611. 41/42+612. 43/45): 577. 49 Лимфатические узлы в суточной пространственно-временной организации лимфоидной системы 14. 00. 02 анатомия человека

НОВОСИБИРСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ

МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ

───────────────────────────────────────────────────────

На правах рукописи

ЛЕТЯГИН Андрей Юрьевич

УДК: (611.41/42+612.43/45):577.49

ЛИМФАТИЧЕСКИЕ УЗЛЫ В СУТОЧНОЙ

ПРОСТРАНСТВЕННО-ВРЕМЕННОЙ ОРГАНИЗАЦИИ

ЛИМФОИДНОЙ СИСТЕМЫ

14.00.02 - анатомия человека

А в т о р е ф е р а т

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

НОВОСИБИРСК - 1991

.

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте клинической и экспериментальной лимфологии Сибирского отделения Академии медицинских наук СССР и на кафедре нормальной анатомии Новосибирского ордена Трудового Красного Знамени медицинского института Министерства здравоохранения РСФСР.

Ю.И.БОРОДИН

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

М.Д.ШМЕРЛИНГ
доктор медицинских наук, профессор

Л.Е.ЭТИНГЕН

С.И.КОЛЕСНИКОВ

Ведущая организация: Институт морфологии человека

АМН СССР

Защита состоится "____"_____________1991 г. в ______ ч. на заседании специализированного совета Д 084.52.02 Новосибирского ордена Трудового Красного Знамени медицинского института (630091, г. Новосибирск, Красный проспект, 52).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Новосибирского медицинского института по адресу: г. Новосибирск, Красный проспект, 52.

Автореферат разослан "____"____________1991 г.

Ученый секретарь специализированного совета

доцент А.Н.МАШАК
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования. Биоритмологический аспект функционирования любой биосистемы в норме и при нарушенном режиме жизнедеятельности представляется актуальной проблемой (Парин В.В., Баевский Р.М.,1970). Феномен ритмичности функционирования лимфоидной системы не может быть исключением: в течение суток даже в интактном организме в несколько раз изменяется сила ответа на антигенный стимул, уровень устойчивости к цитотоксическим веществам и другие параметры резистентности организма (Haus E.,et al.,1983).

Из всего спектра колебательных процессов именно формирование суточных биоритмов лимфоидных органов оказывает заметное влияние на состояние естественной резистентности (Лозовой В.П., Шергин С.М.,1981) и хронорезистентности (Агаджанян Н.А., и др., 1990), поражаемых в ситуациях, десинхронизирующих совокупность биоритмов организма: дальние перемещения с большими скоростями, работа в условиях вахтовой организации труда, работа в ночные смены или по "скользящему" графику и другие ситуации, частично или полностью ломающие привычный уклад жизни (Оранский И.Е., 1988).

Совокупность лимфатических узлов, где каждый орган контролирует свой регион, играет одну из ведущих ролей в формировании резистентности животного организма к антигенным воздействиям, а также в адаптации к изменениям рутинных факторов. Пока остаются неясными механизмы участия лимфатических узлов в перестройке суточного внутреннего временного порядка лимфоидной системы.

Перемещение лимфоцитов весьма значимо для формирования клеточного состава лимфоидных органов и лимфоидных структур лимфатических узлов наряду с пролиферативными и деструктивными процессами. В связи с этим стоит проблема создания способов непрямой оценки миграционных потоков лимфоцитов (Комаров Ф.И., и др., 1990) и способов усиления выброса в кровь или торможения рециркуляции депонированных в тканях лимфоцитов (Марчук Г.И., Петров Р.В., 1988).

Нет данных о суточном порядке и механизмах реализации накопления, перемещения (внутри органа) и выхода лимфоидных клеток из лимфатического узла. Не разработан вопрос о суточной ритмике дренажных возможностей лимфатического узла и о соотношении дренажных и миграционных процессов для нормальных и адаптивных ситуаций в суточном периоде. Не разработана проблема генетических различий в организации системы суточных биоритмов лимфоидных органов и структур (в том числе лимфоузлов), хотя имеются указания на генетический контроль лимфоэндокринных отношений и суточных биоритмов иммунной системы (Казначеев В.П., и др.,1980).

Цель исследования. В связи с вышеизложенным цель исследования состояла в изучении феномена суточной пространственно-временной организации лимфоидной системы и места лимфатических узлов в ней.

Для этого предполагалось решить следующие задачи.

1. Изучить роль рутинных синхронизирующих факторов: режимов питания, двигательной активности и сна-бодрствования в формировании пространственно-временной организации органов лимфоидной системы: тимуса, селезенки, лимфоидных структур лимфатических узлов различной локализации; а также лимфоидного пула периферической крови по хрономорфологическому анализу динамики содержания клеточных элементов в этих органах и структурах.

2. Изучить роль тимических, глюкокортикоидных гормонов и инсулина в механизме формирования суточной пространственно-временной организации лимфоидной системы на моделях ежедневных синхронизирующих инъекций гормональных препаратов в физиологических дозах с использованием хрономорфологического анализа динамики содержания лимфоидных клеток в тимусе, селезенке, лимфоидных структурах лимфатических узлов различной локализации и в лимфоидном пуле периферической крови.

3. Выявить различия в формировании суточных пространственно-временных организаций лимфоидных систем у животных с генетически предопределенным различным иммунным ответом (на SRBC) по хрономорфологическому анализу суточных динамик количества лимфоидных клеток в тимусе, селезенке, лимфоидных структурах лимфоузлов и в лимфоидном пуле периферической крови.

4. Изучить суточную пространственно-временную организацию лимфоидной системы при антигенной стимуляции по данным хрономорфологического анализа суточных динамик количества клеток в тимусе, селезенке, лимфоидных структурах лимфоузлов и в лимфоидном пуле периферической крови.

5. Изучить механизмы формирования суточной пространственно-временной организации дренажных систем и клеточных перераспределений в лимфатических узлах различной локализации в норме у животных с различным уровнем иммунного ответа (предопределенным генетически), при изменениях рутинной схемы (режимов сна-бодрствования, питания, двигательной активности) и при антигенной стимуляции.

Для этого были разработаны и использованы оригинальные методики, дающие представление об абсолютном объеме лимфоидных органов и их структур, а также об абсолютном количестве клеточных элементов в них. С помощью математических методов и логических операций, объединенных в оригинальные автоматизированные экспертные системы, выявлялись ритмические составляющие в динамических рядах, сформированных в 24-часовом периоде, оценивалась направленность и мощность перемещений лимфоидных клеток в системе лимфоидных органов, состояние микроокружения в лимфоидных структурах и дренажная деятельность лимфатических узлов.

В ходе исследования был разработан, всесторонне апробирован и компьютеризирован "Способ определения количества клеточных элементов в лимфатическом узле" (авторское свидетельство No 1629791 от 23.10.90 г., приоритет изобретения 29.07.88 г.). Этот способ реализован в виде пакетов диалоговых программ, позволяющих "превратить" персональный IBM-совместимый компьютер в автоматизированное морфометрическое место с "безбумажной" технологией: при этом реализованы помимо вышеупомянутого способа и основные общепринятые методики морфометрии.

1. Впервые представлены комплексные данные по механизмам формирования системы суточных биоритмов морфо-функционального состояния лимфатических узлов различной локализации как компонента единой суточной пространственно-временной организации лимфоидной системы (феномен суточной пространственно-временной организации).

2. Впервые описаны суточные биоритмы абсолютного количества клеточных элементов в структурах лимфатических узлов различной локализации в норме, при изменении схемы действия рутинных факторов (режимы питания, двигательной активности, сна-бодрствования), суточной динамики некоторых гормонов (глюкокортикоидных и инсулина) и при антигенной стимуляции.

3. Впервые показаны возможные лимфоэндокринные механизмы (через глюкокортикоидные гормоны и инсулин) действия рутинных синхронизирующих факторов: пищевого режима, чередования сна-бодрствования и двигательной активности на формирование суточной пространственно-временной организации лимфоидной системы и лимфатических узлов.

4. Впервые показаны регионарные различия в формировании суточных биоритмов активности дренажных систем и лимфоидных структур лимфатических узлов в норме, при измененной рутинной схеме и иммунизации, а также возможная роль в этих процессах генетического фактора и лимфоэндокринных отношений.

5. Впервые описана пространственно-временная организация ответа дренажных систем и лимфоидных структур лимфатических узлов в индуктивной фазе иммунного ответа на SRBC вне региона дренирования лимфоузлов.

6. Впервые представлены результаты, полученные при использовании разработанных автором метода количественного стерео-морфометрического анализа гистологического материала и автоматизированных экспертных систем для непрямой оценки перемещений лимфоидных клеток, состояния микроокружения лимфоидных структур и активности дренажных систем лимфатических узлов.

На защиту выносятся следующие положения.

1. Существует суточная пространственно-временная организация лимфатических узлов, входящая в суточную организацию лимфоидной системы и состоящая из чередования в 24-часовом периоде временных морфо-функциональных комплексов (структуры, их функции, связи между ними и с управляющими факторами); комплексы формируются под действием чередования внешних (режимы сна-бодрствования, питания, двигательной активности) и внутренних (лимфоэндокринные отношения с участием тимических, глюкокортикоидных гормонов, инсулина и факторов микроокружения) синхронизаторов при опосредованном влиянии генетического фактора.

2. Лимфоидные структуры и дренажные системы лимфатических узлов различной локализации в оппозитных точках суточного цикла являются то источником, то конечным пунктом перемещений лимфоидных клеточных элементов в зависимости от силы и места действия на животный организм внешних факторов, характера лимфоэндокринных отношений с участием глюкокортикоидных гормонов, инсулина, а также генетического фактора.

3. Лимфатические узлы, их лимфоидные структуры и дренажные системы участвуют в индуктивной фазе иммунного ответа (на SRBC), развивающегося вне дренируемого региона: в 1-е сутки накоплением жидкости и лимфоидных клеток путем создания измененных морфо-функциональных комплексов; во 2-3 сутки происходит восстановление временных морфо-функциональных комплексов и их чередования на фоне понижающегося тренда параметров и уменьшающегося размаха колебаний.

* * *

Все эксперименты производились на базе лаборатории иммуноморфологии Института клинической иммунологии СО АМН СССР (ныне - в составе НИЛКЭиЛ СО АМН СССР), руководителю которой, академику АМН СССР В.А.Труфакину и его сотрудникам: ст.н.с. А.В.Шурлыгиной и инженеру 1-ой категории И.Б.Белану автор приносит глубокую благодарность за помощь и консультации. Автор также благодарен м.н.с. Л.Г.Волковой (Крымской) (ИКИ СО АМН СССР) и н.с. В.М.Чесноковой (ИЦИГ СО АН СССР) за помощь в определении кортикостерона в плазме крови экспериментальных животных. Заместителя директора по научной работе НИЛКЭиЛ д.м.н. В.Н.Григорьева автор благодарит за поддержку и помощь.

Было использовано 708 инбредных мышей-самцов, традиционно используемых в иммунологических исследованиях: CBA, C57Bl, F1(CBAxC57Bl), а также аутбредные животные "SWISS". Все эксперименты организовывались по методу динамического ряда: в каждой временной точке число наблюдений сокращалось до одного, но в периоде число точек увеличивалось до технически максимального предела (Катинас Г.С., 1978), что дало возможность судить о закономерности динамики процесса (Катинас Г.С., Быков В.А.,1976). Были выполнены все известные технические требования к проведению биоритмологических экспериментов: тишина в виварии, постоянный технический персонал, высокий уровень чистоты в помещении. Мыши содержались в пластиковых клетках "Animark" (Финляндия), что позволяло наблюдать за их поведением при естественном световом режиме и адекватном кормлении. Предварительная синхронизация сообществ была не менее 40-45 суток при постоянном составе. Эксперименты проводились в разные времена года, но в каждом случае был свой контроль. Мыши забивались декапитацией; биопсийный материал забирался в течении 3-5 минут от момента извлечения животного из клетки.

Адаптация к внешним синхронизирующим факторам изучалась при "навязывании" животным модифицированного двигательного (плавание в 14.00) и пищевого режимов (кормление раз в сутки в 13.30-14.30) в течение 10 суток (мыши CBA).

Для выявления роли внутренних синхронизирующих факторов гормональной природы, действующих на лимфоидную ткань, использовалось инъецирование экзогенных гормональных препаратов тимических (тимоптин, тактивин), глюкокортикоидных (кортикостерон, гидрокортизон) гормонов и инсулина в определенное время суток и с определенной длительностью. Тимоптин вводился в течение 4 суток в 10.00 или в 20.30, внутрибрюшинно, по 0,05 мкг/особь. Тактивин вводился 10 раз ч/з день (20 дней) в 09.30 или в 20.30 в/бр по 0,01 гамм/особь. Гидрокортизон - 10 суток в 14.00 в/бр по 3 мкг/г веса. Кортикостерон - 4 суток в 10.00 или в 20.30, в/бр по 0,05 мг/особь. Инсулин - 10 суток в 14.00, п/к по 0,01 ЕД/особь. Каждая экспериментальная серия сопровождалась своим контролем - интактным и в части случаев функциональным (с введением физиологического раствора по аналогичной схеме).

Для изучения лимфоэндокринных связей глюкокортикоидных гормонов использовалось определение концентрации эндогенного кортикостерона (КС) в сыворотке периферической крови методом конкурентного связывания гормонов с белками.

Для создания Т-клеточнозависимого В-клеточного иммунного ответа (Davies A., et al., 1969) взвесь эритроцитов барана (SRBC) вводилась животным однократно внутрибрюшинно в дозе 200 млн. клеток на мышь в объеме 0,5 мл. Для оценки уровня иммунного ответа через 4 суток от иммунизации в селезенках животных определялось абсолютное количество ядросодержащих элементов и бляшкообразующих клеток (IgG-продуцирующие клетки) в жидком монослое в модификации ст.н.с. А.В.Шурлыгиной. Мыши двух линий - низкоотвечающей C57Bl и высокоотвечающей F1(CBAxC57Bl) - иммунизировались на максимуме суточного ритма ответа (утром) для изучения состояния лимфоидной системы и лимфоузлов в индуктивной фазе иммунного ответа (3 суток).

В органах лимфоидной системы определялось абсолютное количество ядросодержащих клеток путем ресуспендирования в точном объеме среды-199: костный мозг - 2 мл, тимус - 3 мл, селезенка - 5 мл, лимфоузел - 2 мл. В суспензии с помощью камеры Горяева определялась плотность клеток и затем рассчитывалось количество клеток в органе.

Для гистологического исследования использовались лимфатические узлы: соматические - паховые, аксиллярные; висцеральные - мезентериальные (латеральные из lymphocentrum subiliacum), бифуркационные (в некоторых сериях). При этом анализ охватывал все локализации лимфоузлов, что позволяло судить о всей совокупности лимфоузлов организма. С помощью ротационного микротома изготавливались тотальные серийные или полусерийные парафиновые срезы толщиной 5-7 мкм. Срезы подсчитывались при изготовлении с помощью специального счетчика, установленного на микротоме, окрашивались азур-2-эозином или гематоксилин-эозином и заключались в бальзам.

Совместно с академиком АМН СССР Ю.И.Бородиным и д.м.н. В.Н.Григорьевым автором была разработана методика стереоморфометрического анализа, дающая представление о количестве клеток и абсолютном объеме структур лимфатического узла (авторское свидетельство No 1629791 от 23.10.90 г., приоритет изобретения 29.07.88 г., название: "Способ определения количества клеточных элементов в лимфатическом узле").

Методика состоит из нескольких этапов.

1 этап. Изготовление серийных или полусерийных срезов.

2 этап. Калибровка квадратной тест-системы с высокой плотностью узлов в абсолютных размерах; морфометрия всей серии срезов: каждый элемент органа учитывается отдельно.

3 этап. Расчет площади, представляемой одной точкой тест -системы: по отношению площади, ограниченной всей тест-системой к количеству точек в тест-системе. "Переход" к объему, представляющему одну точку тест-системы, путем умножения предыдущей величины на среднюю толщину среза и отношение общего количества срезов к числу использованных для исследования.

4 этап. Расчет абсолютного объема каждой структуры через умножение числа точек на объем, представляющий точку тест-системы.

5 этап. Определение численной плотности укладки клеток в каждой структуре (Автандилов Г.Г., и др., 1981).

6 этап. Подсчет количества клеток в структуре как произведения абсолютного объема структуры и численной плотности укладки клеток в ней.

Способ был реализован в виде автоматизированного рабочего места на базе ПЭВМ ДВК-2М и PC IBM XT/AT. Массивы полученных данных обрабатывались в последовательности: гармонический анализ Фурье, единичный и двухэтапный COSINOR -анализ (Nelson W.,et al.,1979) с пробными периодами 24 и 12 часов. Средние уровни сравнивались с использованием непараметрического критерия U Вилкоксона-Манна-Уитни (Катинас Г.С.,1978, Гублер Е.В.,1978). Достоверность аппроксимации оценивалась следующими способами: 1) при сравнении расчетной амплитуды процесса c доверительным интервалом разброса параметра вокруг среднего уровня; 2) при сравнении совокупности отклонений исходных данных (исходного динамического ряда) от регрессионной кривой с совокупностью отклонений исходных данных от среднего уровня; 3) при наличии достоверного различия между двумя любыми экстремумами динамического ряда или плексограммы по пробному периоду с использованием U-критерия. Количественные различия в динамике выявлялись с помощью специальной программы, позволяющей в скользящем режиме сравнивать экстремумы, совпадающие по времени, с помощью U-критерия.

Экспертная система SMD статистико-логического типа предназначалась для оценки перемещений мигрирующих и рециркулирующих клеток (с учетом их пролиферации и деструкции) в лимфоидной системе по цифровым данным абсолютного количества клеток в органах и структурах. Дополнительно использовались данные: временной ряд, уровень двигательной активности в баллах, концентрация КС в плазме крови. Основной идеей формирования алгоритма программы было то, что в различных отрезках времени имеются различные направления передвижения лимфоидных элементов. Экспертная система SMLN (статистико-логическая) предназначалась: 1) для оценки состояния микроокружения в структурах лимфатического узла на основе динамики параметров каждой структуры: ее абсолютного объема, численной плотности укладки клеток в единице объема и абсолютного количества клеток (как произведение двух предыдущих); 2) для оценки баланса клеток и жидкости (активность дренажных систем по динамике их абсолютного объема) в лимфоузле. Реализация программных средств выполнена на PC IBM XT/AT (язык программирования GWBasic).

Автор благодарен профессору В.В.Губареву (НЭТИ) и ст.н.с. А.С.Толстикову (СИБНИИМ) за консультативную помощь при создании экспертных систем.

* * *