Influence of vitamin D status and vitamin D3 supplementation on genome wide expression of white blood cells: a randomized double-blind clinical trial

CONCLUSION/SIGNIFICANCE:

Это полногеномных выражения анализа обеспечивает first insight into the global транскрипционной активности, лежащей в основе эффектов витамина D и витамина D₃ добавки в клетках человека buffy coat, которые включают иммунные клетки. Как показано на рис. 3, витамина D, причиненный по крайней мере в 1,5 раза, изменения в экспрессии 291 генов, вовлеченных в апоптоз, иммунную функцию, транскрипционной регуляции, эпигенетические модификации, в ответ на стресс, клеточного цикла активности и дифференцировки (табл. 3). Этот вывод согласуется с предыдущими исследованиями in vitro показал, что 1,25(OH)₂D₃ прямо или косвенно контролируемых более чем 200 генов, включая гены, ответственные за регуляцию клеточной пролиферации, дифференциации, ангиогенез и иммуномодулирующее как врожденного, так и адаптивного иммунного ответа [3],[4],[6]. Наши наблюдения подтверждают предыдущие отчеты, которые подсчитали, что АСГ активации может регулировать непосредственно и/или косвенно экспрессию большого количества генов (0.5-5% всего человеческого генома, т.е., 100-1250 генов) [3],[4],[8],[11],[17].

В последние полногеномных анализ микрочипов 1,25(OH)₂D₃-лечить человеческие остеобласты открыл модуляции 158 генов, вовлеченных в метаболизм витамина D (CYP24A1), иммунной системы (CD14), транспортеры нейромедиаторов (SLC1A1, SLC22A3)и коагуляции [17]. Исследование человеческого генома проверку на VDREs сообщили 157 генов, которые регулируются ГТК - 25 клеток, из которых 126 были индуцированные и 31 были репрессированы [17]. Исследователи обнаружили, 2,776 сайты связывания для рецептора витамина D по длине генома. Среди них включены 229 генов, связанных с предрасположенностью к аутоиммунным расстройствам, и раковых заболеваний, включая хронический лимфолейкоз и колоректального рака [17]. Все эти исследования сообщают эффект 1,25(OH)₂D₃ на экспрессию генов были исследования in vitro в различных типах клеток.

Там были два genome wide association studies, связанных геномных вариаций на статус витамина D [18],[19]. Однако мало известно о том, что влияние витамина D на экспрессию Гена или, что случается экспрессии генов в ответ на витамин D добавки. Мы наблюдали, что 291 генов, по крайней мере, в 1,5 раза стимулируется или тормозится в ответ на витамин D₃ добавок. Мы выявили 66 генов, которые наиболее подвержены значительному влиянию субъектов витамин D i e те, кто были витамин D дефицит 25(OH)D 16,2±4.2 нг/мл по сравнению с взрослыми, которые имели 25(OH)D 27,5±8,4 нг/мл в начале исследования. Девятнадцать из этих 66-гены же сообщили in vitro [12], [17]. Таким образом, мы определили дополнительным 47 гены, которые находились под влиянием витамина D₃ статус.

Из этих 66 генов, 17 генов, чья экспрессия значительно изменилась после витамина D₃ добавки в обоих неполноценным и недостаточно/достаточно групп были обнаружены роман VDREs (Таблица 2).

После получения 400 IUs или 2000 IUs за 8 недель витамина D₃ произошли кардинальные изменения в экспрессии этих 66 генов, в то время как никаких значительных изменений не было замечено в 12 уборка генов. Мы не видим значительный дозозависимый разница в изменении экспрессии генов 8 недель после взрослых, ежедневно получали либо 400 IUs или 2000 IUs витамин D₃. Это может быть из-за небольшого количества изучаемых предметов или что-либо улучшения в сыворотке крови 25(OH)D уровни могут привести к значительным изменениям в экспрессии генов, является ли человек витамина D недостаточно, недостаточно или достаточно. Мы наблюдали ту же тенденцию в экспрессии генов в субъектах, которые получили 400 или 2000 IUs витамин D₃ является ли база 25(OH)D был 16.2±4.2 или 27,5±8,4 нг/мл. Существует, однако, тенденция для большего изменения в экспрессии этих генов группы, которые получали 2000 IUs витамин D₃/d по сравнению с группой, которые получали 400 IUs витамин D₃/d. Даже темы, которые имели 25(OH)D 40 нг/мл после 2000 IUs витамин D₃ ежедневно в течение двух месяцев имели по крайней мере 1 раз изменить в 10 генов, и, по крайней мере, 0,5 кратного изменения в экспрессии 33 генов из этого пула 66 генов.

66 генов, 52 увеличение их экспрессии в ответ на витамин D₃ добавок. Наибольшее увеличение было в генах, которые закодированы для апоптоз т-клеток, внутриклеточного антигена-1 (TIA1) (26 раз), иммунную функцию, zinc finger protein 287(ZNF287) (в 6,8 раза), в ответ на клеточный стресс, Y-РНК(в 2 раза), centrin3(CETN3) (в 1,5 раза) и теплового шока 105 кда/110 кда белка 1(HSPH1) (в 1,5 раза), трнк обработки, митохондриальной перевод оптимизации 1 гомолог (MTO1)(5 раз) и pseudouridylate синтазы 3 (PUS3)(2 раза), транскрипционной регуляции, такие как ZNF 701 (в 2,3 раза), и генов, участвующих в репарации ДНК, общего фактора транскрипции ИЙГ, полипептид 1 (GTF2H1) (7-раза) и модификации хроматина малая субъединица processome компонент, гомолог (UTP3) (4 раза).

Остальные 14 генов уменьшилось их экспрессии в ответ на витамин D₃ добавок. Наибольшее уменьшение было в генах, которые закодированы для модификаций гистонов; гистон H1 семьи, членом X (H1FX) (12 раз), транскрипционная регуляция; early growth response 1 (EGR1)(в 2,8 раза). Двух генов, которые были сниженной экспрессии кластера дифференцировки 83(CD83) (2 раза) и фактор некроза опухоли Альфа-индуцированного белка 3 (TNFAIP3)(в 1,5 раза), что, как известно, влияют на иммунную функцию также было обнаружено снижение экспрессии ПЦР в реальном времени.

Наши наблюдения, что витамин D₃ добавки увеличение содержания в сыворотке крови 25(OH)D уровни, в результате подавления CD83 (2 раза) согласуется с наблюдением, что 1,25(OH)₂D₃ ингибирует CD83 выражение в культивированных дендритных клеток[20]. Это говорит о том, что локальный синтез 1,25(OH)₂D₃ в иммунных клеток, включая макрофаги[21] регулирует гены, которые влияют на иммунную функцию и улучшить иммунную здравоохранения приведет к снижению риска развития аутоиммунных заболеваний, таких как рассеянный склероз и сахарный диабет 1 типа[20].

Роль TNFAIP3 в антиапоптотических функции [22] и ассоциации его " мутации с болезнью крона, ревматоидный артрит, системная эритематозная волчанка, псориаз, сахарный диабет 1 типа [23] , можно объяснить Ассоциацией достаточности витамина D в профилактике хронического воспаления и аутоиммунных заболеваний. Также витамин D влияет на экспрессию ядерного фактора каппа легких полипептидных gene enhancer в B-клеток, ингибитор Альфа (NFKBIA)(в 1,5 раза) может повлиять на иммунную и провоспалительных ответов [24],[25].

Витамин D₃ добавки вылилось в 1,5 раза увеличить в выражении трехсторонних мотив, содержащие белок 27 (TRIM27) Гена, который негативно регулирует CD4 т-клеток путем ubiquitinating и ингибирования класс II фосфатидилинозитол-3 киназы C2β (PI3KC2β)2β [26]. TRIM27 за выражение, возложенных устойчивость к окислительному стрессу, с уменьшением экспрессии thioredoxin связывающий белок-2 [26]. Также TRIM27 был недавно идентифицирован важным негативным регулятором тучных клеток in vivo, и свидетельствует о том, что PI3KC2β-это потенциальные новые Фармакологические мишени для лечения IgE-опосредованного заболевания [25]-[26]. Наш поиск определила потенциальные новые пути для витамина D, влияющих на иммунную систему, риск аллергии и окислительного стресса через TRIM27. Coatomer белкового комплекса, субъединица (бета-версия 2 (COPB2) был еще один витамин D отзывчивым Гена в нашем исследовании экспрессия которой значительно увеличивается (в 1,5 раза) после витамина D₃ добавок. COPB2 роль апоптоза и подавление роста опухоли [27], может помочь объяснить, ассоциация совершенствования статус витамина D в профилактике рака [7],[17].

Более высокие концентрации в сыворотке крови 25(OH)D на базовом уровне, а повышение в сыворотке крови концентрации 25(OH)D С 400 IUs или 2000 IUs витамина D₃ в результате в 2,5 раза снижение экспрессии СГП-1, Гена, что является транскрипционный регулятор не только дифференциации и mitogenesis но также играет важную функцию сосудистого здоровья [28],[29]. Аналог 1,25(OH)₂D₃, кальципотриол, который является мощным ингибитором пролиферации кератиноцитов и применяется для лечения гиперпролиферативных заболевание кожи псориаз был найден ингибировать EGR-1 выражение в культуре человеческих кератиноцитов[30]. Было подсчитано, что в качестве фактора транскрипции EGR-1 влияет на экспрессию более чем 300 генов [31]. Таким образом, не изменяя выражения EGR1 с добавок витамина D имеет потенциал каскадный эффект изменения дополнительные 300 генов. Это может помочь объяснить наблюдение, что витамин D может прямо или косвенно влиять до 5% генома человека [4],[17].

Эти данные позволяют предположить, что существует континуум в экспрессии генов в ответ на увеличение сывороточного 25(OH)D уровни. Определений дефицита витамина D, недостаточность и достаточности в некоторой степени произвольным. Как показано на рис. 3 наши данные позволяют предположить, что любое улучшение в витамин D статус позволит повысить экспрессию генов, которые имеют разнообразные биологические функции, связанные с клеточной пролиферации, дифференцировки, иммунитета, репарации ДНК и т.п ли 25(OH)D концентрация низкая (10 нг/мл или 40 нг/мл. Эти гены связаны рака, аутоиммунных расстройств и сердечно-сосудистых заболеваний и были связаны с дефицитом витамина D [1],[5],[6].

Эти результаты позволяют предположить, что для максимального витамин D влияет на экспрессию генов может потребоваться даже более высокие дозы, чем 2000 IUs витамина D₃ ежедневно. Текущие наблюдения показал определенный шаблон для широкой экспрессии генов, недостаток витамина D и значительные изменения с повышением в сыворотке крови уровня 25(OH)D. хотя больше исследования необходимы, чтобы объяснить клинически значимые паттерны экспрессии генов, присутствующих полногеномных микрочипов исследования в человеческой buffy coat впервые выявлен широкий спектр важных регуляторных и метаболических процессов под влиянием витамина D₃ добавки, которая поддерживает витамин D иммуномодулирующим действием и потенциальной роли в ответ на стресс и репарации ДНК.

Основным ограничением исследования является малое количество изучаемых предметов и таким образом результаты представлены как поисковое исследование. Хотя экспрессии генов определяли с подходящим false discovery rate лишь несколько 291 витамин D отзывчивым гены были проверены с помощью ПЦР в реальном времени. Кроме того, хотя в нашем исследовании не было выявлено фактическое VDR сайты связывания с биологической функции он поддерживает витамин D-чувствительных генов, полученные в лабораторных исследованиях [11],[12],[17] и предполагает, 17 потенциальных роман кандидата VDREs в витамин D-регулируемых генов. Это нужно будет подтвердить с помощью экспериментальных исследований.

Есть несколько сильных сторон исследования, которые включают в себя точное измерение сывороточного 25(OH)D концентраций золотой стандарт жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектроскопии, анализа, сравнения экспрессии генов в одних и тех же отдельных исходно и через 2 месяца после витамина D и выполнение этого исследования в зимнее время, когда солнечного света не влияет витамин D статус. Дополнительную прочность было предусмотрено real-time PCR анализ двух генов, CD83 и TNFAIP3 от 66 генофонда, которые были затронуты статус витамина D и два гены KLF10 и SBDS от 291 генофонда, которые были затронуты витамин D₃ добавки (рис. 4), что подтвердила микрочипов выражение этих четырех генов (рис. 5).

В резюме, это первый отчет, чтобы показать, как витамин D и витамин D₃ добавок влияет на экспрессию генов в здоровых взрослых. Девятнадцать из этих витамин D-индуцированных генов были ранее сообщалось регулироваться 1,25(OH)₂D₃ in vitro и функции иммунной системы, апоптоза, регуляции транскрипции, в ответ на стресс.

Прием витамина D доказала скелетных польза для здоровья [3],[4], особенно у лиц группы риска дефицита витамина Д. Это исследование показывает, впервые молекулярные отпечатки пальцев, которые помогают объяснить некоторые nonskeletal польза для здоровья витамина D [2],[6].

This genome-wide expression analysis provides the first insight into the global transcriptional activity that underlies the effects of vitamin D status and vitamin D₃ supplementation in cells on the human buffy coat that include immune cells. As shown in Figure 3, vitamin D supplementation caused at least a 1.5 fold change in the expression of 291 genes that are involved in apoptosis, immune function, transcriptional regulation, epigenetic modification, response to stress, cell cycle activity and differentiation (Table 3). This finding is consistent with previous in vitro studies that showed 1,25(OH)₂D₃ directly or indirectly controlled more than 200 genes, including genes responsible for the regulation of cellular proliferation, differentiation, angiogenesis and immunomodulatory activities on both innate and adaptive immune responses [3],[4],[6]. Our observations support previous reports that have estimated that VDR activation may regulate directly and/or indirectly the expression of a very large number of genes (0.5–5% of the total human genome i.e., 100–1250 genes) [3],[4],[8],[11],[17].

In a recent genome-wide microarray analysis of 1,25(OH)₂D₃-treated human osteoblasts revealed modulation of 158 genes involved in vitamin D metabolism (CYP24A1), immune function (CD14), neurotransmitter transporters (SLC1A1, SLC22A3), and coagulation [17]. A study of the human genome screened for VDREs reported 157 genes to be regulated in SCC- 25 cells, of which 126 were induced and 31 were repressed [17]. The researchers found 2,776 binding sites for the vitamin D receptor along the length of the genome. Among them included 229 genes associated with susceptibility to autoimmune disorders, and cancers including chronic lymphocytic leukemia and colorectal cancer [17]. All of these studies reporting the effect of 1,25(OH)₂D₃ on gene expression were in vitro studies in different cell types.

There have been two genome wide association studies that have related genomic variation on vitamin D status [18],[19]. However little is known about what effect vitamin D status has on gene expression or what happens to gene expression in response to vitamin D supplementation. We observed that 291 genes were at least a 1.5 fold stimulated or inhibited in response to vitamin D₃ supplementation. We identified 66 genes, that were most significantly affected by the subjects' vitamin D status i e those who were vitamin D deficient with 25(OH)D of 16.2±4.2 ng/ml compared to adults who had a 25(OH)D of 27.5±8.4 ng/ml at baseline. Nineteen of these 66 genes are the same reported by in vitro studies [12], [17]. Thus we have identified an additional 47 genes that were influenced by vitamin D₃ status.

Of these 66 genes, 17 genes whose expression significantly changed after vitamin D₃ supplementation in both deficient and insufficient/sufficient groups were found to have novel VDREs (Table 2).

After receiving 400 IUs or 2000 IUs for 8 weeks of vitamin D₃ dramatic changes occurred in the expression of these 66 genes while no significant change was seen in 12 housekeeping genes. We did not see a significant dose dependent difference in the alteration in gene expression 8 weeks after the adults received daily either 400 IUs or 2000 IUs vitamin D₃. This could be due to the small number of subjects studied or that any improvement in serum 25(OH)D levels can lead to significant changes in gene expression whether the person is vitamin D deficient, insufficient or sufficient. We observed the same trend in gene expression in the subjects who received 400 or 2000 IUs vitamin D₃ whether the baseline 25(OH)D was 16.2±4.2 or 27.5±8.4 ng/ml. There was however a trend for a larger change in the expression of these genes for the group who received 2000 IUs vitamin D₃/d compared to the group who received 400 IUs vitamin D₃/d. Even the subject who had a 25(OH)D of 40 ng/ml after 2000 IUs vitamin D₃ daily for two months had at least a 1-fold change in 10 genes and at least a 0.5 fold change in the expression of 33 genes from this pool of 66 genes.

Of the 66 genes, 52 increased their expression in response to vitamin D₃ supplementation. The greatest increases were in genes that coded for apoptosis, T Cell intracellular antigen-1 (TIA1) (26-fold), immune function, zinc finger protein 287(ZNF287) (6.8-fold), response to cellular stress, Y-RNA(2-fold), centrin3(CETN3) (1.5-fold) and heat shock 105 kDa/110 kDa protein 1(HSPH1) (1.5-fold), tRNA processing, mitochondrial translation optimization 1 homolog (MTO1)(5-fold) and pseudouridylate synthase 3 (PUS3)(2-fold), transcriptional regulation such as ZNF 701 (2.3-fold), and genes involved in DNA repair, general transcription factor IIH, polypeptide 1 (GTF2H1) (7-fold) and chromatin modification small subunit processome component, homolog (UTP3) (4-fold).

The other 14 genes decreased their expression in response to vitamin D₃ supplementation. The greatest decreases were in genes that coded for histone modification; H1 histone family, member X (H1FX) (12-fold), transcriptional regulation; early growth response 1 (EGR1)(2.8-fold). Two of the genes that had reduced expression; the cluster of differentiation 83(CD83) (2-fold) and tumor necrosis factor alpha-induced protein 3 (TNFAIP3)(1.5-fold) that are known to affect immune function also were found to have reduced expression by real-time PCR.

Our observation that vitamin D₃ supplementation increased serum 25(OH)D levels resulting in the suppression of CD83 (2-fold) is consistent with the observation that 1,25(OH)₂D₃ inhibited CD83 expression in cultured dendritic cells[20]. This suggests that local synthesis of 1,25(OH)₂D₃ in immune cells including macrophages[21] regulates genes that affect immune function and improve immune health resulting in reducing risk for developing autoimmune diseases such as multiple sclerosis and type 1 diabetes[20].

The role of TNFAIP3 in antiapoptotic function [22] and the association of its' mutations with Crohn's disease, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematous, psoriasis, type 1 diabetes [23] could explain the association of vitamin D sufficiency in the prevention of chronic inflammation and autoimmune diseases. Also vitamin D's influence on the expression of nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells inhibitor, alpha (NFKBIA)(1.5-fold) may affect immune and proinflammatory responses [24],[25].

Vitamin D₃ supplementation resulted in a 1.5 fold increase in the expression of tripartite motif containing protein 27 (TRIM27) a gene that negatively regulates CD4 T cells by ubiquitinating and inhibiting the class II phosphatidylinositol 3 kinase C2β (PI3KC2β)2β [26]. TRIM27 over expression conferred resistance to oxidative stress, by decreasing the expression of thioredoxin binding protein-2 [26]. Also TRIM27 was as recently identified an important negative regulator of mast cells in vivo, and suggests that PI3KC2β is a potential new pharmacologic target to treat IgE mediated disease [25]–[26]. Our finding has identified a potential new pathway for vitamin D affecting the immune system, allergy risk and oxidative stress via TRIM27. Coatomer protein complex, subunit beta 2 (COPB2) was another vitamin D responsive gene in our study whose expression significantly increased (1.5-fold) after vitamin D₃ supplementation. COPB2's role in apoptosis and tumor growth suppression [27], may help explain the association of improving vitamin D status in cancer prevention [7],[17].

Higher serum concentrations of 25(OH)D at baseline and improvement in serum concentrations of 25(OH)D with either 400 IUs or 2000 IUs of vitamin D₃ resulted in a 2.5 fold decrease in the expression of EGR-1, a gene that is a transcriptional regulator of not only differentiation and mitogenesis but also plays an important function in vascular health [28],[29]. An analogue of 1,25(OH)₂D₃, calcipotriol which a potent inhibitor of keratinocyte proliferation and used for treating the hyperproliferative skin disorder psoriasis was found to inhibit EGR-1 expression in cultured human keratinocyte[30]. It has been estimated that as a transcription factor EGR-1 affects the expression of more than 300 genes [31]. Thus by altering the expression of EGR1 with vitamin D supplementation has the potential cascading effect of altering an additional 300 genes. This could help explain the observation that vitamin D can directly or indirectly influence up to 5% of the human genome [4],[17].

These data suggest that there is a continuum in gene expression in response to increasing serum 25(OH)D levels. The definitions of vitamin D deficiency and insufficiency and sufficiency are somewhat arbitrary. As shown in Figure 3, our data suggest that any improvement in vitamin D status will improve expression of genes that have a wide variety of biologic functions that are associated with cellular proliferation, differentiation, immune function, DNA repair etc whether the 25(OH)D concentration is as low as 10 ng/ml or as high as 40 ng/ml. These genes are linked to cancer, autoimmune disorders and cardiovascular disease and have been associated with vitamin D deficiency [1],[5],[6].

These results suggest that to maximize vitamin D's effect on gene expression may require even higher doses than 2000 IUs of vitamin D₃ daily. The current observation showed the specific pattern for broad gene expression of vitamin D deficiency and significant changes with increases in serum levels of 25(OH)D. Although larger studies are required to explain the clinically relevant gene expression patterns, the present genome-wide microarray study in human buffy coat for the first time identified a wide range of critical regulatory and metabolic pathways influenced by vitamin D₃ supplementation that supports the vitamin D immunomodulatory effects and potential role in response to stress and DNA repair.

The major limitation of the study is the small number of subjects studied and thus the results are reported as an exploratory study. Although gene expression was determined with a suitable false discovery rate only a few of the 291 vitamin D responsive genes were verified by real time PCR. Furthermore although our study did not identify actual VDR binding sites with a biologic function it does support vitamin D-responsive genes from in vitro studies [11],[12],[17] and suggests 17 potential novel candidate VDREs in vitamin D-regulated genes. This will need to confirm with experimental studies.

There are several strengths of the study that include accurately measuring serum 25(OH)D concentrations by the gold standard liquid chromatography tandem mass spectroscopy assay, comparing gene expression in the same individual at baseline and 2 months after vitamin D supplementation and performing this study in the winter when sunlight does not influence vitamin D status. An additional strength was provided by the real-time PCR analysis of two genes CD83 and TNFAIP3 from the 66 gene pool that were affected by vitamin D status and two genes KLF10 and SBDS from the 291 gene pool that were affected by vitamin D₃ supplementation (Figure 4) that corroborated the microarray expression of these four genes (Figure 5).

In summary, this is the first report to reveal how vitamin D status and vitamin D₃ supplementation affects gene expression in healthy adults. Nineteen of these vitamin D-induced genes have been previously reported to be regulated by 1,25(OH)₂D₃ in vitro and function on the immune system, apoptosis, transcription regulation and response to stress.

Vitamin D supplementation has proven skeletal health benefits [3],[4], particularly in individuals at risk for vitamin D deficiency. This study reveals for the first time molecular finger prints that help to explain some of the nonskeletal health benefits of vitamin D [2],[6].

Мы сообщаем результаты экспериментального исследования высоких доз витамина D в серповидно-клеточной анемией (SCD). Испытуемым давали 6-недельный курс орального высокие дозы холекальциферол (4000-100 000 ме в неделю) или плацебо и мониторинг перспективно сроком на шесть месяцев. Витамина D недостаточность присутствовала в исходной 82·5% и 52·5% пациентов, соответственно. Субъектов, которые принимали высокие дозы витамина D в сыворотке крови достигаются более высокие 25-hydroxyvitamin D, испытывали меньше боли дней в неделю, и имели более высокие физической активности на качество жизни, баллы. Эти результаты показывают потенциальную пользу витамина D в сокращении количества дней боль в SCD. Крупные проспективные исследования с большей продолжительностью необходимы, чтобы подтвердить эти эффекты.