Цель занятия. Ознакомиться с устройством и принципом работы светового микроскопа. Освоить методики приготовления препаратов живых клеток биологических объектов и технику микроскопирования. Задания

1. 
   Изучить устройство и правила пользования микроскопом.
   
2. 
   Приготовить препараты микробных культур: грибов, дрожжей, бактерий. Просмотреть, зарисовать.
   

Теоретические сведения

При помощи микроскопов изучают морфологию клеток микроорганизмов, проводят первичную идентификацию ( от лат identificare- отождествление) исследуемых организмов, наблюдают рост, развитие, характер формирования микробных ассоциаций, ценозов ( сообществ) в различных субстратах.

Предметный столик имеет центровку при помощи винтов 19 и взаимно перпендикулярное перемещение препарата. Перемещение в продольном направлении осуществляется вращением рукоятки 12, в поперечном – рукоятки 18.Отсчет перемещения в обоих направления может производиться по шкалам и нониусу с точностью до 0,1 мм. Верхняя часть тубусодержателя заканчивается головкой 15, служащей для крепления револьвера и тубуса .

.

Оптическая система микроскопа включает окуляры 10, объективы 9 и осветительное устройство, предназначенное для освещения рассматриваемого объекта Все части оптической системы строго центрированы относительно друг друга.. Главной частью микроскопа являются объективы ( от лат.objectum – предмет), представляющие собой систему линз Из них лишь одна, так называемая фронтальная ( наружная линза, обращенная плоской стороной к препарату), производит увеличение. Все остальные корригируют изображение и поэтому называются коррекционными.

Объективы бывают двух систем: ахроматы и апохроматы. Ахроматы устроены проще, но име­ют ряд недостатков, ко­торые устранены в более сложных апохроматических объективах. При применении объективов апохроматов достигается полная ясность изобра­жения и устраняется хроматическая аберра­ция. Последнее особен­но важно при микроско­пии цветных объектов. Все объективы (ахрома­ты и апохроматы) разделяются на сухие и иммерсионные. Если между объективом и рассматриваемым препаратом находится воздух, то подобный объектив — сухой. Если же объектив погружен в жид­кость, заполняющую пространство между его фронтальной линзой и препаратом, то подобный объектив называется погруженным, или иммерсионным.

Иммерсионные объективы имеют преимущество перед сухими. При микроскопии с помощью сухой системы световые лучи, идущие от зеркала через конденсор 8 в объектив, проходят через неоднород­ные среды, различающиеся показателями преломления. Так, из воз­духа (показатель преломления 1,0) пучок световых лучей попадает в стекло (показатель преломления 1,52), затем опять в воздух и, наконец, во фронтальную линзу объектива. При каждом из этих переходов часть лучей, преломляясь на границе разнородных сред, отклоняется в сторону и не попадает в объектив (рис. 2). В результате поле зрения освещается недостаточно, что особенно важно при пользова­нии сильными системами, где очень малы фронтальные линзы. Чтобы избежать этого, объектив погружают в каплю жидкости (им­мерсионное масло, вода), показатель преломления которой близок к показателю преломления стекла. Вторую каплю той же жидкости наносят на конденсор. Таким образом, конденсор, жидкость, препа­рат, жидкость и объектив представляют собой единую систему, не вызывающую отклонения светового луча.

Иммерсионные объективы на оправе имеют черную круговую нарезку и обозначение: I- immersion (иммерсия); HI –homogen immersron - (однородная иммерсия), OI-oil immersion, МИ-масляная иммерсия или ВИ- водная иммерсия.

Характеристика объектива состоит из его собственного увеличения, фокусного расстояния и численной апертуры. Собственное увеличение объектива ( V ) определяют по формуле: V = I/f , где I - оптическая длина тубуса или расстояние между фокальной плоскостью объектива и плоскостью изображения, составляющее для разных объективов 128-180 мм, f - фокусное расстояние объектива. Чем меньше фокусное расстояние, тем сильнее объектив, больше его собственное увеличение. Так, объективы с увеличением х8, х40, х90 имеют соответственно рабочие расстояния 13,8; 0,6 и 0,12 мм. В зависимости от того, с каким объективом работаешь, для его фокусировки выбирается макрометрический или микрометрический винт. На корпусе объектива выгравированы обозначения собственного увеличения ( х8, х20, х40, х90) и численная апертура. Численная апертура – произведение показателя преломления среды на синус половины отверстного угла ( рис 3 ), для объектива это характеризующий угол, под которым еще может входить в объектив наклонный луч.

Окуляры ( от лат.okularus –глазной) состоят из двух плоско-выпуклых линз (собирающей и глазной). Окуляр служит непосредственным продолжением «линз» (хрусталиков ) глаз человека. Окуляры увеличивают изображение, получаемое с помощью объектива, в 5-10-15 раз. Такие простые окуляры, чаще всего Гюйгенса или Рамсдена, обычно применяют с ахроматическими объективами. При работе с апохроматами нужно применять специальные, так называемые компенсационные, окуляры. В этих окулярах линзы подобраны таким образом, что они дают хроматическую ошибку, обратную остаточному хроматизму апохромата и потому ее компенсирующую. Назначение окуляра – прямое мнимое увеличение действительного обратного и увеличенного изображения, которое дает объектив. На оправе окуляра гравируется цифра, показывающая, во сколько раз данный окуляр повышает собственное увеличение объектива.

В окуляре может быть вмонтирована специальная указка, с помощью которой можно обратить внимание исследователя на какой-нибудь из находящихся в поле зрения объект или часть объекта. Для этого перемещают предметный столик таким образом, чтобы исследуемый объект был на кончике указки.

Осветительное устройство (или осветительный аппарат Аббе) составляют зеркало, ирис-диафрагма и конденсор (рис. 3). Оправа зеркала вмонтирована в специальной вилке, благодаря чему оно может вращаться в двух взаимно перпендикулярных направлениях. Одна из отражающих поверхностей зеркала плоская, другая вогнутая.

Ирис-диафрагма, сокращаясь по типу зрачка, позво­ляет регулировать величину светового пучка, поступающего в кон­денсор. Это важно потому, что светосила (апертура) конденсора всегда должна быть немного меньше, чем у объектива.

Конденсор представляет собой систему линз, вмонтированных в коническую металлическую оправу. Чем больше линз, тем больше светосила конденсора. Для получения отчетливого изображения не­обходимо, чтобы препарат оказался в фокусе конденсора. С этой целью конденсор передвигается в вертикальном направлении в пре­делах 20 мм.

Увеличительная способность микроскопа ( коэффициент увеличения) определяется произведением увеличения окуляра (F_ok) и увеличением объектива (F_oб)

V = F_ok х F_oб

Пучок света, отраженный зеркалом, через диафрагму попадает 'в конденсор. Преломившись в его линзах, лучи попадают на препарат в виде конуса, вершина которого обращена к препа­рату. Пройдя сквозь препарат, лучи вновь расходятся в виде конуса и попадают в объектив. Преломившись в линзах объектива, лучи на выходе из него дают увеличенное, но обратное изображение. Это изображение строится лучами на некотором расстоянии от задней линзы объектива, на уровне диафрагмы окуляра, г. е. в фокальной плоскости глазной линзы. Из окуляра лучи проходят в глаз, и на его сетчатке возникает мнимое увеличенное обратное изо­бражение. Таким образом, объектив увеличивает рассматриваемый предмет, а окуляр увеличивает изображение. Следовательно, способность микроскопа к увеличению есть сумма увеличений, обеспе­чиваемых объективом и окуляром. Большинство объективов дает наилучшее изображение при длине тубуса 160 мм, а окуляры, как правило, рассчитаны на расстояние 250 мм, что соответствует рас­стоянию нормального невооруженного глаза от читаемого текста. Общее увеличение микроскопа (V) может быть определено с учетом этих данных по формуле:

V = (160/ f_oб) х (250/f_ok)

где f_oб — фокусное расстояние объектива; f_ok — фокусное расстоя­ние окуляра.

Разрешающая способность микроскопа определяется размером наименьшей частицы, которую можно увидеть в данный микроскоп, т. е. чем меньше размер частицы, тем выше разрешающая способ­ность микроскопа. Разрешающая способность микроскопа зависит также и от длины волны света, которым пользуются при микро­скопии. Чем меньше (короче) длина волны, тем выше разрешающая способность.

В современных микроскопах при использовании видимой части дневного света (длина волны от 0,00004 до 0,00007 мм) удается рассмотреть объекты не менее 0,00002 мм. Поскольку разрешающая способность глаза равна 0,2 мм, то эта величина должна быть уве­личена минимум в 1000 раз. Это увеличение называется полезным. Применение более коротких ультрафиолетовых волн позволяет уве­личить разрешающую способность микроскопа только вдвое.

При хранении и работе со световым микроскопом необходимо выполнять следующие правила:

1. Перед началом работы следует проверить чистоту линз и, в случае необходимости, протереть их (только снаружи) мягкой тканью или волосяной кисточкой.

2.После работы с иммерсионной системой фронтальную линзу объектива тщательно очищают от масла мягкой тканью, смоченной водой или спиртом. Не рекомендуется применять вату или марлю, оставляющие волокна и нити.

3.Вблизи микроскопа не допускается держать открытыми сосуды с кислотами и нагревать бани.

4.Механически трущиеся части микроскопа не менее 2-3 раз в год следует протирать ксилолом или бензином и смазывать маслом.

5.После работы микроскоп закрывают чехлом или помещают в ящик.

6. Для перенесения микроскопа его берут за тубусодержатель и поддерживают снизу за основание в вертикальном положении.

Неправильное или недостаточное освещение не позволит использо­вать полностью все возможности микроскопа.

В отличие от старых микроскопов, которые были рассчитаны на освещение дневным естественным светом, в современных микроскопах для освещения применяют лишь свет от электрического осве­тителя. Осветители в качестве источника света, как правило, имеют низковольтную лампочку (8 В, 20 Вт). При работе с конденсором Аббе независимо от источника света нужно пользоваться только плоским зеркалом.

Хорошее освещение достигается при установке света по методу Келлера. Для этого устанавливают осветитель на расстоянии 30— 40 см от микроскопа и, перемещая патрон с лампочкой или весь осветитель, добиваются четкого изображения нити накала лампы на закрытой полностью диафрагме конденсора так, чтобы это изо­бражение полностью заполняло отверстие конденсора (объектив 8х, конденсор поднят до упора). Закрыв ди­афрагму осветителя (оставляют лишь небольшое отверстие размером не более 1,0 – 1,2 мм в диаметре), открывают диафрагму конденсора и, перемещая конденсор, добиваются резкого изображения диафрагмы осветителя в поле зрения микроскопа. Чтобы яркий свет не слепил глаза, пред­варительно уменьшают с помощью реостата накал нити лампы. И, наконец, с помощью зеркала изображение отверстия диафрагмы устанавливают в центре поля зрения, а диафрагму осветителя откры­вают так, чтобы было освещено все видимое поле зрения. Раскры­вать больше диафрагму не нужно, так как это не усилит освещен­ности, а лишь уменьшит контрастность за счет рассеянного света.

Установку света по Келеру целесообразно применять и при темно-польной и фазово-контрастной микроскопии.

Эффект темного поля создается при помощи специального конденсора (параболоид или кардиоид) или обычного конденсора с прикрытой кружком черной бумаги центральной частью.

Для наблюдения в темном поле свет устанавливают и центри­руют, как для светлого поля, и, заменив конденсор на специаль­ный, прибавляют свет до максимума, раскрыв до отказа диафрагму и включив реостат осветителя.

Препараты для исследования в темном поле должны быть при­готовлены на очень чистых предметных и покровных стеклах опре­деленной толщины: предметные — не более 1,2 мм, покровные -0,17 мм. Готовят препарат по типу раздавленной капли. Между препаратом и конденсором помещают иммерсионное масло — каплю его наносят на верхнюю линзу конденсора. После этого, поднимая и опуская конденсор, добиваются появления в поле зрения светлого пятна, которое с помощью специальных регулировочных винтов конденсора выводят в середину поля зрения. Затем с помощью нуж­ного увеличения переходят к наблюдению.

Метод предназначен для исследования прозрачных объектов, детали строения которых оптически мало различаются между собой. Основная масса живых клеток прозрачна. Световые лучи не меняют своей амплитуды проходя через них, но изменяются по фазе. Иначе говоря, распространение световых волн в прозрачных однородных объ­ектах не сопровождается потерей интенсивности света. Меняется только скорость прохождения через объект по сравнению со скоро­стью распространения света в окружающей среде. Она будет большей или меньшей в зависимости от того, будет ли показатель свето­преломления объекта соответственно меньше или больше, чем в окружающей среде. Эти изменения, называемые иначе фазовыми, так как при них меняются только фаза колебаний прошедшего све­та, характерны для большинства биологических объектов (живых клеток, срезов тканей и т. п.).

Человеческий глаз хорошо определяет изменения интенсивности света, наступающие при прохождении через окрашенные (амплитуд­ные) препараты, когда меняется амплитуда колебаний света. Однако глаз не способен воспринимать фазовые изменения света. Поэтому прозрачные неконтрастные (фазовые) объекты при обычном микро­скопическом исследовании остаются невидимыми.
Фазово-контрастная микроскопия позволяет превратить «фазовый» препарат в «амплитудный».

Для работы по этому методу в дополнение к световому микроскопу необходимо иметь специальное устройство, состоящее из фазовых объективов с пометкой Ф, конденсоров с набором кольцевых диафрагм и вспомогательного микроскопа ( оптическое устройство, помещаемое в тубус вместо окуляра при установке фазового контраста).

Установку устройства производят следующим образом. Конденсор и объектив заменяют фазовыми. Фазовый конденсор поворотом ре­вольверного диска устанавливают на 0. Это положение соответствует обычному светлопольному конденсору. Затем, поместив на предмет­ный столик препарат и сфокусировав его, приступают к наладке освещения. При исследовании методом фазового контраста основ­ным условием является оптимальная освещенность, которая дости­гается установкой света по Келлеру. После этого устанавливают револьверный диск на то число, которое соответствует выбранному объективу; например, при объективе 40х в окошечке также уста­навливают цифру 40. Вынув окуляр, на его место устанавливают вспомогательный микроскоп и настраивают его на изображение двух колец (кольцевая диафрагма конденсора и фазовая пластинка). Центрировочным устройством конденсора добиваются совмещения колец. Заменив вспомогательный микроскоп окуляром, можно произ­водить исследование препарата.

Люминесцентная микроскопия.

Используется микроскоп люминесцентный МЛ-2, оптическая схема которого отличается от оптической схемы обычного микроскопа источником света ( это может быть ртутная или низковольтная лампы) и наличием двух светофильтров ( синего перед конденсором и желтого в окуляре микроскопа).

Люминесценцией (или флюоресценцией) называют такое явле­ние, когда некоторые вещества под влиянием падающего на них света испускают лучи с другой (обычно большей) длиной волны. Кроме того, вещества, имеющие определенный цвет при обычном освещении, при освещении ультрафиолетовыми лучами приобретают совершенно иной цвет. Объект, не видимый в ультрафиолетовом све­те, может приобрести яркий блеск после обработки его флюоресци­рующим веществом (флюорохромом). В таком препарате люминесцирующие объекты светятся различным цветом в темном поле зрения. Сила их света бывает различной, но чаще всего она невели­ка, поэтому люминесцентную микроскопию следует проводить в за­темненном помещении.

Установка для люминесцентной микроскопии в видимых лучах состоит из яркого источника света и биологического микроскопа. Между зеркалом микроскопа и источником света устанавливается сине-фиолетовый светофильтр (УФС-3, ФС-1 и т. п.). Желтый свето­фильтр (ЖС-3 или ЖС-18) надевают на окуляр микроскопа. С по­мощью этих светофильтров на препарат падает сине-фиолетовый свет, возбуждающий люминесценцию. Однако этот свет мешает видеть возбуждаемое им свечение препарата и поэтому по пути к глазу наблюдателя отсекается желтым светофильтром.

Установку освещения производят по методу Келлера, за одним исключением: диафрагма конденсора должна быть полностью от­крыта. Очень важно применение нефлюоресцирующего иммерсион­ного масла. С целью гашения собственной флюоресценции к кедро­вому или другому иммерсионному маслу добавляют на 1 г от 2 до 10 капель нитробензола.

Используя метод люминесцентной микроскопии можно получить: 1) цветное изображение; 2) высокую степень контрастности само­светящихся объектов на черном фоне; 3) исследовать как прозрачные, так и непрозрачные живые объекты; 4) исследовать различные жизненные процессы в динамике их развития; 5) обнаруживать и устанавливать локализацию отдельных микробов и вирусов; 6) развивать тончайшие методы цито- и гисто­химии и экспрессной цитодиагностика, что выгодно отличает этот метод от других.

Слишком большая длина волны видимого света (600 нм) не позволяет рассматривать в оптическом микроскопе объекты, диаметр которых меньше этой величины.

Разрешающая способность электронных микроскопов составляет 0,2 – 0,4 нм, рабочее увеличение в среднем – 100000 раз. По схеме строения электронный микроскоп аналогичен световому, но освещается объект не лучом света, а потоком электронов от вольфрамовой нити, которая разогревается до 2500 °С.

Электронный поток вызывает све­чение флюоресцирующего экрана. Если же на пути электронов поместить какой-либо объект, то в зависимости от его плотности электроны будут больше или меньше задерживаться, а соответствую­щие места на экране или фотопластинке окажутся более или менее затемненными. Этот простой принцип в современном электронном микроскопе дополнен принципом отклонения электронных лучей в магнитном поле подобно тому, как световые лучи отклоняются стеклянными линзами.

Источником электронного потока служит катодная лампа с вольфрамовой нитью, которая разогревается до 2500°С. Освобож­дающиеся при этом электроны летят в вакууме с большей или меньшей быстротой по направлению к аноду. В этом движении быстроту определяет напряжение, существующее между анодом и катодом. Чем больше напряжение, тем выше разрешающая способ­ность электронного микроскопа. Анод имеет в центре отверстие, через которое электроны летят в направлении к конденсору. Возле катода расположен отрицательно заряженный цилиндр, как бы сужающий пучок электронов, которые, будучи отрицательно заряже­ны, отталкиваются от стенок цилиндра в середину.

Все это устройство в микроскопах большинства систем распо­ложено наверху, и пучок электронов направляется вниз. Объект исследования находится на их пути и отклоняет электронный луч тем сильнее, чем толще и плотнее его структура. При напряжении около 200 000 В, изучая тонкий препарат , можно обнаружить самые нежные структуры, получить увеличение до 200 000 раз и увидеть объекты размером 0,002 мкм.

Путь электронного пучка от объекта до фотографической плас­тинки лежит мимо электрических или магнитных полей, которые, подобно линзам в световом микроскопе, концентрируют и направля­ют электронные лучи. Наконец, после ряда увеличений, которое претерпевает изображение объекта, оно воспринимается на фото­графической пластинке. Все виды фотопластинок чувствительны к электронному лучу. По пути прохождения электронного пучка он дважды может быть перехвачен и отброшен на поверхность экрана-пластинки, покрытой сульфидом цинка, где изображение объекта можно увидеть невооруженным глазом.

В некоторых системах электронных микроскопов имеются до­полнительные приспособления для стереоскопической микроскопии, для наблюдения в темном поле зрения. Различные системы дают разное увеличение — от 1000 до 500000 раз. Установки эти пока еще сложны и требуют квалифицированного обслуживания.

Препарат можно рассматривать как с сухими системами, так и с иммерсионной. Пре­параты быстро высыхают, поэтому если их приходится рассматри­вать не тотчас, а спустя некоторое время, их помещают во влажную камеру (чашку Петри), на дно которой положено 2—3 влажных кружка фильтровальной бумаги, покрытых двумя сухими.

Для висячей капли необходимо иметь предметное стекло с луночкой. С жидкой питательной среды маленькую каплю культуры наносят на тщательно промытое покровное стекло; если же имеется куль­тура на плотной среде, то на покровное стекло предварительно наносят маленькую каплю водопроводной воды или изотонического раствора хлорида натрия, затем петлей прикасаются к культуре и приставшие к ней бактерии размешивают в приготовленной капле. Можно также заранее приготовить взвесь микроорганизмов в изо­тоническом растворе хлорида натрия и взять каплю из нее. В том и в другом случае на покровное стекло накладывают предметное стекло с луночкой посередине, края которой предварительно обмазаны вазелином. Предметное стекло слегка прижимают к по­кровному, в результате чего оба стекла склеиваются. После этого препарат перевертывают покровным стеклом кверху. Получается герметически закрытая камера, в которой капля долго не высыхает. Под микроскопом край капли сначала отыскивают со слабым уве­личением и при суженной диафрагме, а потом исследуют препарат при помощи более сильной сухой системы.

2. Из каких элементов состоит механическая часть микроскопа?

3. Что составляет оптическую систему микроскопа? Какие объективы и окуляры входят в комплект микроскопа?

4. Что входит в состав осветительной системы микроскопа? Правила пользования зеркалом, конденсором и ирисовой диафрагмой.

5. Как правильно установить максимальную освещенность поля зрения?

6.Какие правила применяют при работе со световым микроскопом?

7. В чем особенности устройства и принцип работы темно-польного, фазово-контрастного, люминесцентного, электронного микроскопов ?.

8. От чего зависит четкость изображения, получаемого посредством микроскопа ?