества, производимые в этих тканях, поскольку не имели в своем арсенале таких катализаторов.

Ферменты были разделены на две группы: неорганизованные ферменты, работающие также вне клетки, например пепсин; организованные ферменты, работающие только внутри клетки, которые заставляли дрожжи превращать сахар в алкоголь.

В 1876 г. немецкий физиолог Вильгельм Кюн (1837 — 1900) предложил использовать слово «фермент» только для процессов, требующих присутствия живого материала. Те ферменты, которые, будучи выделенными, могли работать вне клетки, он предложил называть энзимами (от греч. «дрожжи»).

В 1897 г. Эдуард Бюхнер (1860—1917) растер клетки дрожжей с песком до полного уничтожения, а затем профильтровал полученный материал, выделив клеточный дрожжевой сок. Ученый предполагал, что этот сок не обладает ферментизирующей способностью. Он добавил сок к сахару и, к своему изумлению, обнаружил, что сахар начал медленно ферментизироваться, хотя вся смесь была абсолютно неживой. Бюхнер продолжил эксперименты, убивая дрожжи спиртом, и обнаружил, что мертвые клетки дрожжей ферментизируют сахар так же, как и живые.

Изучая строение Сахаров, Э. Фишер начал в 1894 г. ряд исследова­ний, касающихся действия на них ферментов. Он убедился, что разные субстраты по-разному атакуются ферментами, а последние в свою оче­редь обладают избирательностью при действии на различные субстраты. В итоге он пришел к открытию специфичности действия ферментов. Это открытие сделало возможным изучение пределов действия фермен­тов и внесло гораздо большую определенность в характеристики отдель­ных катализируемых ферментами реакций и самих ферментных систем.

Исследования Фишера развивали уже сложившуюся тенденцию хими­ческого подхода к исследованиям ферментов. Его знаменитый афоризм о том, что фермент подходит к субстрату, как ключ к замку (рис.4.1.6), способ­ствовал развитию представлений о стерическом соответствии между фер­ментом и субстратом. Под влиянием открытий Фишера шло быстрое проникновение достижений химии биологически важных соединений в энзимологию, что привело в итоге к радикальной перестройке всей систе­мы взглядов на методы изучения реакций обмена веществ.

Рис. 4.1.6. Стерическое соответствие между ферментом и субстратом (как ключ к замку).

Успехи органического синтеза после создания А. М. Бутлеровым теории химического строения, возникновение стереохимии и совершенствование органического анализа позволили к концу XIX в. развернуть широкие исследования, в результате которых было открыто строение важнейших химических компонентов организма и заложены основы дальнейшего прогресса в изучении обменных процессов.

Но что, же сам энзим? Ранее, при недостатке методического инструментария, ученым была видна только его работа. Но какова молекула энзима? Была известна хрупкость молекулы протеина, а энзимы теряют свою активность уже при осторожном нагревании. Был сделан вывод, что энзим — это протеин. Доказать обратное взялся авторитетный немецкий химик Ричард Вилстеер (1872 — 1942), и его мнение убедило многих.


Рис. 4.1.7. Кинетика ферментативной реакции согласно теории Михаэлиса-Ментен.
В 1926 г. вновь поднялся вопрос о протеиновой природе энзимов. Американский биохимик Джеймс Батчелор Самнер (рис.4.1.8) экстрагировал энзимы из бобов и назвал энзим уреазой: он катализировал разложение мочи на аммиак и двуокись углерода. Выполняя экстракцию, Самнер получил на одном из этапов крошечные кристаллы. Он растворил их и получил раствор с концентрированной уреазной активностью. Эти кристаллы были энзимом и удовлетворяли всем тестам на протеин. Уреаза оказалась первым энзимом, доступным в кристаллической форме.

Рис. 4.12.8. Джеймс Батчелор Самнер (1904–1971)
Американский биохимик Джон Хауарт Нортроп (1891 – 1987) в 1930 г. выделил из желудочного сока кристаллический пепсин, протеин расщепляющий энзим; в 1932 г. он кристаллизовал трипсин, а в 1935 г. — химотрипсин. Оба энзима — протеин расщепляющие, из поджелудочной железы. Все энзимы доказали свою протеиновую природу.