Молекулярная палеонтология

В породах, возраст которых также около 3, 5 млрд. лет, обнаружены строматолиты, своеобразные известковые образования, являющиеся продуктами жизнедеятельности древних фотосинтезирующих организмов — цианобактерий, или сине-зеленых водорослей. Если принять, что найденные в породах ископаемые остатки действительно принадлежат древнейшим прокариотам или являются продуктами их жизнедеятельности, то следует признать, что к этому времени уже были сформированы некоторые типы жизни, которые дошли до нас в виде ее «следов». Отсюда приходится сделать вывод, что впервые земная жизнь должна была возникнуть в промежутке между 3,5 и 4,6 млрд. лет тому назад, однако у нас нет никакой информации об этом периоде. Схематическое изображение во времени отдельных этапов эволюции представлено в табл. 4. 2.

Таблица 4.2

Первые эукариоты появились приблизительно 1,5 млрд лет назад. Таким образом, прокариоты были единственными обитателями нашей планеты в течение 2/3 времени эволюции биосферы. Жизнедеятельность прокариот привела к накоплению в атмосфере молекулярного кислорода и к обогащению лито- и гидросферы органическим веществом.

Относительно места архебактерий в эволюции мнения также расходятся. Согласно одному из них, архебактерий — одна из трех древних ветвей прокариотных организмов, самостоятельно развившихся из общего предка, не достигшего еще прокариотного уровня организации. Ряд исследователей акцентируют внимание на том, что архебактерии и эубактерии имеют много общих признаков, которые они, вероятно, унаследовали от общего предка, имевшего вполне развитое прокариотное строение. Предполагается, что архебактерии произошли от каких-то эубактерий. Нет единого мнения также и в вопросе о том, является ли группа архебактерий монофилетической или это искусственно объединенные представители неродственных друг другу групп бактерий, в основе которого лежит приспособление к экстремальным условиям существования.
4.2.19. Практическое использование биосинтетической и трансформирующей деятельности микробов
С начала второй половины XX в. изучение синтетической и трансформирующей деятельности микроорганизмов ведется в тесном контакте с их селекцией и широким практическим использованием.

Главными продуктами биосинтетической активности микроорганизмов являются белки, витамины, гиббереллины, полисахариды, аминокислоты, ферменты, энтомопатогенные препараты, кормовые антибиотики. Непременным условием успешного развития этого направления стало ведение селекционной работы — получение и использование высокоактивных штаммов продуцентов, обеспечивающих рентабельность производства. Развитие селекции опирается на теоретический фундамент генетики. За сравнительно короткий срок (примерно 20 лет) при помощи селекционно-генетических методов были созданы многие высокоактивные штаммы микробов, продуктивность которых была повышена в 10—200 раз по сравнению с исходными штаммами. Их использование явилось предпосылкой создания ряда отраслей микробиологической промышленности. Классическим объектом селекции стали актиномицеты и грибы.

Начало изучения и использования биосинтетической деятельности микроорганизмов связано с получением пенициллина, который в 1940 г. Г. Флори и Э. Чейн выделили из культуры плесневого гриба, впервые описанного А. Флемингом в 1929 г. Этот продуцент был идентифицирован М. Тома как Penicillium notatum. Однако родоначальником всех высокоактивных штаммов продуцентов пенициллина, используемых в настоящее время, стал P. chrysogenum.

Существенными нововведениями в производстве пенициллина, значительно повысившими его выход, были: переход с поверхностного выращивания гриба на глубинное (этот новый тип промышленного культивирования приобрел большое значение не только для пенициллиновой, но и для всей микробиологической промышленности); перевод процесса биосинтеза с синтетических питательных сред на богатые питательными веществами среды; введение в ферментационную среду предшественника продукта биосинтеза — осколка пенициллиновой молекулы — фенилуксусной кислоты. Все эти факторы значительно усилили физиологическую активность продуцентов терапевтически наиболее ценного типа пенициллина — бензилпенициллина.

Культура актиномицета Actinomyces griseus — продуцента стрептомицина была впервые выделена в 1914 г. А. Краинским. В 40—50-е годы у микроорганизмов была открыта способность синтезировать и другие антибиотики: окситетрациклин (Act. rimosus, 1948), аурэомицин (биомицин; Str. aureofaciens, 1948), эритромицин (Act. erythreus, 1952), олеандомицин (Act. antibioticus, 1956), грамицидин (Вас. brevis) и т.д. По отношению ко всем продуцентам названных антибиотиков, а также таких антибиотиков, как ванкомицин, ристомицин, канамицин, гризеофульвин, альбомицин, целикомицин, для повышения активности продуцента были применены различные методы селекции.

Столь же успешно исследовалась способность микроорганизмов к синтезу аминокислот. Начало промышленного микробиологического синтеза аминокислот относится к 60-м годам, когда в Японии в результате обработки УФ-лучами исходных штаммов Micrococcus glutamicus, выделенного из почвы (С. Киношита, 1956), были получены штаммы, обладавшие высокой биосинтетической активностью. Изучение механизма синтеза аминокислот, вопросов взаимозаменяемости и конкурентности природных аминокислот и их аналогов позволило значительно глубже проникнуть в содержание физиолого-биохимических процессов, протекающих в микробных клетках. Были установлены явления ретроингибирования, аллостерического торможения при образовании аминокислот, определены места блокирования отдельных этапов биосинтеза у биохимических мутантов, установлены взаимные связи и перекрещивания синтезов различных аминокислот, роль предшественников и т. д.

Микробиологическим путем стали получать аланин, аспарагиновую и глутаминовую кислоты, лизин, метионин, триптофан, лейцин, изолейцин и т. п. Большое внимание уделялось изучению путей микробиологического синтеза кормового белка. В качестве субстрата для выращивания продуцентов — главным образом дрожжей рода Candida — используются углеводороды и гидролизаты растительных отходов. Не менее интенсивно велись поиски возможности использования биосинтетической деятельности микробов для получения препаратов различных ферментов. Основными продуцентами ферментов являются грибы рода Aspergillus, а также некоторые бактерии и актиномицеты.

Интенсивное развитие получил также микробиологический синтез органических кислот — лимонной, итаконовой, щавелевой, глюконовой,— наиболее активными продуцентами которых являются аспергиллы; гиббереллинов, основным продуцентом которых служит культура Fusarium moniliforme; витаминов — витамина В₂ (рибофлавина), витамина В₁₂ и эргостерина.

За последние годы разностороннему изучению и широкому практическому использованию подверглась трансформирующая активность микроорганизмов. Микробиологическую трансформацию используют главным образом для получения из стероидного сырья растительного происхождения веществ, обладающих фармацевтическими или гормональными свойствами. Поиски в природе микроорганизмов — трансформаторов стероидной молекулы, способных осуществлять тончайшие реакции (гидроксилирования, дегидрогенизации, дезацетилирования, восстановления и т. п.), ведут по двум направлениям: обнаружение в природе таксономических групп, способных производить ту или иную трансформацию, и выделение методами селекции наиболее активных штаммов. Так были найдены штаммы некоторых грибов, способные осуществлять трансформацию с выходом кортизона и гидрокортизона, актиномицеты и микобактерии, применяющиеся для получения преднизона, преднизолона, диакобала, культуры грибов и микобактерии, селективно дезацетилирующие стероидные соединения.

Исследования трансформирующей активности микроорганизмов основывались на углубленном изучении их физиологии и интенсификации нужных ферментативных процессов. Были найдены также коррелятивные связи между морфологическими свойствами и химической активностью и установлена возможность подбором соответствующих условий (например, окислительно-восстановительных) и усилением нужной ферментативной активности микробов направлять процесс трансформации.

В последнее время на вирусы, бактерии и грибы обратили внимание ученые-материаловеды. Оказывается, микроорганизмы способны не только вырабатывать различные нужные для современных технологий вещества, но и сами могут служить важными компонентами новых материалов. Например, ученые начинают использовать микроорганизмы для сборки кристаллов в сложные геометрические структуры или в качестве живой матрицы для роста кристаллов. Новые способы управлять ростом кристаллов вызвали огромный интерес среди материаловедов, так как существует теснейшая связь между структурой материала и его свойствами. Размеры некоторых микроорганизмов, например, вирусов, не превышают нескольких десятков нанометров в длину. До сих пор не удается получить однородные синтетические частицы таких размеров. Микроорганизмы же достаточно доступны, имеют одинаковый размер, и приемы работы с ними относительно просты. Как правило, для жизнеобеспечения микроорганизмов требуются умеренные температура, давление и кислотность среды. Поэтому микробы – идеальные кандидаты для разработки новых экологически чистых технологий, взамен прежних процессов, где часто применяются высокие температуры, давление и агрессивные среды.

Многие микроорганизмы вырабатывают неорганические вещества, которые представляют интерес для материаловедов. Некоторые микроорганизмы способны усваивать соединения металлов и затем в процессе биосинтеза накапливать металл в виде структур со строгой пространственной конфигурацией. В 1999 г. была опубликована статья группы исследователей из Университета города Упсала (Швеция), в которой описан биосинтез кристаллов солей серебра бактериями Pseudomonas stutzeri штамма AG259. Этот вид бактерий обитает на месторождениях серебряных руд. В процессе метаболизма между цитоплазматической мембраной и клеточной стенкой бактерий образуются кристаллы солей серебра размером до 200 нм (рис. 4.2э43). Было показано, что бактерии способны образовывать не менее трех различных типов кристаллов с четкой пространственной структурой. Ученые предполагают, что, изменяя условия культивирования бактерий, можно будет синтезировать кристаллы с заданными параметрами. Возможность получать микрокристаллы серебра размером несколько нанометров чрезвычайно важна для микроэлектроники. Искусственное получение подобных микрокристаллов отличается малой производительностью при высоких затратах.

Разработка проблемы управляемого культивирования восходит к исследованиям более раннего периода (20-е годы), направленным на поиск методов изменения хода обмена веществ микроорганизмов с помощью разнообразных факторов внешней среды. Впервые на принципиальную возможность управлять развитием культуры с помощью условий среды указал Г. Клебс (1905), которому удалось таким образом регулировать развитие грибов и водорослей. В 50-е годы XX в. учеными разных стран была разработана теория роста и развития микробов (М. Стефенсон, И. Гунсалус, Н. Д. Иерусалимский, Ж. Моно, В. Шеффер, Р. Финн и др.). Были разработаны теоретические основы управления ростом микробов, опирающиеся на принцип минимума («узкого места»), т.е. использование функции лимитирующего вещества (Ж. Моно, А. Новик, Л. Снилард и др.), а также на регулирование величины популяции и накопления продуктов жизнедеятельности. Полученные данные позволили найти практические методы управляемого культивирования микробов, в том числе метод непрерывного, или проточного, культивирования, теоретическое обоснование которого было дано Ж. Моно (рис. 4.2.44) в 1950г.

До оформления генетики микроорганизмов в самостоятельную отрасль знания генетики и микробиологи работали разобщенно. Микробиологи были далеки от генетического истолкования наблюдавшихся ими фактов изменчивости и наследственности микробов, а генетики либо вообще не интересовались бактериологией, либо скептически относились к возможности применения генетических принципов к таким примитивно организованным формам жизни, какими им представлялись бактерии.

Первый этап в развитии генетики бактерий составили исследования, экспериментально доказывающие сходство природы и механизмов передачи потомству наследственных признаков у бактерий и высших организмов.

В период с 1910 по 1940 г. были описаны различные виды наследственной изменчивости. В 1921 г. французский микробиолог П. де Крюи описал изменение ряда свойств у одной из патогенных бактерий, возникающее, по его мнению, в результате расщепления признаков под влия­нием неблагоприятных условий среды. Этот вид изменчивости он назвал диссоциацией. В 1925 г. в Советском Союзе Г.А. Надсон и Г.С. Филиппов впервые получили мутационные (по их терминологии, сальтационные) стойкие изменения признаков у дрожжевых и плесневых грибков, подвергнув их облучению рентгеновыми лучами. Это был первый случай индуцированной мутации, вызванной физическим мутагенным фактором. Первые данные о характере мутаций позволили провести параллель между природой изменчивости у бактерий и высших организмов. Это стало возможным также после того, как были разработаны методы, которые дали возможность отличать изменения отдельной клетки от изменчивости целой популяции.

Причины различий в объяснении фактов изменчивости у микробов носили преимущественно методологический характер. Из-за отсутствия единой методики эксперимента данные разных авторов оставались несопоставимыми. Трудности в разграничении фенотипа и генотипа приводили зачастую к отрицанию различий между адаптацией и мутацией. Случаи морфологической изменчивости, требующие длительного наблюдения, нередко объясняли наличием сложных циклов развития. Длительное время отсутствовали и единые методы генетического анализа, в частности, принцип отбора мутантов. Значительное упорядочение представлений о природе изменчивости у микробов было связано с разработкой методов генетического анализа у высших организмов и утверждением представлений о сходстве механизмов изменчивости и наследственности у всех живых организмов.
4.2.22. Генетика бактерий
В генетике бактерий ситуация сложилась таким образом, что, несмотря на достаточное знакомство ученых с явлением спонтанной ненаправленной изменчивости у бактерий, прошло немало времени, прежде чем теория мутаций получила признание. До 40-х годов исследованию подвергалась мутабильность различных признаков бактерий. Преимущественным методом было наблюдение фактов изменчивости и их статистическая обработка. Среди признаков, которые использовались для изучения закономерностей изменчивости, учитывались главным образом антигенность, вирулентность и морфологические особенности. С начала 40-х годов, после признания за мутационной изменчивостью ведущей роли в изменчивости бактерий, характер спонтанных и индуцированных мутаций стали изучать при исследовании таких признаков, как устойчивость к ингибиторам (особенно к антибиотикам), к фагу, потребность в дополнительных факторах роста или дефектность синтеза отдельных ферментов, изменение морфологии клеток или колоний, вирулентные и антигенные свойства: Общему признанию ведущей роли мутационной изменчивости у бактерий способствовала разработка ряда селективных методов ее выявления. Одним из них был метод «флуктуационного теста», разработанный в 1943 г. С. Луриа и М. Дельбрюком. Метод основывался на учете возникновения фагоустойчивых клонов в популяции чувствительного к фагу штамма Escherichia coli. Его использование положило начало современной генетике бактерий.

Еще более простое доказательство значения мутационной изменчивости дал «метод перераспределения» клеток, разработанный X. Ньюкомбом (1949). Он основан на анализе роли фага при орошении фагофильтратом посевов фагочувствительных бактерий и на учете появления большего по сравнению с контролем числа устойчивых к фагу клеток за счет возникновения мутантных фагоустойчивых клеток.

Веское доказательство существования «преадаптивной» изменчивости было получено методом «отпечатков» бактерий (выросших на чашах-репликах), созданным Дж. Ледербергом и Э. Ледерберг в 1952 г. Этот метод позволил выявлять спонтанные мутации без обработки фагом или антибиотиками, т.е. в отсутствие специфических условий внешней среды. Еще более наглядно спонтанность возникновения мутантов была продемонстрирована с помощью метода непрямого отбора, разработанного в 1955 г. Л. Кавалли-Сфорца и Дж. Ледербергом. В его основе лежит процесс разведения и обогащения исходной популяции, дающий практически чистую культуру. Данные, полученные с помощью указанных методов, убедили большинство исследователей в том, что основная доля бактериальных мутантов возникает за счет спонтанных и ненаправленных мутаций, частота которых сравнительно низка.

Важным событием в изучении природы мутаций было открытие биохимических (ауксотрофных) мутантов, т.е. микробов, потерявших в результате мутации способность самостоятельно синтезировать те или иные метаболиты и потому нуждающихся во включении этих метаболитов в питательную среду. Ауксотрофные мутанты были впервые обнаружены Дж. Бидлом и Э. Тейтумом в 1941 г. у плесневого грибка Neurospora crassa при облучении культуры ультрафиолетовыми лучами.

Теория Бидла и Тейтума, выраженная формулой «один ген — один фермент», обобщила данные изучения механизмов, контролирующих образование ферментов, с помощью ауксотрофных мутантов. Впоследствии она была уточнена и в настоящее время формулируется как «один ген — одна макромолекула» (РНК или «полипептид»). Важность этих исследо­ваний определилась тем, что впервые была установлена связь между отдельным геном и конкретной химической реакцией, происходящей в клетке. Ауксотрофные мутанты стали успешно применяться и при разработке биологических методов определения различных аминокислот, витаминов, азотистых оснований. Исследования с применением ауксотрофов положили начало биохимической генетике.

Восстановление биосинтетической активности у ауксотрофов (или реверсия к прототрофности) было впервые описано Ф. Райяном и Дж. Ледербергом в 1948 г. у Neurospora crassa. Это явление рассматривалось как результат либо реверсной мутации в том же локусе, либо мутации в другом локусе хромосомы, сцепленном с локусом, затронутым прямой мутацией (супрессорная мутация). Последующее изучение явления обратного мутированию у биохимических мутантов позволило уточнить механизмы этого процесса. Было показано, что ревертирование обязано не истинным обратным мутациям, а главным образом супрессорным мутациям, возникающим в другом месте генома и приводящим к восстановлению дикого фенотипа. Важный материал был получен также при изучении генетических факторов, регулирующих обмен углеводов, а в связи с этим и механизмов, контролирующих образование ферментов, а также мутирование морфологических признаков клеток, антигенных и вирулентных свойств. Данные по изучению этих мутантов в значительной мере взаимосвязаны (П. де Крюи, 1921; А. Александрини, 1931; В. Браун, 40-е годы).

Для раскрытия молекулярной сущности мутагенеза как главного механизма изменения наследственной информации решающее значение имела расшифровка в 1953 г. структуры молекулы ДНК Дж. Уотсоном (James Dewey Watson, род. 1928) и Ф. Криком (Francis Crick, 1916-2004) (Нобелевская премия, 1962). Это фундаментальное открытие заложило основу изучения механизмов передачи наследственной информации у бактерий с помощью методов молекулярной биологии. Речь идет об исследовании трансформации, трансдукции, конъюгации и лизогенной конверсии.