Актуальность работы
жүктеу/скачать 75 Kb.
|
| Введение
АКТУАЛЬНОСТЬ РАБОТЫ Масла большинства дикорастущих растений и культурных сортов принадлежат к числу весьма ценных лекарственных средств, давно используемых в лечебной практике. Они применяются как самостоятельные лекарственные препараты для лечения ожогов и ран, так и в качестве вспомогательных веществ для приготовления инъекционных растворов, мазевых и суппозиторных основ. Кроме того, растительные масла и отходы их производства могут служить источником получения новых лекарственных средств, обладающих уникальным комплексом фармакологических свойств. Лечебный эффект жирных растительных масел обусловлен наличием целого комплекса биологически активных соединений, таких как, токоферолы, эссенциальные фосфолипиды, полиненасыщенные жирные кислоты, фитостерины и др. В последние годы наблюдается тенденция расширения сырьевой базы за счет внедрения новых нетрадиционных растений и отходов пищевой промышленности. В Воронежском госуниверситете разработана и запатентована методика получения масла из семян амаранта гибридного (Oleum Amaranthacta). Новый способ экстракции и очистки позволяют получить масло с максимально возможным содержанием биологически активных веществ. В настоящее время в России организовано промышленное производство масла семян амаранта, которое активно внедряется на фармацевтический рынок в качестве биологически активной добавки. В связи с этим возникает необходимость подробного изучения химического состава, совершенствования способов извлечения биологически активных веществ и методов стандартизации жирных растительных масел. Одним из основных компонентов липидной фракции масла являются фосфолипиды, которые обладают гепатопротекторным, иммуномоделирующим, антиоксидантным и регенерирующим действием. Содержание фосфолипидов в растительных маслах в соответствии с 5 требованиями нормативной документации приводится в суммарном виде. Однако, не все фосфолипиды обладают одинаковым фармакотерапевтическим эффектом. Поэтому весьма актуальным представляется изучение фосфолипидного состава масел, используемых в фармации, а также разработка современных методов разделения и анализа этой группы веществ. ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ Целью диссертационной работы явились исследования по разработке унифицированных методик разделения, идентификации и количественной оценки фосфолипидов масла семян амаранта с последующей стандартизацией изучаемого объекта по всем параметрам качества. Для реализации поставленной цели необходимо решить следующие задачи: - исследовать и оценить физико-химические показатели качества масла семян амаранта; - установить жирнокислотный состав липидной фракции масла семян амаранта; - изучить возможности сорбционного выделения фосфолипидов из липидного комплекса масла семян амаранта сорбентами различной природы; - выбрать оптимальные параметры для фракционирования и идентификации фосфолипидов методом зонального высоковольтного электрофореза на бумаге; - разработать методику количественного определения фосфолипидов в изучаемых объектах; - предложить способ стандартизации масла семян амаранта. НАУЧНАЯ НОВИЗНА Проведена оценка качества масла из семян амаранта по физико-химическим показателям, регламентируемым нормативной документацией. Методом газожидкостной хроматографии установлен жирнокислотный состав липидной фракции масла семян амаранта. Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что изучаемое масло идентично растительным маслам линолевой группы с высокой долей пальмитиновой и олеиновой кислот. Изучен состав липидной фракции масла семян амаранта и установлено наличие следующих компонентов: сквален, стерины, токоферолы, фитостерины, фосфолипиды, свободные жирные кислоты и глицериды жирных кислот. Изучена сорбционная активность фосфолипидов по отношению к аниониту АВ-17-2П, катиониту КРС, неионогенному сорбенту Стиросорб и высказано предположение о механизме сорбции. Результаты исследования' положены в основу выделения и фракционирования фосфолипидов из масла семян амаранта. Приоритетность данного исследования подтверждена патентом на изобретение № 2169734 РФ по заявке № 99125174 от 30.11.1999. Разработаны методики количественного определения фосфолипидов, в основе которых лежат современные физико-химические методы анализа, такие как хроматография в тонком слое сорбенте, высоковольтный электрофорез, спектрофотометрия в УФ-области. По разработанным методикам в масле, полученном из семян амаранта, впервые установлен качественный и количественный состав фосфолипидного комплекса. ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ Найден новый перспективный источник получения ценных биологически-активных веществ, обладающих гепатопротекторным, иммуномоделирующим и противоожоговым действием. 7 Определены физико-химические показатели качества масла семян амаранта. Показана возможность использования сорбционных методов для выделения и фракционирования фосфолипидов с помощью сорбентов различной природы. Изучен механизм сорбции фосфолипидов ионогенными и неионогенными сорбентами. Результаты исследования позволили усовершенствовать метод выделения и фракционирования фосфолипидов из масла семян амаранта Разработаны новые методики идентификации и количественного определения биологически-активных компонентов масла семян амаранта — фосфолипидов с помощью современных физико-химических методов. Проведена сравнительная оценка хроматографических, спектральных и электрохимических методов анализа, позволяющих вести контроль за содержанием фосфолипидов в различных растительных объектах. Разработанные способы фракционирования и методики анализа фосфолипидов могут быть использованы на фармацевтических и пищевых предприятиях для получения лечебно-профилактических препаратов и их стандартизации. ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ В ПРАКТИКУ Проведено внедрение разработанных методик выделения, идентификации и количественного определения фосфолипидов в растительных маслах в ЗАО «Инновационные системы ОКБМ» г.Воронежа (акт о внедрении от 25.05.2004); при проведении учебных и научно-исследовательских работ на кафедре органической химии и в «Лаборатории инструментальных методов пищевой химии» Воронежской Государственной Технологической Академии (Акт о внедрении от 24.03.2003 г.), а также на Фармацевтическом факультете Воронежского Госуниверситета (Акт № 5 от 17. 0.1..2002). ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫДВИГАЕМЫЕ НА ЗАЩИТУ - результаты определения основных физико-химических показателей качества амарантового масла; - данные по составу высших жирных кислот в липидной фракции масла семян амаранта; - методики сорбционного выделения фосфолипидов из фосфолипидного комплекса; - методика разделения и идентификации фосфолипидов методом зонального высоковольтного электрофореза; - выбор оптимальных параметров для разделения фосфолипидов в тонком слое сорбента и разработанная на основе этих данных методика количественного определения фосфолипидов; - изучение качественного и количественного состава фосфолипидов масла семян амаранта. АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ Основные результаты исследования доложены на: - Всероссийской конференции «Химический анализ веществ и материалов» (г. Москва, 2000 г); - IV Международном симпозиуме "Новые нетрадиционные растения и перспективы их использования" (г. Москва, 2001 г); - IX и X Российском национальном конгрессах "Человек и лекарство" (г. Москва, 2002, 2003 гг); - IX Международной конференции по теоретическим вопросам адсорбции и адсорбционной хроматографии (г. Москва, 2002 г ); - Всероссийском симпозиуме «Современные проблемы хроматографии» (г. Москва, 2002 г); - Всероссийской конференции «Фагран-2002» (г. Воронеж). ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано 18 работ, в том числе 7 статей, 10 тезисов, 1 патент. Диссертация изложена на 149 страницах машинописного текста, содержит 22 рисунка, 27 таблиц и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3 глав собственных исследований, общих выводов, библиографического указателя, включающего 186 источников и Приложений. 10 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Биологические особенности растения Амарант В настоящее время в средней полосе России внедряется новая культура амарант — растение, дающее злакоподобные зерна с повышенным содержанием витаминов и минеральных солей; ценным набором биологически-активных веществ; высоким содержанием белка, сбалансированного по незаменимым аминокислотам [141]. Интродукция амаранта в Россию имеет давнюю историю. К сожалению, этот процесс носил импульсивный характер без глубоких фундаментальных и прикладных исследований. В 30-е годы изучая флору Южной Америки, Н.И.Вавилов заинтересовался этим растением и активно начал пропагандировать и внедрять его в России. Однако после гибели ученого начатая по его инициативе исследовательская работа с амарантом была прекращена. И лишь в последние годы благодаря усилиям профессора Санкт-Петербургского университета И.М.Магомедова и профессора Казанского университета И.А.Чернова амарант стали внедрять в России не только в качестве продовольственной и кормовой, но и в качестве лекарственной культуры [79,140]. Представители рода амаранта распространены главным образом в тропических и субтропических областях земного шара, но могут произрастать и в умеренном климате. Родиной амаранта является Южная Америка. Амаранты - светолюбивые растения, поселяющиеся на открытых местах. Это однолетнее травянистое растение семейства амарантовых (Amaranthaceae), высотой 1- 1,5 м. Листья очередные или супротивные, цельные, без прилистников. Верхние листья имеют короткие черешки, у нижних листьев черешки во много раз длиннее. Верхние листья при этом не затеняют нижние, так как черешки последних продолжают расти, пока их листовые пластинки не выйдут из тени верхних. Цветки мелкие, актиноморфные, безлепестные, однополые или обоеполые, с чашечкой из 5 или чаще 1-4 обычно сухих и пленчатых чашелистиков или совсем без них, 11 как правило, с зелеными или различно окрашенными перепончатыми прицветничками и прицветниками. Именно из-за пленчатых листочков околоцветника род и семейство и получили свое название от слова «амарантос», что означает «неувядающий цветок» (от греческого: а - не maraino - увядать, anthos - цветок). Тычинок 5, пестик из 2-3 плодолистиков, с лопастным или головчатым рыльцем и верхней одногнездной завязью. Цветки одиночные, но чаще собранные в сложные бокоцветные соцветия - кисти, метелки. Плод - орех, реже ягода. Семена мелкие, округлые или линзовидные, гладкие в прочной оболочке, с кольцевым зародышем, окружающим обильный перисперм. Семена хорошо приспособлены к выпадению из плода и разносу с почвой на ногах животных и человека [139]. Существует около 60 видов амаранта, большитнство из них считаются сорными растениями, 12 видов окультурены и используются как овощные, зерновые, кормовые и декоративные растения. Наиболее распространенные из них Амарант хвостатый (Amaranhtus caudatus), Амарант метельчатый (Amaranhtus paniculatus), Амарант запрокинутый (Amaranhtus retroflexus), Амарант зеленый метельчатый (Amaranhtus viridis) (рис. 1.1) [139]. Рис. 1.1. Amaranthus paniculatus (а) и Amaranthus caudatus (б). 12 У амаранта хвостатого с концов веток спускаются вниз длинные темно-малиновые шнурки - соцветия (рис. 1.1.6). Другие виды: амарант печальный и амарант багряный, известный под названием амарант метельчатый, с прямыми кроваво-красными цветами (рис. 1.1.а). Семена амаранта очень малы, подобны песчинкам, а их число может доходить до 500 тысяч в одной метелке. Зерновой амарант дает семена, по химическому составу сходные с зернами злаков, однако, поскольку он не принадлежит к семейству злаковых, его называют псевдозлаком. 1.2. Химический состав растения Амарант. Семена амаранта содержат в среднем 15-17% белка, 5-8% масла и 3,7-5,7% клетчатки, что выше, чем у большинства зерновых культур (для сравнения, содержание белка у кукурузы составляет 10—12,6 %, жиров — 4,6— 6,7 %; у риса белка - 8 %, жиров - 1,1 %; у пшеницы белка — 9—14 %, жиров — 1,1-3,4%). В листьях амаранта обнаружены следы витамина Вх2. Содержание аминокислоты лизина в белке амаранта в два раза больше, чем у пшеницы, и в три раза больше, чем у кукурузы и сорго. Как известно, лизин является ценной незаменимой аминокислотой, так как в животных тканях он не может синтезироваться, а поступает в организм только с пищей. При недостатке лизина пища просто не усваивается и белок «проходит» организм транзитом. Если оценить идеальный белок (близкий к яичному) в 100 баллов, то молочный белок казеин будет иметь 72 балла, соевый — 68, пшеницы — 58, кукурузы — 44, а амаранта - 75 баллов [42,141]. По содержанию таких аминокислот, как треонин, фенилаланин, тирозин и триптофан, белок амаранта приравнивается к белку женского молока. Следует отметить, что листья амаранта наиболее богаты белком до и во время цветения, а проросшее семя характеризуется большим количеством аминокислот, особенно лизина. В семенах амаранта содержатся полиненасыщенные жирные кислоты: линоленовая, пальминовая, стеариновая, линоленовая, архидоновая. Их содержание в липвдах амаранта составляет до 77%, причем 50% приходится 13 на линоленовую кислоту, из которой в организме синтезируются незаменимые линоленовая и архидоновая кислоты. Кроме того, в химический состав растения амарант входят следующие соединения: рибофлавин (витамин В2), токоферолы (витамин Е), тиамин (витамин Bi), витамины группы Д, хлорофилл, фосфолипиды, желчные кислоты, стероиды, фитостерины и сквален [146]. Зерно амаранта в отличие от других зерновых содержит очень мало глютелинов. Это важно для тех, кто обладает повышенной чувствительностью к зерновым вследствие дефицита ферментов, гидролизующих глютелин, и поэтому нуждаются в аглютелиновой диете. Еще одно ценное свойство амаранта — содержание в нем легко усвояемых пищевых волокон (клетчатка, пектин, целлюлоза). Пищевые волокна адсорбируют различные химические, в том числе канцерогенные вещества, связывают и выводят их из организма. По содержанию пищевых волокон амаранта превосходит пшеницу в 3 раза, кукурузу, рис и овес в 1,5 раза. Такой широкий спектр ценных биологически-активных и питательных веществ, а также уникальная особенность растения амарант приспосабливаться к неблагоприятным условиям внешней среды, делают его одной из самых перспективных культур XXI века. 1.3. Физиологические особенности амаранта. Своеобразие амаранта определяется в значительной степени типом его фотосинтеза. Подобно кукурузе, сорго, просо, сахарному тростнику, амарант обладает С4—путем фотосинтеза. Вместе с тем в отличие от перечисленных растений, которые представляют собой малатные формы, амарант относится к аспартатным представителям С4—растений, так как первичными продуктами фотосинтеза у него являются дикарбоновые четырехуглеродные аминокислоты, к которым относится аспарагиновая кислота. Аспартат - исходное соединение для образования лизина, высоким содержанием которого отличается амарант. Как С4—растение, то есть 14 растение тропического происхождения, амарант характеризуется большой скоростью фиксации углекислоты в расчете на единицу поверхности листа, быстро растет и развивается, обладает мощной продуктивностью при условии высокой инсоляции и температуры. Листья амаранта содержат два типа хлоропластов: хлоропласты обычного гранального вида в мезофильных клетках и большое количество крупных хлоропластов, обладающих мелкими гранами (или совсем их не имеющие), в клетках, окружающих проводящие пучки (обкладка) [68]. СО2, диффундирующий в лист через устьица, попадает в цитоплазму клеток мезофила, где при участии фосфоенолпируват (ФЕП)-карбоксилазы взаимодействует с ФЕП, образуя четырехуглеродную щавелевоуксусную кислоту (ЩУК). В присутствии аммиачной формы азота ЩУК в цитоплазме превращается в аспарат, что характерно для амаранта. Затем аспарат переносится в митохондрии клеток обкладки, где дезаминируется, а образовавшийся ЩУК восстанавливается до малата (яблочной кислоты), последний декарбоксилируется до пирувата и углекислого газа. Углекислота поступает в хлоропласты, взаимодействует с рибулозобисфосфатом (РБФ) и включается в основной Сз-путь фотосинтеза — цикл Кальвина. Схема фотосинтеза представлена на рис. 1.2. Выяснение механизма фотосинтеза С4-растений делает понятным и еще одну физиологическую особенность амаранта — высокую засухо-, термо-, и солеустойчивость. У С4-растений фотосинтез может осуществляться при закрытых устьицах. Фосфоенолпируват (ФЕП) — карбоксилаза обладает большим сродством к углекислоте, благодаря чему способна интенсивно использовать СОг даже при его низких концентрациях, что происходит при полузакрытых устьицах. Закрывание устьиц на наиболее жаркое время дня сокращает потери воды за счет транспирации (испарения). Интересно, что и сопротивление мезофилла диффузии СО2 у С4— растений значительно меньше: оно составляет 0,3-0,8 см/с, в то время как у Сз-форм — 2,8 см/с. Низкая величина сопротивления диффузии клеток мезофила для СОг при более высоком сопротивлении устьиц для воды 15 благоприпятствует повышению интенсивности фотосинтеза при пониженной транспирации у С^растений. Хлоропласт РБФ Цикл Кальвина ФГА —> Сахара —>Крахмал, Алании Цитс Аспартат ЩУК плазма СО ФЕ1Г«------- \ Митохощпмга/ Цитоплазма Алании NH2 Пируват ^_________ /Пируват АТФ+ ГТФ\ ФЁП АДФ+ГДФ+Ф Хлоропласт Рис. 1.2. Схема С4-фотосинтеза у амаранта: РБФ - рибулозобисфосфат; ФГА - фосфоглицериновый альдегид; ФЕП - фосфоенолпируват; ЩУК -щавелевоуксусная кислота. 16 1.4. Характеристика и способы получения масла семян амаранта. Масло, полученное из семян амаранта, обладает ценным набором биологически активных веществ. В настоящее время в России организовано опытное производство масла семян амаранта, которое рекомендуется использовать как лечебное и профилактическое средство. Фармакопейные препараты жирных масел получают путем обработки семян и плодов обычными растительными маслами [140], экстракцией и холодным прессованием [92]. Для приготовления инъекционных растворов применяют масла, получаемые только холодным прессованием [27]. Отжим семян в холодных прессах приводит к меньшему выходу масел, но эти масла содержат меньше сопутствующих веществ и значительно менее окрашены. При горячем способе прессования удается отжать максимальное количество жирного масла, однако, увеличивается и выход сопутствующих веществ (в первую очередь красящих), а также высокоплавких фракций масла (например, тристеарина). Экстракционный способ получения масла различными органическими растворителями (чаще всего низкокипящими фракциями бензина) позволяет получить больший выход масла, но и с большим количеством нежелательных сопутствующих веществ (смол и пигментов). Если полученные таким способом масла используются для пищевых и медицинских целей, то они подвергаются тщательному рафинированию. Авторы работы [173] провели сравнительный анализ образцов масла зародышей пшеницы, полученные экстракцией и холодным прессованием. В работе показано, что биохимический состав масел, полученных разными методами, в основном идентичен. Наряду с этим в составе масла, полученного прессованием, содержится большее количество глико- и фосфолипидов, восков, стеринов. Экстракцией в большей степени извлекаются моно- и диглицериды, свободные жирные кислоты, углеводороды. В работе [160] предложен способ получения масла из семян амаранта путем прямой экстракции гексаном с последующим отгоном растворителя в 17 вакууме в среде азота, очистки масла щелочью и специальными сорбентами. Недостатком данного способа является отсутствие дополнительных стадий, позволяющих предотвратить окисление биологически активных соединений, содержащихся в масле, примесями кислорода, которые всегда содержит газообразный азот, используемый в технологическом процессе. Макеевым A.M. с сотрудниками [80] разработана и запатентована уникальная технология получения масла из семян амаранта гибридного (Amaranthus hybridicus), включающая прямую экстракцию гексаном в среде углекислого газа с последующей отгонкой растворитля при температуре не выше 40 °С и давлении 9,81-19,62 кПа. В цитируемом источнике показано, что СОг-режим способствует большему выходу фракций стеринов, их эфиров, токоферолов, а также сквалена, являющихся основными биологически активными соединениями данного масла. Анаэробное и ингибирующее действие углекислого газа на окислительные процессы позитивно влияет на стабилизацию сквалена, токоферолов и увеличение их выхода. Сравнительные данные по содержанию БАВ в образцах масла, полученных экстракцией в среде гелия, азота и углекислого газа доказывают целесообразность использования последнего для создания условий,-обеспечивающих максимальных выход ценных биологически активных соединений. Уникальным масло семян амаранта делают как минимум три компонента: сквален, витамин Е в форме токотриенола и большое содержание полиненасыщенных жирных кислот [81]. Благодаря сбалансированной комбинации веществ, такое масло нормализует гормональную систему и улучшает обмен веществ у человека и животных. Масло семян амаранта сочетается с любым медикаментозным лечением; ликвидирует побочные явления после применения медикаментов или других методов активной терапии; улучшает функцию почек, печени; уменьшает проявление токсикозов; нормализует показатели мочи и крови; мягко воздействует на слизистую оболочку желудка и кишечника; восстанавливает работу клеток и эпителия; подавляет клетки патогенных Список литературы жүктеу/скачать 75 Kb. Достарыңызбен бөлісу:
|