Частота анеуплоидии в культурах мезенхимных стволовых клеток человека 03. 02. 07 Генетика

Частота анеуплоидии в культурах мезенхимных стволовых клеток человека

03.02.07 – Генетика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Медико-генетическом научном центре РАМН

Защита состоится «07» июня 2010г. в 12⁰⁰ часов на заседании Диссертационного совета Д 001.016.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук Медико-генетическом научном центре РАМН по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, д.1.

Автореферат разослан «______»___________________ 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 001.016.01

по защите докторских и кандидатских диссертаций,

доктор медицинских наук, профессор Зинченко Р.А.

Мезенхимные стволовые клети (МСК) в последнее время стали объектом пристального внимания многих исследователей. Наибольший интерес связан с возможностью применения стволовых клеток в медицинских целях. Они по своим характеристикам являются перспективным типом «материала» для клеточной и генно-инженерной терапии (Бочков Н.П. с соавт., 2006; Пальцев М.А. с соавт. 2006; Романов Ю.А., Смирнов В.Н., 2008). При культивировании стволовые клетки способны к продолжительной пролиферации, что дает возможность получать их в необходимом количестве, а также легко индуцировать дифференцировку в остео-, хондро-, мио-, адипогенном и др. направлениях (Егоров В.В. с соавт. 2003; Пальцев М.А. с соавт. 2006; Bruder S. et al. 1997, 1998; Zuk P.A. et al., 2001, 2002; Baksh D. et al. 2004). Для получения стволовых клеток c лечебными целями используются аспираты и образцы жировой ткани и костного мозга.

Однако, взятых из организма стволовых клеток для эффективной терапии недостаточно. Перед клеточной трансплантацией необходимо культивировать клетки.

Культивирование стволовых клеток сопряжено с воздействием на них различных факторов питательных сред и ферментной обработки при пересевах. Описанные в литературе случаи показывают, что длительное культивирование стволовых клеток может вести к серьезным изменениям генома, как на молекулярном, так и хромосомном уровнях его организации: описаны структурные и численные аномалии хромосомного набора клеток (Бочков Н.П. с соавт., 2007; Draper J. et al., 2004; Rubio D. et al., 2005; Imreh M.P. et al., 2006; Krause D., Van Etten R., 2007; Spits C. et al., 2008), амплификация некоторых участков ДНК, метилирование промоторов, эрозия теломер с нарушением активности фермента теломеразы (Егоров Е.Е. с соавт., 2008; Sen S., 2000; Pathak S. et al., 2002; Rubio D. et al., 2005).

Генетические изменения и связанные с ними нарушения экспрессии генов могут вызывать селективную пролиферацию генетически аномальных клеток. Это может привести к манифестации стволовых клеток с онкогенетическими свойствами и, как следствие этого, к малигнизации после их трансплантации.

Вопрос об онкогенной безопасности и генетической изменчивости стволовых клеток остается мало изученным, но крайне важным и, по сути дела, определяющим дальнейшее развитие клеточной терапии.

На этом основании многие исследователи полагают, что практическое применение МСК в терапевтических целях пока преждевременно, и ему должно предшествовать более детальное изучение биологии стволовых клеток (Бочков Н.П. с соавт., 2007; Rubio D. et al., 2005). Применение клеток вообще, и в частности МСК, для терапевтических целей должно определяться данными по их безопасности для пациента, в том числе онкогенной (Бочков Н.П. с соавт., 2008; Duersberg P., Li R., 2003; Rubio D. et al., 2005). Многие вопросы размножения взрослых МСК хорошо изучены. Стали более понятными механизмы дифференцировки стволовых клеток, представления о генетической стабильности МСК в ходе культивирования. Однако, имеющиеся в литературе данные противоречивы, что объясняется разрозненностью методов изучения генетической изменчивости культивируемых МСК, незначительными выборками исследованных культур. Например, о хромосомной изменчивости, структурных нарушениях, численных аномалиях хромосом, являющихся постоянным спутником злокачественного роста, недостаточно судить на основе кариотипического анализа небольшого числа клеток, который выявляет структурные нарушения хромосом, но не позволяет оценивать численные отклонения в хромосомном наборе клеток.

Для оценки генетической изменчивости МСК, должны применяться не только стандартное кариотипирование, но и другие современные информативные методы молекулярной цитогенетики, в частности, исследование анеуплоидии в интерфазных клетках с помощью FISH анализа.

В соответствии с целью исследования поставлены следующие задачи:

1. 
   Изучить частоту анеуплоидных клеток в МСК из жировой ткани, культивируемых на ранних (2-5) пассажах (9-15) и поздних пассажах.
   
2. 
   Изучить частоту численных нарушений хромосомного набора МСК из костного мозга на разных сроках культивирования (2-12 пассажи).
   
3. 
   На основании полученных экспериментальных данных оценить параметры изменчивости по отдельным хромосомам и оценить механизмы, лежащие в основе происхождения разных вариантов анеуплоидии.
   

Впервые данные, полученные по 4-м хромосомам (6, 8, 11 и Х), позволили оценить частоту анеуплоидии на 1 хромосому и рассчитать её в целом на хромосомный набор в культивируемых МСК из жировой ткани и костного мозга.

Показано, что в культурах МСК из разных источников происхождения на ранних и поздних пассажах общая частота спонтанной анеуплоидии существенно не различается, что свидетельствует о достигнутом равновесии между частотой возникновения анеуплоидных клеток и их элиминацией.

В результате проведенного исследования установлено, что на фоне высокой спонтанной частоты анеуплоидии в некоторых культурах может происходить селективное формирование клеточной популяции с однотипной хромосомной аномалией, обладающей преимуществом в размножении, что имеет определенное значение в оценке возможной онкогенности клонообразующих культур МСК.

1. 
   Для культивируемых МСК как из жировой ткани, так из костного мозга характерна высокая частота спонтанной анеуплоидии, находящаяся в пределах 1-1,5% на одну хромосому. Этот показатель спонтанной частоты моносомии и трисомии характерен для культур МСК на ранних и поздних сроках культивирования.
   
2. 
   На поздних сроках культивирования обнаруживается формирование клеточных популяций с однотипной хромосомной аномалией, имеющих селективное преимущество в размножении.
   
3. 
   В большинстве культур МСК частота моносомии значимо выше трисомии, следовательно, кроме механизма нерасхождения хромосом, являющегося общим для обоих типов анеуплоидии, в происхождении моносомии дополнительно существенную роль играет механизм отставания хромосом в митозе.
   
4. 
   Полученные результаты демонстрируют значение молекулярно-цитогенетического метода в объективной оценке геномной изменчивости МСК и в выявлении культур с клонообразующими клеточными популяциями.
   

Материалы диссертационной работы доложены на V конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2008 год); Стендовый доклад на пятом съезде ВОГИС (Москва, 2009); Основные положения доложены на заседании кафедры медицинской генетики ММА им. И.М. Сеченова (Москва, 2009); Работа апробирована и рекомендована к защите на заседании Ученого совета МГНЦ РАМН 3 марта 2010 года.

Автором подобрана и проработана отечественная и зарубежная литература по теме диссертации. Все эксперименты и непосредственный их анализ выполнен ею лично. Разработка протоколов исследования проведена при активном участии автора. Описание собственных исследований, обработка и обсуждение результатов, формулировка выводов и подготовка статей к публикации выполнены автором самостоятельно.

Результаты диссертационной работы отражены в 8-ми печатных работах: 2-х статях и 6-х тезисах. Две статьи опубликованы в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ соискателям учёной степени кандидата медицинских наук.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования и их обсуждения, выводов и списка литературы. Текст изложен на 96 стр. машинописного текста, иллюстрирован 19 таблицами и 2 рисунками. Библиографический указатель включает 131 источник отечественной и зарубежной литературы.

Пробы жировой ткани и костного мозга были получены из лаборатории ЗАО «Реметэкс» и ГУЗ «Банка стволовых клеток департамента здравоохранения г. Москвы».

Пробы жировой ткани получены от 13-ти доноров (12 женщин, 1 мужчины). Забор проб проводился в стационарных условиях, в ходе косметической липосакции или абдоминопластики.

Пробы костного мозга получены от 16-ти доноров (3-х женщин, 13-ти мужчин). Забор проб проводился в операционных условиях путем пункции гребня подвздошной кости.

Далее культуры инкубировали при 37°С в атмосфере 5% СО₂ до достижения 70%-90% конфлюентности, затем клетки снимали раствором трипсина и рассевали в новую посуду с плотностью 1500-2000 клеток\см².

По мере роста клеток отбирали чашки с культурами, в которых, при фазовоконтрастном микроскопировании, отмечали преимущественный рост мелких мезенхимных клеток.

Культивирование клеток костного мозга. Костный мозг в количестве 10-15 мл, разбавляли в 4 раза физраствором, забуферным фосфатами (ФСБ) с Li-гепарином, и выделяли фракцию моноядерных клеток центрифугированием в течение 25 мин. при 650g. в градиенте Фиколла по методу Strauer B. et al. (2001).

Основной средой для культивирования была среда DMEM с низким содержанием глюкозы, эмбриональной телячьей сыворотки, аминокислот и антибиотиков. Концентрация моноядерных клеток для посева составляла около 1 млн./см².

Клетки инкубировали в течение 34-48 часов в СО² инкубаторе при 37⁰С, после чего производили смену среды. Оставшиеся прикрепленные клетки оставляли для доращивания, до достижения 75-85% конфлюентности.

В дальнейшем смену среды проводили каждые 2-3 суток, в зависимости от результатов ежедневных осмотров состояния культур. При образовании колоний анализировали динамику их роста, клеточную морфологию.

Как и в жировой ткани, выявлялись три типа клеток: первый - маленькие веретенообразные клетки, второй – округлые и большего размера, чем первый, третий – клетки крупных размеров, фибробластоподобные.

Иммуноцитохимическое исследование культур МСК жировой ткани и костного мозга проведено в ЗАО «Реметэкс» и ГУЗ «Банком стволовых клеток департамента здравоохранения г. Москвы».

Клетки снимали со стенки флакона с помощью раствора версена (1 мин), а затем – 0,25% раствора трипсина (3-7 мин. при 37ºС). Далее добавляли среду DMEM (5 мл.), переливали полученную суспензию клеток в центрифужные пробирки. После центрифугирования надосадочную жидкость сливали. Гипотонизацию проводили 0,55% раствором KCl (10 мин. при 37ºС), перед центрифугированием добавляли 3-5 капель фиксатора для остановки гипотонизации. Фиксацию проводили смесью метилового спирта и ледяной уксусной кислоты (в соотношении 3:1) стандартным способом, с использованием 3-х смен фиксатора.

Перед раскапыванием клеточной суспензии на предметные стекла фиксатор меняли еще раз. На охлажденное стекло наносили 3-5 капель клеточной суспензии, а затем 2-3 капли фиксатора или ледяной уксусной кислоты, помещали стекло в подогретую влажную камеру или держали над водяной баней (60-70°С) 10-20 секунд, затем подсушивали над пламенем горелки или на твердотельной плитке при температуре 55-65°С, что улучшало качество препарата, необходимое для проведения FISH-анализа. Качества препарата оценивали с помощью метода фазового контрастного микроскопирования.

Анализ частоты анеуплоидии. В анализ включались интерфазные, хорошо распластанные с неповрежденной мембраной ядра, без наложений.

Для проведения интерфазного FISH-анализа использовали зонды фирмы Vysis, Inc. (CEP6 (D6Z1), CEP8 (D8Z1) альфа-сателлитной ДНК для хромосом 6, 8, 11 и Х (рис. 1). Денатурацию препаратов проводили с 70% формамидом при 73°С в течение трех минут, гибридизацию - в течение ночи при 37°С. На следующий день препараты отмывали в растворе 0,4×SSC при температуре 70°С в водяной бане. Для контрастной окраски ядер использовали краситель DAPI.

FISH-препараты анализировали под микроскопом AxioImager с комплектом интерференционных фильтров (Zeiss) с помощью программного обеспечения для FISH-анализа (Fish View System, Applied Spectral Imaging GmbH).

От каждой культуры после реакции гибридизации исследовали в среднем по 1000 интерфазных ядер. Всего от каждой культуры клеток разных индивидов было исследовано более 97 тысяч ядер.

Статистическая обработка полученных данных проведена с использованием программы Exel Microsoft Office (“Microsoft”), Statistica 6, Statictica 8. Уровень значимости p>0,05 был принят достаточным для признания различий достоверными.

а) Дисомия по хромосомам 6 и 8	б) Моносомия по 8 хромосоме
г) Трисомия по 6 хромосоме	е) Тетрасомия (тетраплоидия) по хромосомам 6 и 8

Рисунок 1. Варианты интерфазных ядер, после реакции гибридизации

На ранних (2-5) пассажах изучены численные нарушения хромосомного набора культивируемых МСК жировой ткани по хромосомам 6, 8, 11 и Х в 13 культурах.

Обобщенные данные FISH анализа культур МСК жировой ткани на ранних пассажах, представлены в табл. 1.

По табл. 1 видно, что колебание общего показателя доли анеуплоидных (моносомных и трисомных) клеток по 4 хромосомам находятся в пределах от 1,0% до 2,5%.

Таблица 1

Геномная изменчивость в МСК жировой ткани на ранних пассажах

Хотя разница показателей частоты анеуплоидии между изученными культурами значительна, статистически достоверных различий средних частот между хромосомами не выявлено (р>0,05).

Показатель частоты тетрасомии по изученным хромосомам оказался одинаковым - 0,6%. При этом, во всех культурах имело место полное совпадение на одном и том же препарате показателей частоты по двум изучаемым хромосомам. На основании этих данных правомочно говорить не о тетрасомии, а о полиплоидном состоянии хромосомного набора.

Результаты исследования численных аномалий хромосомного набора на ранних сроках культивирования МСК (2-ой-5-ый пассажи) показали, что в клетках имеет место геномная нестабильность, приводящая к появлению анеуплоидных и полиплоидных клеток. Результаты анализа культур МСК жировой ткани на ранних пассажах по четырем хромосомам позволяют подойти к оценке общей частоты анеуплоидии, включающей моносомию и трисомию. В настоящем исследовании тестировались 4 хромосомы, по которым суммарная частота анеуплоидии составила 6,5%. Соответственно, на одну хромосому частота моносомии и трисомии составила 1,6%, а на геном в целом – 37,4%.

На поздних пассажах (9-15 пассажи) исследовано 8 культур. Все эти культуры были исследованы на ранних пассажах.

Данные изучения анеуплоидии в МСК жировой ткани на поздних пассажах представлены в табл. 2.

Таблица 2

Геномная изменчивость в МСК жировой ткани на поздних пассажах

Из представленных в табл. 2 данных видно, что показатели общей частоты анеуплоидии по 4-м хромосомам подвержены существенным колебаниям - от 0,6% (хромосома 11) до 2,3% (хромосома 8).

По хромосоме 11 и Х частота анеуплоидных клеток была более низкой, чем по хромосомам 6 и 8, а в большинстве культур имела место тенденция к понижению по сравнению с ранними пассажами.

Хотя колебания показателей частоты анеуплоидии между изученными культурами значительны, статистических достоверных различий средних частот между хромосомами не выявлено (р>0,05).

Расчеты показали, что суммарная частота моносомии и трисомии на одну хромосому составила 1,3%, а на весь геном - 29,3%.

Частота тетрасомии по изученным хромосомам находилась в пределах от 0,2% до 0,9%, и её средний показатель на геном составил 0,5%. Результаты 2-х-цветного FISH-анализа по всем препаратам позволяют говорить не о тетрасомном, а о полиплоидном состоянии хромосомного набора.

Анализ данных, представленных в табл. 1 и 2, показывает, что при сравнении ранних и поздних пассажей показатели уровня анеуплоидии на весь геном 37,4% и 29,3%, соответственно, находятся в статистически незначимых различиях. Сходство частоты анеуплоидии на ранних и поздних пассажах МСК из жировой ткани свидетельствует о том, что в ходе культивирования с высокой интенсивностью, кроме появления анеуплоидных клеток, происходит их элиминация в ряду клеточных делений. Так как большинство культур исследовано на 3-ем и 5-ом пассажах, можно предположить, что интенсивность анеугенеза и давление отбора против анеуплоидных клеток уравнивается уже на ранних пассажах, сохраняя эти показатели и на более поздних сроках культивирования – на 9-14 пассажах.

Аналогичное исследование проведено при анализе МСК костного мозга на ранних и на поздних пассажах, с использованием ДНК-зондов на хромосомы 6, 8, 11 и Х.

Результаты геномной изменчивости МСК костного мозга на ранних (3-5) и поздних (10-12) пассажах представлены в табл. 3 и 4.

Из табл. 3 видно, что показатель общей частоты анеуплоидных клеток на ранних пассажах по изученным аутосомам находился в пределах 1,2% -1,3%. Анеуплоидия по Х-хромосоме изучена в 13 культурах МСК мужского пола и в 7 культурах женского пола. В МСК мужского пола учитывали нулисомные, дисомные и трисомные клетки. Общий показатель нарушений по Х-хромосоме составил 1%, в подавляющей части за счет дисомии (т.е. ХХУ кариотипа).

Таблица 3

Геномная изменчивость в МСК костного мозга на ранних пассажах

С учетом полученных данных оценено, что показатель анеуплоидии на одну хромосому составил 1,3%, а на весь геном - 27,6%.

Таблица 4

Геномная изменчивость в МСК костного мозга на поздних пассажах

Средняя суммарная частота анеуплоидии МСК костного мозга на поздних пассажах изученных аутосом находилась в статистически неразличающихся пределах - от 0,9% до 1,2%.

По Х-хромосоме данные получены по 6 культурам МСК мужского пола, среди которых выявлены клетки с дисомией с частотой 1,6%.

Соответственно приведенным данным видно, что общий показатель анеуплоидии на поздних пассажах составил на одну хромосому - 1,2%, а на геном - 27,6%.

Показатели частоты тетрасомии (полиплоидии) по изучаемым хромосомам в МСК костного мозга на ранних и поздних пассажах были в пределах 0,3%-0,4% - на ранних пассажах и 0,6%-1,1% на поздних.

Из представленных данных видно, что геномная изменчивость в МСК костного мозга оказалась одинаковой на ранних и поздних пассажах.

Эти данные совпадают с результатами изучения МСК из жировой ткани, что подтверждает сходство происходящих процессов при культивировании МСК разных тканей.

Таким образом, значения показателей анеуплоидии в МСК жировой ткани и МСК костного мозга находятся в одних и тех же пределах. Из этого можно сделать вывод, что источник (жировая ткань или костный мозг) стволовых клеток с точки зрения интенсивности геномной изменчивости значения не имеет.

О структуре геномной изменчивости можно судить по данным, представленным в табл. 5.

Таблица 5

Структура геномной изменчивости МСК

Жировая ткань			Костный мозг
Ранний пассаж
Хромосома	Доля моносомии, %	Доля трисомии, %	Доля моносомии, %	Доля трисомии, %
6	1,5	0,4	0,8	0,4
8	2,1	0,4	1,0	0,3
11	1,0	0,1	1,0	0,3
Х	0,8	0,2	0,1	0,9
Поздний пассаж
6	1,1	0,3	0,6	0,5
8	1,5	0,8	0,7	0,2
11	0,4	0,2	1,0	0,3
Х	0,6	0,2

Исходя из представленных в табл. 5 данных по структуре геномной изменчивости в МСК изученных тканей, видно, что доля моносомных клеток во всех культурах существенно превосходит долю трисомных клеток.

Разница средних частот моносомии и трисомии по отдельным хромосомам статистически не достоверна (p>0,05).

Однако, сравнение частот двух типов анеуплоидных клеток - моносомных и трисомных - показало, что имеются достоверные различия между ними (р<0,01).Частота моносомных клеток выше трисомных.

Это ожидаемый результат, так как кроме механизма нерасхождения хромосом, общего для обоих видов анеуплоидии, в происхождении моносомии дополнительно лежит механизм отставания хромосом при клеточном делении, который, судя по представленным данным, занимает весьма существенное значение.

В изученных нами культурах МСК из жировой ткани не наблюдалось существенных различий между частотой числовых нарушений по отдельным хромосомам. Этот факт не дает оснований полагать, что определенные хромосомы, различающиеся по длине и расположению центромеры, предпочтительнее вовлекаются в процессы анеугенеза. Следовательно, выявляемая в культивируемых клетках анеуплоидия является результатом случайного вовлечения хромосом в механизмы процесса нерасхождения или отставания.

Это положение имеет и теоретическое обоснование, так как, исходя из механики движения хромосом в анафазе, их распределение по дочерним клеткам не зависит от длины, а связано с взаимодействием микротрубочек веретена с кинетохором (Wuttke K. et al. 1997).

Полученные результаты по изучению культур МСК разных тканей выявили большой «объём» геномной изменчивости, что можно трактовать как свойство культивируемых стволовых клеток.

На поздних пассажах, наряду с выявлением спонтанной анеуплоидии, обнаружен и другой, более существенный факт генетической изменчивости МСК: на фоне высокой спонтанной нестабильности генома может происходить селективная пролиферация клеток с однотипной хромосомной аномалией.

В табл. 6 и 7 обобщены данные по четырем культурам МСК из жировой ткани, в которых частота анеуплоидии значительно превышала 95% доверительный интервал.

Таблица 6

Частота анеуплоидных клеток в отдельных культурах МСК на поздних пассажах, в которых наблюдается высокий уровень мозаицизма, который можно принять за клонообразование

Статистически доказано, что моносомия по хромосоме 6 в культуре №1 (19,9%), №3 (21,2%) и №4 (5,6%) является неслучайным событием. Высокие показатели анеуплоидии в этих трех культурах свидетельствуют о том, что в культурах №1 и №3 уже на ранних пассажах, видимо, произошло селективное размножение клеток с моносомией по хромосоме 6, с образованием колоний, имевших в несколько раз большую скорость клеточного деления.

Что касается культуры №2 (табл.6) , в которой частота моносомии по хромосоме 8 составила 4,4,%, статистически обосновать клонообразование не удалось (p=0,07%), вероятно, из-за недостаточной выборки проанализированных клеток и сравнительно высокой частоты моносомии на ранних пассажах. Так или иначе, данные по этой культуре должны скорее настораживать и относить такие культуры с потенциальными свойствами к клонообразованию.

Если вопрос о мозаичности (клональном характере) культур № 1, № 3 и №4 не вызывает сомнений, то возникает вопрос – при какой частоте анеуплоидных клеток культуры можно относить к мозаичным с наличием клонов? Сложность ответа на этот вопрос заключается в пока неизученных закономерностях динамики клеточных популяций, в которых появляются аномальные клетки, а также в технических особенностях пересева культур. Вполне очевидно, в решении этих вопросов требуются соответствующие статистические обоснования, а так же разработка методического подхода к анализу клонообразования, аналогичному мозаицизму в клинической цитогенетике (Кулешов Н.П., 1978).

Таблица 7

Характеристика клонов в культурах МСК

Рисунок 2. Показатели трисомии хромосомы 8 в МСК костного мозга

на разных пассажах.
На 2-м пассаже частота трисомных клеток хромосомы 8 составила 23,4% , на 6-ом пассаже - 34,3%, а на 12-ом пассаже - 16,1%. То, что к 6-му пассажу частота трисомии возросла вполне объяснимо: трисомная популяция клеток имела преимущественную селективную пролиферацию, возможно, за счет ускоренного деления клеток. Возникает вопрос при анализе культуры на 12-м пассаже, почему в ней обнаружено лишь 16,1% трисомных клеток. Вместо ожидаемого увеличения трисомных клеток (если это клонообразование) имеет место существенное снижение их частоты. Объяснение этому факту однозначно дать трудно, так как это может быть связано с каким-то отклонением в пересеве клеток, в методических отклонениях при отборе клеток для FISH-анализа, или же это редкий случай, когда под действием каких-то факторов (культуральных, клеточных и др.) подавляется пролиферация аномальных клеток, достигших предельной частоты.

Безусловно, данная культура требует дальнейшего изучения с привлечением разных клеточно - культуральных технологий.

Пример трисомии хромосомы 8 демонстрирует, что динамика доли анеуплоидных клеток может идти в сторону увеличения и понижения и зависит от количества пассажей.

Таким образом, из характеристики клонов видно, что они могут возникать на ранних и на поздних пассажах, но сравнить их из-за недостаточного количества данных не представляется возможным.

1. 
   Частота анеуплоидии в МСК из жировой ткани по разным хромосомам (6, 8, 11 и Х) на ранних и поздних пассажах одинаковая (37,7%, 29,3%, соответственно). Общий показатель частоты анеуплоидии на одну хромосому составляет 1,2%.
   
2. 
   Частота анеуплоидных клеток в МСК из костного мозга по разным хромосомам (6, 8, 11, Х) на ранних и на поздних пассажах не различается. Общий показатель частоты анеуплоидии на одну хромосому составляет на ранних пассажах 1,6%, на поздних пассажах 1,3%.
   
3. 
   Расчетная частота анеуплоидии МСК жировой ткани на весь геном составляет на ранних пассажах 37,4%, на поздних пассажах 29,3%, в МСК костного мозга 27,6% на ранних и поздних пассажах.
   
4. 
   Полученные данные о сходных величинах анеуплоидии на ранних и поздних пассажах свидетельствует о равновесии между частотой возникновения de novo анеуплоидных клеток и их элиминацией.
   
5. 
   Доля моносомных клеток во всех культурах существенно превышает долю трисомных клеток. Следовательно, кроме механизма нерасхождения хромосом, общего для обоих типов анеуплоидии, в происхождении моносомии дополнительно лежит механизм отставания хромосом при клеточном делении.
   
6. 
   В изученных культурах МСК выявлено формирование клеточных популяций с однотипным аномальным кариотипом, обладающих селективным преимуществом в размножении.
   
7. 
   Полученные данные о высоком уровне анеуплоидии и о возможном клонообразовании при культивировании МСК указывают на необходимость проведения тщательного генетического мониторинга МСК в случае использования их для целей клеточной терапии.
   

1. 
   Бочков Н.П., Гольдштейн Д.В., Ржанинова А.А., Никитина В.А., Воронина Е.С., Буяновская О.А. /Оценка генетической безопасности клеточной терапии //Сборник тезисов Ежегодной Всероссийской и международной научной конференции «Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении» - г. Москва. – 2007г. – С. 89-90.
   
2. 
   Nikitina V.A., Buyanovskaya O.A., Voronina E.S., Kosyakova N.V. /The frequency of aneuploidy in human multipotent mesenhimal stromal cells // Materials of the 37th Annual Meeting of the European Environmental Mutagen Society. – Basel, Switzerland, September 9-13. – 2007г. – P. 147.
   
3. 
   Никитина В.А., Косякова Н.В., Буяновская О.А., Бочков Н.П. Анеуплоидия в стволовых клетках человека//Генетика человека и патология – г. Томск: Из-во: «Печатная мануфактура». – 2007г. – вып.8. – С. 246.
   
4. 
   Буяновская О.А., Никитина В.А. /Характеристика анеуплоидии в стволовых клетках человека //Сборник тезисов V Конференция молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» Вестн. РАМН, приложение - г. Москва. – 2008г. – №6. – С. 77-78.
   
5. 
   Бочков Н.П., Кулешов Н.П., Никитина В.А., Буяновская О.А., Катосова Л.Д. /Анеуплоидия в стволовых клетках, выделенных из жировой ткани человека //Бюллетень экспериментальной биологии и медицины – г. Москва. – 2008г. – Т. 146, №9. – С. 320-323.
   
6. 
   Буяновская О.А., Кулешов Н.П., Никитина В.А., Воронина Е.С., Катосова Л.Д., Бочков Н.П. /Спонтанная анеуплоидия и клонообразование в стволовых клетках человека при разных сроках культивирования. // Клеточные технологии в биологии и медицине - г. Москва. – 2009г., № 3. –С. 123-127.
   
7. 
   Бочков Н.П., Никитина В.А., Буяновская О.А., Кулешов Н.П. Спонтанная анеуплоидия и клонообразование при культивировании стволовых клеток / Сборник тезисов. Пятый съезд ВОГИС II часть - г. Москва – 2009г. - С. 257.
   
8. 
   Буяновская О.А., Никитина В.А. /Тезисы к 40-летию МГНЦ РАМН Медико-генетический научный центр РАМН «Численные аномалии хромосомного набора в культивируемых МСК». // Медицинская генетика - г. Москва – 2010г., №12 - С. 34.