1. Приготовление микропрепаратов и окраска по Граму, Бури – Гинсу, Нейссеру, Цилю – Нильсену, простым способом. Микрокопирование в иммерсионной системе. Метод Грама

I этап — обогащение на среде Китт — Тароцци, предварительно прокипячен­ной в течение 30 минут для удаления пузырьков воздуха. После посева среду прогревают 15 минут при 80°С для уничтожения вегетативных форм, споры анаэробов при этом сохраняются. II этап — получение изолированных колоний На средах Китт — Тароцци обнаружи­вается помутнение с пузырьками газа. Выделение чистой культуры проводится по одному из следующих методов:

А) по Цейсслеру — каплю материала со среды Китт — Тароцци засевают в чашку с кровяным агаром и распределяют материал шпателем, этим же шпате­лем производят посев во второй и третьей чашках;

Б) по Вейнбергу: каплю материала со среды Китт — Тароцци переносят в растопленный и слегка остуженный сахарный агар, затем под струю холл воды и инкубируют в термостате.

Ш этап — выделение чистой куль­туры на среде Китт — Тароцци.

4. Определение ОМЧ воздуха по методу Коха.

Седиминтационный метод. чашку Петри с питательным агаром оставляют открытыми в течение 5 мин, после чего посевы инкубируют в термостате при 37°С 2 сут. Результаты оценивают по суммарному числу колоний.на 100см2 за 5 мин – 10 л возд

Аспирационный метод - Посев воздуха осуществляется с помощью прибора Кротова

Аппарат Кротова устроен таким образом, что воздух с заданной скоростью просачивается через узкую щель плексигласовой пластины, закрывающей чашку Петри с питательным агаром. При этом частицы аэрозоля с содержащимися на них микроорганизмами равномерно фиксируются на всей поверхности среды благодаря постоянному вращению чашки под входной щелью.

В микробиологической практике применяют различные дезинфицирующие вещества: 0,2% раствор жавель-солида, 3-5% растворы фенола, 5-10% растворы лизола, 1-5% растворы хлорамина, 3-6% растворы перекиси водорода, 1-5% растворы формалина, растворы сулемы в разведении 1:1000 (0,1%), 70% спирт и др.

Загрязненные патологическим материалом или культурами микроорганизмов пипетки, стеклянные шпатели, предметные и покровные стекла опускают на сутки в стеклянные банки с 0,2% раствор жавель-солида, 3% раствором фенола или перекиси водорода. Препаровальные иглы, бактериальные петли после употребления немедленно прокаливают на огне.

Поверхность рабочего стола протирают кусочком ваты, смоченным 3% раствором фенола. Руки дезинфицируют 1% раствором хлорамина.

Перед стерилизацией лабораторную посуду тщательно моют и сушат. Пробирки, флаконы, бутылки, матрацы, колбы закрывают ватно-марлевыми пробками. Поверх пробки на каждый сосуд (кроме пробирок) надевают бумажный колпачек. Чашки Петри стерилизуют завернутыми в бумагу по 1-5 штук или в пеналах.Пастеровские пипетки по 3-5-10-15 штук заворачивают в плотную оберточную бумагу. В верхнюю часть каждой пипетки вкладывают кусочек ваты.

Лабораторную посуду стерилизуют:

а) сухим жаром при температуре 150, 160 и 180?С соответственно 2 часа, 1 час и 30 минут.

б) в автоклаве при давлении 1 атм. В течение 20-30 минут

культуру засевают газоном на питательный агар или среду АГВ в чашке Петри.

Среда АГВ: сухой питательный рыбный бульон, агар-агар, натрий фосфат двузамещенный.

На засеянную поверхность пинцетом помещают на одинаковом расстоянии друг от друга бумажные диски, содержащие определенные дозы разных антибиотиков. Посевы инкубируют при 37 °С до следующего дня. По диаметру зон задержки роста исследуемой культуры бактерий судят о ее чув­ствительности к антибиотикам.

Осн р-р АБ готовят с пом буф р-ра или спец р-ля. Серийные разведения препарата готовят в пробирках, содерж 1 мл мясо-пепт бульона. В 1-ю проб вносят 1 мл исходн р-ля ,после чего готовят серию разведений препарата. В кажд вносят 0,1 мл бакт сусп. Готовят контроли (мпб+сусп, мпб_АБ). Инкубир. Отсутствие помутнения – задержка роста в присутств данной конц аб

ОРА выполняют перед постановкой развернутой реакции для того, чтобы получить предварительное представление о выделенном виде или сероваре бактерий

Ставят при комнатной температуре на предметных стеклах. Для этого пастеровской пипеткой наносят на стекла раздельно друг от друга капли сыворотки в небольших разведениях(1:10-1:20) и две капли 0,5% раствора натрия хлорида(Контроль) . В каждую каплю(за исключением контрольной) вносят подозрительные колонии, снятые с поверхности плотной питательной среды.Перемешивают до помутнения. Результаты реакции учитывают через 5-10 минут. При положительной реакции в капле с сывороткой появляются крупные ли мелкие хлопья, при отрицательной- жидкость остается равномерной мутной.

9. 
   Биохимическая идентификация микроорганизмов. Изучение биохимической активности микроорганизмов: питательные среды; учёт результатов. Сделать посев в питательные среды.
   

Способность к ферментации углеводов оценивают по изменению окраски среды вследствие образования органических кислот (соответственно, происходит уменьшение рН), вызывающих изменение окраски индикатора.

Агглютинацией называют склеивание бактерий при действии на них специфических АТ в присутствии электролита. Ее используют: 1) для определения вида и серовара выделенных бактерий, 2) для обнаружения АТ в сыворотке крови больного ( серодиагностика).

Для постановки РА необходимы три компонента: АГ(агглютиноген), АТ( агллютинин) и электролит( изотонический раствор натрий хлорида). В качестве АГ в РА применяют 18-24ч взвеси живых или убитых формалином, спиртом бактерий. Наиболее стабильным АГ являются взвеси убитых микроорганизмов.
На предметное стекло наносят каплями:

1-ая капля: - агглютинирующая сыворотка к возбудителям дизентерии;

2-ая капля: - агглютинирующая сыворотка к возбудителям брюшного тифа;

3-ья капля: - физиологический раствор (контроль).

Добавляют в каждую каплю исследуемую чистую культуру бактерий. Перемешивают.

Примечание: положительный результат - наличие хлопьев агглютината, отрицательный - отсутствие хлопьев агглютината .

метод Оухтерноли). В качестве геля для реакции используют 1% хорошо отмытый прозрачный агар. Антигены и сыворотки вносятся в агаровый гель так, чтобы лунки, содержащие их, находились на определенном расстоянии. Диффундируя навстречу друг другу и соединяясь друг с другом, антитело и антиген образуют иммунологический комплекс в виде белой полосы. При наличии сложного по составу перципитоногена может возникать несколько полос.

Приготовление термопреципитиногена.

Постановка реакции кольцепреципитации.

При постановке реакции преципитации применяют следующие контроли:

Является разновидностью реакции лизиса. В качестве АГ в этой реакции применяют эритроциты, которые лизируются гемолизинами в присутствии комплемента. Для постановки реакции гемолиза необходимы: 1) эритроциты барана; 2) гемолитическая сыворотка, содержащая гемолизины к бараньим эритроцитам и 3)комплемент.

Протекает в две фазы. В первой фазе происходит взаимодействие между эритроцитами и гемолитической сывороткой, во второй- сенсибилизированные эритроциты фиксируют комплемент и наступает лизис.

Для постановки реакции гемолиза в 1 пробирку вносят по 0,5мл гемолитической сыворотки, комплемента, разведенного 1:10 , 3% взвеси бараньих эритроцитов по осадку. 2 пробирка служит контролем комплемента, 3 пробирка –гемолитической сывороткой, 4 пробирка –эритроцитов. Учет после инкубации смеси в течении 1часа.

РСК проводится в два этапа при участии двух систем:

Компоненты реакции:

Титр комплемента — наибольшее разведение комплемента, которое вызывает полный лизис эритроцитов в присутствии гемолитической сыворотки.

Рабочая доза комплемента — количество комплемента, которое выше тира на 25 %.

Гемолитическая сыворотка готовится путём иммунизации кроликов 50 % взвесью эритроцитов барана. Полученную сыворотку инактивируют нагреванием при 56 °С.

Титр сыворотки — максимальное разведение сыворотки, которая вызывает полный лизис эритроцитов в присутствии комплемента. В качестве рабочей дозы берут гемолитическую сыворотку в тройном титре.

Исследуемая сыворотка накануне постановки реакции прогревается на водяной бане при 56 гр. В течении 30мин. Для инактивации ее собственного комплемента и разводиться начиная с 1:5.

в основе реакции лизиса лежит взаимодействие трех компонентов:

применяется для:1) определения вида неизвестного микроба при помощи специфической сыворотки;

Под воздействием бактериолизинов в присутствии комплемента микробы теряют подвижность, меняют форму (набухают), распадаются и, наконец, совсем растворяются.

метод Илеком и Леви.С этой целью готовятся чашки с питательным агаром, содержащим 5% отмытых физиологическим раствором эритроцитов барана, кролика и человека.