Распределение материала исследования по возрастам

Распределение материала исследования по возрастам

Кусочки для гистологического исследования мозга взяли из симметричных участков полушарий головного мозга согласно цитоархитектонической карты, предложенной НИИ мозга РАМН («Атлас цитоархитектоники коры большого мозга человека» под редакцией С.А.Саркисова, М., 1955). Кусочки мы брали из энторинальной области коры и гиппокампа мозга (рис. 1).

Рис. 1. Мозг человека. Стрелками показаны места, откуда взяты кусочки (1х1х1) для гистологического исследования (правое полушарие протокол №6, 3 года, мальчик, уменьшение в 1,5 раза). А - собственное энторинальное поле epr¹, Б – поле СА₂ гиппокампа.

Из блоков готовили непрерывные серии срезов толщиной 10 мкм.

Окраска препаратов осуществлялась крезил фиолетом по Нисслю. Окраска по Нисслю является оптимальной и пока незаменимой при исследовании нервной системы (Л.И. Шейнина, 1968; В.П.Бабминдра, 1993; П.Г.Пивченко, 1993; О.В.Волкова, В.И.Швалев, В.И.Зяблов, В.В. Мысенко, М.И.Дьяченко, 1996; H.Hayg, 1985; S.E.Qyerby, T.B.Bjaalia, D.Broda, Z.Molnas, J.Mitrofamis, C.Blekemore, 1993). Достоинствами этого метода является стабильность результатов и возможность направленного избирательного выявления конкретных нервных клеток со всеми их отростками.

На изготовленных гистологических препаратах изучены морфометрические характеристики коры собственного энторинального поля epr¹ и поля СА₂ гиппокампа. Изучали толщину слоев коры, длину и ширину тел нейронов по слоям, плотность и объём нейронов (наружного, среднего и внутреннего слоев) характер расположения тел нейронов – в виде колонок, островка и др.; форму тел нейронов в каждом слое в возрастном аспекте, т.е. в 11 возрастных периодах.

Изучение возрастных особенностей цитоархитектоники коры энторинальной области и гиппокампа мозга человека проводились на серии непрерывных срезов от рождения до 90 лет. Нами детально исследованы в постнатальном онтогенезе человека изменения структурной организации собственного энторинального поля epr¹ энторинальной области коры и поля СА₂ гиппокампа мозга. При этом исследовались:

1. 
   Толщина каждого слоя изучаемых полей в постнатальном онтогенезе;
   
2. 
   Возрастные изменения этих слоев, их взаимоотношения и взаимообусловленность слоев и пирамидных нейронов.
   
3. 
   Начало дифференцировки пирамидных нейронов, а также сроки становления и инволюции.
   
4. 
   Выявлены периоды наиболее интенсивного развития коры собственного энторинального поля epr¹ энторинальной области и поля СА₂ гиппокампа мозга человека.
   
5. 
   Выраженность отдельных цитоархитектонических слоев и характер их клеточного строения.
   

Измерение толщины и протяженности отдельных слоев собственного энторинального поля epr¹ энторинальной области и поля СА₂ гиппокампа в постнатальном онтогенезе мы проводили с помощью линейного окуляр-микрометра, переводились в микрометры при помощи объект-микрометра. Определение толщины коры и ее отдельных слоев проводились на свободной поверхности извилины при четкой выраженности всех слоев, что максимально позволяет избежать ошибок в вычислениях.

При определении величины тел нервных клеток мы измеряли наибольший диаметр, принимаемый за ширину (толщину) тела клетки (Блинков С.М., 1955; Боголепова И.Н., 1977) и перпендикулярную к нему наибольшую длину тела клетки, которые имели в данном фронтальном срезе отчетливо выраженные ядро и ядрышко, в каждом срезе измеряли 10 нейронов исследуемого слоя корковых формаций (Блинков С.М., 1972).

Измерение размеров пирамидных нейронов проводились с помощью микроокулярометра, микроскопом – МБИ-6 при окуляре 7^х, объективе – 20 в наружном, среднем и внутреннем слоях коры поле 28 и 34 на гистологических препаратах ткани мозга левого и правого полушария окрашенных по Нисслю.

При этом использовался метод С.М.Блинкова и И.И.Глезера (1964), при котором измеряются два взаимно перпендикулярных диаметра, где Н -высота нейрона, А - его ширина (АхН).

В каждом случае в 10 и более полях зрения размеры пирамидных нейронов измерялись на делениях окулярной линейки. Затем с помощью объект– микрометра рассчитывалась величина деления этой линейки при окуляре 7^х-объективе 20. Величина одного малого деления равна 6 мкм. Данные, полученные при измерении размеров нейронов на делениях окулярной линейки, умножались на 6 мкм и таким образом высчитывался истинный размер пирамидных клеток в каждом поле зрения с последующим расчетом средних размеров, как для каждого случая, так и для каждой отдельной группы изучаемого материала.

Кроме того, морфометрическим методом в каждом наблюдении в 10 полях зрения определялось количество клеток в 1 мм³ (плотность клеток). Измерения проводились на тех же препаратах как в левом, так и в правом полушариях наружного, среднего и внутреннего слоях собственного энторинального поля epr¹ энторинальной области и пирамидного слоя поля СА₂ гиппокампа коры мозга при окуляре 10^х, объективе 100^х. Использовалась стандартная окулярная сетка.

Сначала рассчитывалось среднее арифметическое количество клеток в одном поле зрения микроскопа при увеличении объектива 100^х по формуле:

А – среднее значение количества клеток в одном поле зрения

Ai – количество клеток, видимых в одном поле зрения

Затем рассчитывалось значение поправки Аберкромби.

Необходимость включения поправки Аберкромби в расчёты объясняется тем, что фрагментация нервных клеток при резке на микротоме приводит к тому, что одна и та же клетка видна на двух или более срезах. Эту погрешность исправляют путём подсчёта только тех клеток, в которых на микроскопических срезах видно ядро с ядрышком (Блинков С.М., Глезер И.И., 1964). Учитывая равномерное расположение ядер в мозговой ткани, находим истинное число нервных клеток по формуле:

P=Zx[W/d+W], где

Р – истинное число ядер, находящихся в поле зрения

Z – количество ядер, видимых на микротомном срезе

W – толщина среза

d – диаметр ядра

В нашем исследовании W=20 микрон, d=4 микрона. Поправка Аберкромби составляла 0,9.

Потом рассчитывался коэффициент к при пересчёте количества клеток на 0.001 мм³ вещества мозга. При получении значений плотности клеток в 0.001 мм³ вещества мозга был произведён расчёт площади рамки, в пределах которой измерялось количество клеток. Площадь данной рамки (S) была измерена с помощью объект-микрометра и составила 0.0176 мм². Объём ткани мозга равен произведению площади рамки на толщину среза W и составляет: SxW = 0.0176 мм² х 0,02 мм = 0.000352 мм³. В 0.001 мм³ содержится сеток 0.001 мм³ : 0.000352 мм³ = 2.8.

Затем определение формулы для вычисления плотности нейронов в 0.001 мм³ вещества мозговой ткани. Учитывая поправку Аберкромби, равную 0.9, и значение коэффициента к, равное 2.8, получаем окончательную формулу для вычисления среднего значения плотности нейронов в 0.001 мм³ вещества мозга:

ПН=АхРхк=Ах0.9х2.8=Ах2.5

ПН =Ах2.5, где

ПН – плотность нейронов в 0.001 мм³ вещества мозга

А – среднее количество клеток в одном поле зрения

2.5 – произведение Рхк

Вычисления объёма тел пирамидных нейронов проводились по формуле объёма конуса (по И.Н.Боголеповой, 1977).